林 妍，朱 慧

壞死性小腸結(jié)腸炎(necrotizing enterocolitis, NEC)是一種新生兒時(shí)期常見的腸道炎性疾病，病死率高達(dá)23%～30%，嚴(yán)重威脅新生兒生命。但目前NEC的發(fā)病機(jī)制仍未完全明了，治療手段也有限，若病情進(jìn)入進(jìn)展期，則預(yù)后較差，25%經(jīng)手術(shù)治療的患兒存在胃腸道長(zhǎng)期后遺癥[1]。故亟待探討NEC的相關(guān)發(fā)病機(jī)制及影響因素以提升臨床診療效果。

microRNA(miRNA)是一類含有19～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，在人類或大鼠、小鼠等動(dòng)物體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，可調(diào)控相應(yīng)的靶基因，參與疾病的發(fā)生、發(fā)展，已被證實(shí)是多種疾病的重要生物檢測(cè)標(biāo)志[2-3]。研究證實(shí)，miR-222、miR-223、miR-451a、miR-27a、miR-187等與NEC的關(guān)系密切[4-6]，提示miR可能參與NEC發(fā)病的調(diào)控。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT1)為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的脫乙?；?，可抑制炎癥反應(yīng)、參與細(xì)胞周期調(diào)控、抑制細(xì)胞凋亡[7]。研究表明，SIRT1參與了NEC的發(fā)病過程，且在NEC中呈低表達(dá)狀態(tài)[8-11]。已證實(shí)SIRT1是miR-34a的靶向位點(diǎn)之一[12-14]，該通路與多種疾病的發(fā)生相關(guān)[15-17]。因此，SIRT1是否由miR-34a調(diào)控而參與NEC的發(fā)病，該通路的具體作用機(jī)制是什么，需進(jìn)一步探究。本研究以新生SD大鼠為研究對(duì)象，構(gòu)建NEC動(dòng)物模型，旨在探究miR-34a、SIRT1與NEC的關(guān)系，為闡明NEC的發(fā)病機(jī)制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物及分組 出生2 h內(nèi)未開奶的無(wú)特定病原體的新生SD大鼠40只，雌雄不限，體質(zhì)量5.6～8.5 g[上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK(滬)2017-0005]。隨機(jī)分為5組，對(duì)照組(A組)8只，實(shí)驗(yàn)組32只(又分為4組，分別為B～E組，其中B組為NEC模型組，C組為NEC模型+miR-34a干擾片段組，D組為NEC模型+SIRT1激動(dòng)劑組，E組為NEC模型+miR-34a干擾片段+SIRT1抑制劑組，n=8)。A組：與代母鼠同籠鼠乳喂養(yǎng)。B～E組參照既往文獻(xiàn)并適當(dāng)改良建立NEC模型[18]，將大鼠放入連接氮?dú)獾牟Ａ恐校獨(dú)獬錆M瓶子60 s后取出大鼠，立即放于4 ℃下冷刺激10 min，2次/d,連續(xù)3 d。C～E組給予相應(yīng)藥物溶于生理鹽水后進(jìn)行尾靜脈注射，A～B組給予等體積生理鹽水尾靜脈注射，1次/d，連續(xù)5 d。當(dāng)出現(xiàn)明顯臨床癥狀(如嚴(yán)重腹脹、血便和紫紺)時(shí)或于建模后第6天行頸椎脫臼處死大鼠，觀察各組大鼠的一般情況，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求取腸管及血液標(biāo)本進(jìn)行研究。

1.1.2 主要試劑及儀器 SIRT1激動(dòng)劑(SRT 1720 Hydrochloride)及SIRT1抑制劑(Nicotinamide)(廣州柏賽柯生物技術(shù)有限公司)；miR-34a干擾片段(miR-34a inhibitors)(重慶市尚亞生物有限公司)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche480，瑞士Roche公司)；凝膠成像系統(tǒng)(JS-2012，上海培清科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 腸組織病理學(xué)檢查方法 大鼠處死后，取回腸遠(yuǎn)端5 cm腸管，用冷生理鹽水沖洗并清除腸內(nèi)容物后，置于10%中性福爾馬林固定24～48 h，脫水、包埋、連續(xù)切片(4～5 μm)、蘇木精-伊紅(hematoxylin eosin，H-E)染色、中性樹膠封固。病理評(píng)分參考文獻(xiàn)中的計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)[19]：0分，腸黏膜絨毛完整，組織結(jié)構(gòu)正常；1分，輕度黏膜肌層和(或)黏膜下層與固有層分離；2分，中度黏膜肌層和(或)黏膜下層與固有層分離，黏膜下層或肌層水腫；3分，重度黏膜肌層和(或)黏膜下層與固有層分離，黏膜下層或肌層水腫，局部絨毛脫落；4分，腸黏膜絨毛消失伴腸壞死。雙盲法計(jì)分，病理評(píng)分≥2分者視為發(fā)生NEC。

