劉小蘭, 高 薇, 梁 超, 喬俊琴*, 王 康, 練鴻振*

(1. 生命分析化學(xué)國家重點實驗室, 南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 南京大學(xué)現(xiàn)代分析中心, 江蘇 南京 210023; 2. 濟川藥業(yè)集團有限公司, 江蘇 泰興 225441)

正辛醇-水分配系數(shù)(logP)是化合物親酯性/親水性的量度,是表征化合物整體疏水性的重要參數(shù),可用于研究有機小分子和生物體之間的相互作用,在指導(dǎo)藥物合理設(shè)計及毒性機理研究[1]、環(huán)境風(fēng)險評價[2,3]以及生物降解研究[4]中具有重要作用。logP測定的經(jīng)典方法為搖瓶法(SFM)[5]和慢攪法(SSM)[6],但測試需要大量樣品,成本很高且費時。反相液相色譜法(RPLC)是經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(OECD)推薦的間接測定logP的有效方法,它是利用與待測物質(zhì)結(jié)構(gòu)相似且已有準確可靠logP值的化合物作為模型化合物,通過測得特定條件下模型化合物的保留因子對數(shù)值logk,建立logP與logk之間的定量結(jié)構(gòu)-保留行為關(guān)系(QSRR)模型,進而求得被測化合物的logP值[7]。logP對應(yīng)化合物中性狀態(tài)的疏水性,對于離解性化合物,通常采用表觀正辛醇-水分配系數(shù)(logD)來表征物質(zhì)在不同pH條件下的疏水性。研究發(fā)現(xiàn),與logP-logk模型相比,以100%水相作流動相時的保留因子對數(shù)值(logkw)與logP或logD之間具有更好的相關(guān)性,即Collander方程[8]。目前,利用RPLC研究中性化合物的logP[9]以及利用離子抑制反相液相色譜法(IS-RPLC)研究弱酸或弱堿化合物的logP或logD已經(jīng)比較成熟[10,11]。然而,對于強離解化合物,使用IS-RPLC法分析時,即使在極低比例的有機調(diào)節(jié)劑和極端pH條件下,也很難得到有效保留。

離子對反相液相色譜(IP-RPLC)作為IS-RPLC的補充,通過在流動相中添加離子對試劑增強溶質(zhì)的保留,專門用于強離解化合物的分離分析[12-15]。但有實驗logP或logD值的強離解化合物很少,不利于QSRR模型的建立,目前,IP-RPLC用于強離解化合物logP或logD的研究還非常少。20世紀90年代,鄒漢法等[16]利用IP-RPLC以苯磺酸作為模型化合物,建立了logD-logkw預(yù)測模型,但模型化合物logD的獲取均來源于計算方法,因此,對于logD實驗值預(yù)測的準確性不能保障。最近,本課題組Liang等[17]在聚乙烯醇基質(zhì)C18柱上,以溶質(zhì)靜電荷(ne)、氫鍵酸性參數(shù)(A)和氫鍵堿性參數(shù)(B)溝通了有實驗logD值的中性化合物、弱酸和強酸化合物,作為混合模型組,建立了更為可靠的logD預(yù)測模型,為強離解化合物logD實驗值的獲取提供了研究基礎(chǔ)。

然而,聚乙烯醇基質(zhì)色譜柱的柱效和壽命均比傳統(tǒng)硅膠基質(zhì)色譜柱低,為了考察Liang等[17]提出的測定強離解化合物logD模型的通用性,本文采用最常規(guī)的硅膠基質(zhì)C18柱,通過擴大模型化合物的范圍,以磷酸二氫銨為緩沖鹽,四丁基溴化銨作為離子對試劑,甲醇為有機調(diào)節(jié)劑,使用等度洗脫的方法獲取了26種中性化合物、47種離解化合物分別在IS-RPLC和IP-RPLC模式下的logkw值,建立了相應(yīng)的logD-logkwQSRR模型。

1 實驗部分

1.1 藥品與試劑

實驗中所用色譜級甲醇購自Honeywell公司(USA),所用水均為飲用純凈水(杭州娃哈哈集團);分析純磷酸二氫銨、氨水(25%～28%)和磷酸(85%)均購自南京化學(xué)試劑股份有限公司,分析純四丁基溴化銨(99%)購自北京百靈威科技有限公司。

