李金紅，董 爽,2，李偉涵，張麗霞，陸曉春

（1.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱研究所，沈陽 110161；2.沈陽大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，沈陽 110003；3.沈陽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，沈陽 110034）

高粱（Sorghum bicolor）是我國(guó)主要的旱糧和谷類作物之一，其產(chǎn)量關(guān)系到食用[1-2]、釀酒[3]、畜牧飼料[4]和生物乙醇[5]等產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。近年來，我國(guó)可利用的耕地面積逐年減少，但國(guó)家發(fā)展對(duì)高粱的需求卻越來越高。因此在有限的耕地面積上，提高單位面積的產(chǎn)量進(jìn)而增加總產(chǎn)量是一條可持續(xù)發(fā)展的路徑。因此通過培育具有合理株型的新品種來增加種植密度、提高總產(chǎn)量，已經(jīng)成為育種家越來越重要的育種目標(biāo)。葉夾角是理想株型的重要直觀形態(tài)指標(biāo)之一，同時(shí)也是考慮優(yōu)良作物品種能否密植的重要農(nóng)藝性狀之一，其是指葉片與主莖的夾角。合理的葉夾角能夠在高密度種植條件下，把所接受的光能合理地分配到群體內(nèi)各葉層，使群體內(nèi)的透光率維持在較高的水平，從而滿足葉片光合作用對(duì)光能的需求[6]。

前人開展對(duì)葉夾角的形成、發(fā)育及調(diào)控葉夾角發(fā)育的基因克隆的相關(guān)研究工作，WANG等[7]通過對(duì)水稻“中花11”倒2葉葉枕的不同發(fā)育時(shí)期進(jìn)行組織切片分析，結(jié)果表明水稻葉夾角的大小是由于近軸端與遠(yuǎn)軸端細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的發(fā)育不平衡引起的；MORENO等[8-12]通過對(duì)玉米Liguleless 1（lg1）和Liguleless 2（lg2）突變體研究發(fā)現(xiàn)lg1和lg2基因缺失，均會(huì)造成葉耳、葉舌缺失，葉枕發(fā)育異常，lg1和lg2分別編碼SPL(SQUAMOSA promoter-binding protein-like)蛋白和堿性亮氨酸拉鏈蛋白（bZIP），lg2表達(dá)早于lg1,二者共同調(diào)控幼葉原基葉舌的發(fā)育，進(jìn)而影響葉夾角的大小。TIAN等[13]克隆玉米UPA1和UPA2基因，并且發(fā)現(xiàn)玉米野生種中的UPA2等位基因與葉片發(fā)育基因DRL1具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，DRL1與lg1互作并抑制lg1對(duì)ZmRAVL1的激活作用，導(dǎo)致下游基因brd1的表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖，最終導(dǎo)致葉夾角減小，株型趨緊湊。水稻dl突變體表現(xiàn)為植株矮小、葉夾角變小，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)dl1編碼細(xì)胞色素P450,通過催化6-脫氧香蒲甾醇（6-Deoxo TY）和香蒲甾醇（TY）合成影響葉片的開張角度，DIAO等[14]在谷子中發(fā)現(xiàn)DROOPY LEAF1（DPY1），一種LRR受體樣激酶，對(duì)功能喪失突變DPY1研究發(fā)現(xiàn)，該突變體葉片中的木質(zhì)素含量低，該基因特異性在葉片的維管束中表達(dá)。該基因通過BR信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控葉片下垂。

本試驗(yàn)利用EMS誘變高粱BTX623獲得一個(gè)葉夾角變小的突變體（LA1），對(duì)該突變體從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、遺傳特性和基因定位等方面進(jìn)行研究，最終將該基因定位在標(biāo)記z1s11e1～z1s11e14，研究結(jié)果將為進(jìn)一步克隆突變基因和解析高粱葉夾角形成的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

LA1突變體是由高粱自交系BTX623經(jīng)0.1%EMS誘變的后代，2015年種植于遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科學(xué)研究試驗(yàn)基地，M1單株單穗留種，2016年將M2株系種植后發(fā)現(xiàn)1株系表現(xiàn)為葉夾角變小和葉片變窄。該株系經(jīng)2017~2019年連續(xù)自交，突變性狀已穩(wěn)定遺傳，命名為L(zhǎng)A1。利用突變體LA1分別與野生型BTX623和葉夾角較大的自交系TX430進(jìn)行雜交，獲得F1后自交得到2個(gè)F2分離群體，用于突變性狀的遺傳分析和基因定位。