實驗中所用化合物列于表1, logP和pKa值為ACD/Labs軟件數(shù)據(jù)庫模塊中的文獻實驗值,溶質(zhì)靜電荷ne、氫鍵酸堿性參數(shù)A、B由https://ilab.acdlabs.com/iLab2/獲取。這些化合物分別購自Accu Standard (USA)、TCI(Japan)、國藥集團化學(xué)試劑有限公司(上海)、Acros Organics(USA)、Matrix Scientific (USA)和Sigma-Aldrich (USA),所有物質(zhì)的純度均大于98%。

表 1 實驗用化合物的log P、 pKa、 log D7.0、 log kw-IS、 log kw-IP、 ne、 A和B值

表 1 (續(xù))

1.2 儀器與設(shè)備

實驗所用高效液相色譜儀為Waters Alliance 2695(Waters, USA),配有真空脫氣機、四元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱和紫外-可見二極管陣列(PDA)檢測器。數(shù)據(jù)的采集和處理均在Waters Empower色譜管理系統(tǒng)中進行。

pH值的測量使用SevenMulti型pH/電導(dǎo)率/離子綜合測試儀(Mettler-Toledo, Switzerland),校準溶液為pH 4.01、7.02和9.26(25 ℃)的標準緩沖溶液(Mettler-Toledo)。

1.3 色譜條件

實驗所用色譜柱為Welch Ultimate?XB-C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm,月旭科技(上海)股份有限公司),硅膠基質(zhì),孔徑12 nm,比表面積320 m2/g,載碳量17%,封尾,耐受pH為1.5～10.0。實驗中柱溫始終保持在30 ℃,流速為1.0 mL/min,等度洗脫,每個化合物在最佳吸收波長處檢測。實驗中各化合物的進樣濃度均為50 mg/L(甲醇配制),進樣量為5 μL。

1.4 實驗方法

在IS-RPLC和IP-RPLC色譜模式下,分別測定各化合物的保留時間(tR),使用尿嘧啶測定死時間(t0)。根據(jù)化合物疏水性的差異,每個化合物的tR至少在4個不同的甲醇比例下(φ=80%～10%,間隔10%或5%,φ是流動相中甲醇的體積分數(shù))測定,tR使用雙點校正法(DP-RTC)進行校正[19,20]。實驗中所有化合物的tR均為至少3次獨立進樣的平均值。

保留因子k由公式k=(tR-t0)/tR計算得到,然后通過線性溶劑強度(LSS)模型(logk=logkw-Sφ,其中,φ是流動相中有機調(diào)節(jié)劑的體積分數(shù),S是線性回歸得到的常數(shù))獲取每個溶質(zhì)的logkw,隨后建立logD-logkw模型。采用Origin 9.4擬合模型并進行相關(guān)數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 log kw值的獲取

分別建立每個化合物的logk-φ線性關(guān)系,外推獲得logkw值,IS-RPLC模式下記為logkw-IS, IP-RPLC模式下記為logkw-IP。我們在前期工作[21]中已證明,中性化合物的保留時間幾乎不受離子對試劑加入的影響,且由于中性化合物的疏水性較大,往往需要在較高的有機調(diào)節(jié)劑比例下獲得合適的保留,而在含鹽的高比例有機調(diào)節(jié)劑下再加入離子對試劑,更容易造成鹽的析出從而堵塞色譜柱和儀器,因此,對于中性化合物,我們只測定了IS-RPLC模式下的tR值,并以IS-RPLC模式下推導(dǎo)的logkw-IS實驗值代表了IP-RPLC模式下的logkw-IP值,即logkw-IS等于logkw-IP。在未加入離子對試劑的條件下,強離解化合物(W21、W27、W33、S2、S6、S10、S13、S14)在色譜柱上的保留極弱,即使在φ=10%時,保留時間依然小于死時間,因此,無法獲取它們的logkw-IS。當加入離子對試劑后,大部分離解化合物尤其強離解化合物的保留均得到明顯增強。logk-φ關(guān)系顯示,所有化合物的線性相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.99,表明在硅膠基質(zhì)C18柱上,中性、弱離解化合物及強離解化合物的保留行為均符合LSS模型。部分弱離解和強離解化合物在離子對試劑加入前后的logk-φ關(guān)系如圖1所示,各化合物的logkw-IS和logkw-IP列于表1。