1.2 方法

1.2.1 農(nóng)藝學(xué)性狀的調(diào)查抽穗開花期隨機(jī)選取野生型植株和突變體植株各10株，調(diào)查倒1節(jié)至倒8節(jié)不同節(jié)位的葉片長(zhǎng)、葉片寬、葉夾角、葉枕長(zhǎng)、葉耳周長(zhǎng)、株高、一級(jí)枝梗數(shù)、千粒重、每穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、粒長(zhǎng)、粒寬等農(nóng)藝學(xué)性狀。

1.2.2 細(xì)胞學(xué)觀察隨機(jī)選取孕穗期突變體植株和野生型植株各10株，分別取倒4葉的葉耳，于FAA固定液（50%乙醇∶0.9mol·L-1冰乙酸∶甲醛=90∶5∶5）固定，經(jīng)乙醇脫水、浸蠟、二甲苯透明、石蠟包埋、切片、脫水和番紅固綠染色后，置于NIKON E6000顯微鏡下觀察拍照。

1.2.3 LA1突變基因定位利用重測(cè)序BSA（bulked segregate）方法對(duì)突變基因進(jìn)行初定位。在（LA1×TX430）獲得F2分離群體中分別選取50株野生表型和突變表型的葉片，提取基因組DNA，等量混合構(gòu)建2個(gè)混池，對(duì)片段化的DNA進(jìn)行片段純化、末端修復(fù)、3'端加A、連接測(cè)序接頭，再用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇，進(jìn)行PCR擴(kuò)增形成測(cè)序文庫，建好的文庫先進(jìn)行文庫質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫用Illumina平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，對(duì)突變基因進(jìn)行初定位。根據(jù)初定位結(jié)果，以BTX623為參考基因組，找出差異序列后設(shè)計(jì)SSR和InDel標(biāo)記引物，在目標(biāo)區(qū)間繼續(xù)篩選和加密分子標(biāo)記，進(jìn)行目標(biāo)基因的精細(xì)定位。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2010和SPSS 10.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體植株LA1和野生型植株的表型分析和細(xì)胞學(xué)觀察

在幼苗期突變體植株與野生型植株均未出現(xiàn)明顯差異，隨著植株的生長(zhǎng)，在拔節(jié)期突變體開始出現(xiàn)葉片變窄變短，葉耳變?。▓D1a和圖1b），葉夾角變小，此時(shí)對(duì)葉耳進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)：與野生型植株相比，突變體葉耳細(xì)胞明顯增大，細(xì)胞層數(shù)明顯減少（圖1c），因此推測(cè)突變體LA1的葉夾角的變化是由于葉耳部位細(xì)胞層數(shù)和細(xì)胞大小的變化引起的。

在成熟期與野生型相比，LA1突變體各部位葉片呈現(xiàn)較小的葉夾角（圖1d、圖1e和圖1f）,葉耳周長(zhǎng)和葉長(zhǎng)均小于野生型葉耳周長(zhǎng)和葉長(zhǎng)（圖1g和圖1h），同時(shí)穗長(zhǎng)也小于野生型穗長(zhǎng)（圖1i）。農(nóng)藝學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，突變體的株高、粒長(zhǎng)、粒寬、千粒重、結(jié)實(shí)率與野生型均沒有差異，但突變體的每穗粒數(shù)極顯著低于野生型的每穗粒數(shù)，一級(jí)枝梗數(shù)顯著低于野生型的一級(jí)枝梗數(shù)（表1）。

表1 野生型WT和葉夾角突變體LA1農(nóng)藝學(xué)性狀比較Table 1 Comparison of agronomic trait between wild type WT and mutant LA1

圖1 野生型植株(WT)和突變體植株(LA1)的形態(tài)表現(xiàn)Figure 1 Morphological traits of the wild type(WT)and its mutant(LA1)

2.2 突變體LA1葉夾角及與葉夾角相關(guān)的性狀分析

由圖2可知，抽穗開花期，與野生型植株相比，突變體LA1植株的倒1葉至倒8葉的葉長(zhǎng)和葉寬差異均極顯著，且突變體的倒1葉葉長(zhǎng)和葉寬分別下降35%和30%。野生型植株和突變體植株的葉夾角均呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢(shì)，突變體LA1植株各節(jié)位葉夾角均極顯著低于野生型植株相應(yīng)各葉片葉夾角，其中倒3葉下降的更明顯，下降了49%。野生型植株和突變體植株各節(jié)位葉枕長(zhǎng)（倒1葉除外）、葉耳周長(zhǎng)的變化與葉夾角變化呈相反的趨勢(shì)，即葉枕長(zhǎng)和葉耳周長(zhǎng)表現(xiàn)為先升高后降低。與野生型相比，LA1突變體植株倒4和倒5葉片葉枕長(zhǎng)均顯著低于野生型植株相應(yīng)節(jié)位的葉枕長(zhǎng)，其他節(jié)位葉枕長(zhǎng)差異不顯著；各節(jié)位葉耳周長(zhǎng)均極顯著低于野生型植株的各節(jié)位葉耳周長(zhǎng)。這說明該突變體植株的葉夾角大小與葉枕、葉耳呈負(fù)相關(guān)，且葉夾角大小的性狀主要與葉耳周長(zhǎng)有關(guān)。

圖2 抽穗開花期突變體植株和野生型植株田間表型調(diào)查Figure 2 Field phenotype of the mutant and wild type in heading and flower period

2.3 突變體LA1的遺傳模式分析

依據(jù)葉夾角的大小作為突變表型的判斷依據(jù)，將LA1突變體植株與野生型植株正反交得到F1（均為野生型表型），F(xiàn)1自交獲得正反交2個(gè)F2分離群體（表2），其中LA1×WT的F2分離群體共1391株，野生表型1024株、突變表型為367株，分離比例經(jīng)卡方檢驗(yàn)符合3∶1分離；WT×LA1 F2分離群體共1519株，野生表型1127株、突變表型為392株，分離比例同樣符合3∶1，推測(cè)該突變性狀受1對(duì)隱性核基因控制。

表2 高粱葉夾角在2個(gè)F2群體中分離比例的卡方測(cè)驗(yàn)Table 2 Chi-sequare test of segregation ration of leaf angle in two F2 populations

2.4 基因定位

為了定位LA1突變基因，首先在LA1突變體與TX430的F2群體中分別選取突變型植株和野生型植株50株，提取基因組DNA，分別等量混合成正?；虺睾屯蛔兓虺亍＝Y(jié)合親本信息，計(jì)算△SNP-index，并對(duì)△SNP-index進(jìn)行擬合，按照擬合后的△SNP-index計(jì)算機(jī)模擬實(shí)驗(yàn)，取置信度99%的閾值（圖3），初步將LA1突變基因定位1號(hào)染色體的7.3Mb范圍內(nèi)(圖4a)。

圖3 SNP-index關(guān)聯(lián)值在染色體上的分布Figure 3 Distribution of SNP-index correlation values on chromosomes

利用高粱基因注釋網(wǎng)站（http://plants.ensembl.org/Sorghum_bicolor/Info/Index）的BTX623的基因組序列比對(duì)信息，在初定位區(qū)間新開發(fā)了S1-22、S1-32、S1-40、S1-54、S1-68、S1-97和S1-132標(biāo)記，利用這7個(gè)標(biāo)記對(duì)F2分離群體的759個(gè)突變單株進(jìn)行基因型分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這7個(gè)標(biāo)記的交換單株分別為73，57，45，26，14，54和91株，初步將該基因定位在S1-54和S1-68之間，物理距離為960kb（圖4b）。

為了進(jìn)一步精細(xì)定位，在S1-54和S1-68之間設(shè)計(jì)了11對(duì)SSR和indel標(biāo)記，其中有5對(duì)表現(xiàn)為多態(tài)性。利用5個(gè)多態(tài)性標(biāo)記對(duì)40個(gè)隱性單株進(jìn)行連鎖分析，最終將LA1基因定位在z1s11e1～z1s11e14，根據(jù)已經(jīng)公布的BTX623參考基因組序列，兩者的物理距離為70kb(圖4c)，該定位區(qū)間內(nèi)共有12個(gè)注釋基因(圖4d)，目前正在對(duì)該區(qū)間內(nèi)的候選基因進(jìn)行篩選和克隆。