圖 1 部分弱離解和強離解化合物在不同流動相下的log k-φ關(guān)系Fig. 1 log k-φ relationship of some weakly and strongly ionized compounds with different mobile phases

2.2 log D-log kw-IS模型

中性化合物的logD7.0值(pH 7.0條件下的logD值)等于其logP值。對于有l(wèi)ogP和pKa文獻實驗值的弱離解酸性化合物,其logD7.0值由其logP、pKa以及流動相pH計算獲取[22],結(jié)果列于表1。部分無logD7.0值的離解化合物(如W22～26、W29～32、S1、S3等)在IS-RPLC模式下有明顯保留,根據(jù)LSS模型能夠獲取其logkw-IS值(見表1),因此,可以基于logD7.0-logkw-IS模型測定這部分化合物的logD7.0值。在IS-RPLC模式下,我們以26種中性化合物(N1～26)和20種弱離解酸性化合物(W1～20)為模型化合物,首先在不引入其他參數(shù)的情況下,建立logD7.0-logkw-IS模型:

logD7.0=-0.072(±0.022) logkw-IS+

3.928(±0.596)

N=46,R2=0.174 5

(1)

其中,N為模型化合物的個數(shù)?？梢钥闯?模型(1)的線性極差,說明除疏水作用外,還存在著其他次級作用影響溶質(zhì)的保留。因此,我們嘗試在logD7.0-logkw-IS模型中分別引入氫鍵參數(shù)A和B以及靜電荷ne(列于表1),分別建立相應(yīng)的模型:

logD7.0=1.251(±0.08) logkw-IS-

1.790(±0.40)A-0.630(±0.32)

N=46,R2=0.925 4

(2)

logD7.0=1.360(±0.105) logkw-IS-

1.271(±0.684)B-1.054(±0.446)

N=46,R2=0.899 3

(3)

logD7.0=1.205(±0.064) logkw-IS+

1.420(±0.190)ne-0.480(±0.232)

N=46,R2=0.952 5

(4)

顯然,引入氫鍵參數(shù)A或B后,模型的線性相關(guān)性均得到了極大地改善,引入ne后模型的改善更為明顯(R2=0.952 5)。這是由于在pH 7.0的條件下,模型中所用弱酸性化合物大多數(shù)處于離解狀態(tài),且離解狀態(tài)不同,而此時硅膠基質(zhì)色譜柱上的硅羥基部分解離,因此,溶質(zhì)與固定相之間會表現(xiàn)出較強的氫鍵相互作用和靜電相互作用。通過繼續(xù)優(yōu)化模型發(fā)現(xiàn),將ne、A和B同時引入后的模型(5)相關(guān)性最佳且均方差最小,模型如下:

logD7.0=1.097(±0.077) logkw-IS+

1.648(±0.293)ne+0.524(±0.500)A-

1.236(±0.448)B+0.090(±0.332)

N=46,R2=0.958 3

(5)

表 2 待測化合物的log D7.0實驗預(yù)測值

隨后,我們選用模型(5)預(yù)測了在IS-RPLC模式下有保留的19種離解化合物的logD7.0值,結(jié)果列入表2中,測定的數(shù)據(jù)將用于后續(xù)IP-RPLC模型的建立和模型的驗證。

2.3 log D-log kw-IP模型的建立及強離解化合物log D的測定

Liang等[17]的研究表明,在IP-RPLC模式下,通過引入ne、A和B可以將中性化合物、弱離解以及強離解酸性化合物聯(lián)系起來建立測定強離解化合物logD值的模型。基于此,我們以中性化合物N1～26、弱離解酸性化合物W2～19以及由IS-RPLC測得logD7.0值的離解化合物W22～26、W28～32、S1、S3～5、S7～9、S11共同作為混合模型組,建立IP-RPLC模式下logD7.0測定的多元線性模型(6):

logD7.0=1.075(±0.077) logkw-IP+

2.366(±0.166)ne+0.120(±0.245)A-

1.554(±0.320)B+0.150(±0.310)

N=62,R2=0.942 5

(6)

可以看出,模型(6)的R2可以達到0.94,說明模型具有良好的線性相關(guān)性,充分證明在硅膠基質(zhì)C18色譜柱上以不同類型化合物作為模型化合物建立logD-logkw-IP模型的可行性。Liang等[16]在聚乙烯醇基質(zhì)C18柱上得到的多元線性模型如下:

logD7.0=1.18(±0.07) logkw-IP+

1.55(±0.26)ne-0.09(±0.44)A-

0.44(±0.26)B-0.82(±0.31)

N=50,R2=0.954

(7)

對比發(fā)現(xiàn),本工作中在硅膠基質(zhì)C18柱上模型的相關(guān)性與Liang等在聚乙烯醇基質(zhì)C18柱上模型的相關(guān)性非常接近。同時發(fā)現(xiàn),本工作模型中l(wèi)ogkw-IP的系數(shù)更接近于1,而ne、A和B3個參數(shù)的系數(shù)均大于在聚乙烯醇基質(zhì)C18柱上得到的模型系數(shù),尤其是ne的系數(shù),這表明在硅膠基質(zhì)C18柱上存在著更強的次級作用,參數(shù)ne、A和B對模型的貢獻更大。

為了驗證模型的可靠性,我們選取3種不同類型的離解化合物作為驗證化合物,分別為五氯酚(W20)、苯甲酸(W1)和3,5-二(甲氧基羰基)苯磺酸(S12),其中3,5-二(甲氧基羰基)苯磺酸無SFM/SSM文獻logD7.0值,其logD7.0標準值采用模型(5)得到的測定值。將3個驗證化合物的logkw-IP、ne、A和B帶入模型(6),測定其logD7.0,結(jié)果見表3。

表 3 log D-log kw-IP模型的外部驗證

從表3中可以看出,用模型(6)預(yù)測的3種離解化合物的logD7.0與SFM/SSM法(苯甲酸和五氯酚)或者本文IS-RPLC法(3,5-二(甲氧基羰基)苯磺酸)測定得到的logD7.0非常相近,誤差在10%以內(nèi),說明所建立模型既能測定弱離解化合物的logD值也能測定強離解化合物的logD值,充分證明了模型的可靠性。ACD/Labs軟件是公認的最準確的logP和logD計算軟件,由表3可見,與標準值相比,當化合物結(jié)構(gòu)較為簡單時,如五氯酚和苯甲酸,用ACD/Labs軟件計算得到的logD值比較準確,但是當待測化合物的結(jié)構(gòu)稍復(fù)雜時,如3,5-二(甲氧基羰基)苯磺酸,由ACD/Labs軟件計算得的logD值存在較大的誤差,與俞慧敏等[23]的發(fā)現(xiàn)一致。

利用模型(6)預(yù)測了對苯二甲酸、對氨基苯甲酸、3,5-二羥基苯甲酸、1,5-萘二磺酸、苯胺-2,5-二磺酸、4-磺基苯甲酸、4-羥基苯磺酸和3-磺基苯甲酸的logD7.0值,結(jié)果一并列于表3中。結(jié)果顯示,對這類離解性強、結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的化合物,其logD7.0值與ACD/Labs軟件計算得到的值之間差別較大,也說明用ACD/Labs軟件計算強極性化合物和結(jié)構(gòu)復(fù)雜的化合物時需要謹慎。

3 結(jié)論

本文在硅膠基質(zhì)C18色譜柱上分別研究了中性、弱離解和強離解化合物在IS-RPLC和IP-RPLC中的保留行為。研究發(fā)現(xiàn),IS-RPLC模式下,當模型化合物的離解不能被完全抑制時,引入靜電荷ne、氫鍵參數(shù)A和B可以有效改善模型的相關(guān)性。更為重要的是,在IP-RPLC模式下,我們通過擴大模型化合物的范圍,證明了在硅膠基質(zhì)C18柱上測定強離解化合物logD的可行性,證實了本課題組Liang等提出的利用不同類型化合物作為模型化合物構(gòu)建QSRR模型用于測定強離解化合物logD值的方案在不同基質(zhì)色譜柱上的通用性。