圖4 高粱葉夾角突變基因LA1的精細(xì)定位Figure 4 Fine mapping of leaf angle mutation gene LA1 in sorghum

3 討論與結(jié)論

培育合理株型的高粱品種是提高高粱產(chǎn)量的有效策略。高粱的葉不僅包括葉鞘和葉片，還包括葉枕、葉耳和葉舌等附屬器官，葉夾角是高粱株型的主要性狀之一，具有直立葉片、葉夾角小特點(diǎn)的株型不僅影響群體的受光面積，與產(chǎn)量也密切相關(guān)[15]。ZHANG等[16-17]對(duì)高產(chǎn)水稻株型的研究發(fā)現(xiàn)：劍葉葉夾角13~17°，倒2葉、倒3葉夾角依次增大，使植株呈塔狀，更大限度地接受光能，提高光能利用率。葉夾角的大小與葉耳、葉枕和葉舌的大小密切相關(guān)。本試驗(yàn)對(duì)高粱葉夾角和葉耳周長(zhǎng)研究發(fā)現(xiàn)，無論是野生型還是突變體，不同節(jié)位葉片的葉耳周長(zhǎng)呈現(xiàn)先增加后減低的趨勢(shì)，這與葉夾角大小的先減少后增加的趨勢(shì)正相反，這說明葉夾角的大小與葉耳周長(zhǎng)呈負(fù)相關(guān)。

葉夾角大小的基因與油菜素內(nèi)酯、生長(zhǎng)素和赤霉素等植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和生物合成密切相關(guān)。BRD2是擬南芥DIM/DWF1的同源基因，在BR生物合成途徑中DIM/DWF1能夠?qū)?4-亞甲基膽固醇催化成菜油甾醇。BRD2基因突變后擬南芥表現(xiàn)為植株矮小、葉片直立等性狀[18]。在IAA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中ARF、Aux/IAA和SCF參與水稻葉片夾角的調(diào)控，如OsIAA1、OsARF1和OsARF19等。F-box蛋白TIR1能夠結(jié)合IAA和Aux/IAA，并且使Aux/IAA發(fā)生泛素化和降解，激活A(yù)RF，進(jìn)而調(diào)控水稻葉片夾角。OsIAA1編碼Aux/IAA蛋白，過表達(dá)植株出現(xiàn)株高降低，葉片夾角增大等特征[19]。

玉米、水稻、小麥和谷子已經(jīng)克隆多個(gè)控制葉夾角的基因。玉米中l(wèi)g1和lg2基因缺失，葉耳和葉舌缺失，葉枕發(fā)育異常，lg1和lg2在同一條信號(hào)通路上，且lg2表達(dá)早于lg1,二者共同調(diào)控葉舌、葉耳和葉枕的發(fā)育，進(jìn)而調(diào)控葉夾角的大小[20-21]。對(duì)水稻直立型葉片和披散型葉片細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)：披散型葉片葉枕的細(xì)胞長(zhǎng)度變大，葉片彎曲下垂，形成較大的葉夾角，而直立型葉片葉枕處的細(xì)胞長(zhǎng)度變小，產(chǎn)生較小的葉夾角[22]。本研究對(duì)突變體和野生型不同節(jié)位葉耳研究發(fā)現(xiàn),突變體葉耳周長(zhǎng)極顯著低于野生型的葉耳周長(zhǎng)；細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，與野生型植株葉耳相比，突變體的葉耳細(xì)胞變大，細(xì)胞層數(shù)變少。這說明突變體葉夾角變小是由于突變體的葉耳周長(zhǎng)細(xì)胞變大、層數(shù)變少引起的。

遺傳分析和基因定位表明：LA1基因受單隱性核基因控制，該基因定位于第1染色體的z1s11e1和z1s11e14兩個(gè)標(biāo)記之間，物理距離為70kb,該定位區(qū)間內(nèi)共有12個(gè)注釋基因。對(duì)葉夾角突變基因的后續(xù)深入研究，包括候選基因的篩選、突變基因功能驗(yàn)證、葉夾角形成分子機(jī)制的解析，有可能為培育適宜密植機(jī)械化的高粱品種提供新材料和新基因。