1.2.2 腸組織miR-34α、SIRT1的mRNA表達(dá)測(cè)定 采取實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR)進(jìn)行檢測(cè)。取各組凍存的腸組織標(biāo)本，加入NucleoZol試劑提取總RNA，其中miR-34α需加入miR-34a頸環(huán)結(jié)構(gòu)(反轉(zhuǎn)錄引物)以延長(zhǎng)序列。反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。分別以U6、GAPDH為內(nèi)參，將cDNA稀釋后加入引物，配成體系行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s→60 ℃退火30 s→72 ℃延伸30 s，循環(huán)40次。反應(yīng)結(jié)束后采用ΔΔCt方法對(duì)各組目的基因進(jìn)行相對(duì)定量分析。相關(guān)引物由重慶市尚亞生物有限公司設(shè)計(jì)合成。

miR-34a：

上游：5′-CGCGTGGCAGTGTCTTAGCT-3′

下游：5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′

反轉(zhuǎn)錄引物：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAACC-3′

內(nèi)參U6：

上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′

下游：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′

SIRT1：

上游：5′-GCTGTGGACTTCCCGGATCT-3′

下游：5′-AACAGAGCTGCTCATGAATGC-3′

內(nèi)參GAPDH：

上游：5′-AGTGCCAGCCTCGTCTCATA-3′

下游：5′-GGTAACCAGGCGTCCGATAC-3′

1.2.3 腸管組織中SIRT1、炎癥細(xì)胞因子的蛋白表達(dá)測(cè)定 采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western-blot)檢測(cè)SIRT1以及包括腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6、IL-8、IL-10在內(nèi)的炎癥細(xì)胞因子的蛋白量。加入含PMSF的蛋白裂解液，提取總蛋白，用BCA蛋白測(cè)定法檢測(cè)各個(gè)樣品總蛋白濃度，經(jīng)電泳分離、轉(zhuǎn)印、封閉后，將膜放入裝有稀釋的鼠一抗的雜交盒中(其中IL-1β的一抗按1∶10 000稀釋，余實(shí)驗(yàn)中的一抗按1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，再放入1∶5 000稀釋的鼠二抗雜交盒中，室溫孵育2 h，采用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)光，收集條帶圖像，以β-actin為內(nèi)參，分析條帶灰度值。

1.2.4 血清中炎癥細(xì)胞因子及氧化應(yīng)激因子的濃度測(cè)定 采用ELISA對(duì)炎癥細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10)，以及包括單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)、血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)在內(nèi)的氧化應(yīng)激因子進(jìn)行濃度測(cè)定。抽取各組大鼠靜脈血2 mL，3 500 r/min離心后吸取上清，置于-20 ℃冰箱保存，再根據(jù)各個(gè)試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行濃度測(cè)定。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況與生長(zhǎng)發(fā)育 實(shí)驗(yàn)組大鼠24 h內(nèi)均存活，48 h內(nèi)存活29只(90.6%)，72 h內(nèi)存活 25只(78.1%)，對(duì)照組均存活。對(duì)照組大鼠進(jìn)食及活動(dòng)正常，大便性狀正常，對(duì)刺激反應(yīng)良好。實(shí)驗(yàn)組大鼠在建模過程中均出現(xiàn)不同程度的進(jìn)食量下降、活動(dòng)減少、腹部膨隆、排便異常等表現(xiàn)。

2.2 NEC模型建設(shè)情況及腸管組織H-E染色結(jié)果 各組H-E染色結(jié)果顯示：A組腸黏膜絨毛完整，組織結(jié)構(gòu)大致正常，病理評(píng)分(0.25±0.46)分。B組大量腸黏膜絨毛脫落、消失，重度黏膜肌層和黏膜下層與固有層分離，間質(zhì)崩解，損傷最嚴(yán)重，病理評(píng)分(3.88±0.35)分，顯著高于A組(P<0.001)。C、D組病理評(píng)分均為(2.25±0.46)分，較B組降低(P<0.001)，可見輕中度黏膜肌層和(或)黏膜下層與固有層分離，組織損傷均較B組減輕；E組病理評(píng)分(3.13±0.35)分，較 C組高(P<0.001)，部分腸黏膜絨毛脫落，中重度黏膜肌層和黏膜下層與固有層分離，組織損傷較C組更嚴(yán)重(圖1)。

A：A組(對(duì)照組)，腸黏膜絨毛完整，組織結(jié)構(gòu)大致正常；B：B組(NEC模型組)，腸黏膜絨毛脫落、消失，重度黏膜肌層和黏膜下層與固有層分離；C：C組(NEC模型+miR-34a干擾片段組)，輕中度黏膜肌層和(或)黏膜下層與固有層分離；D：D組(NEC模型+SIRT1激動(dòng)劑組)，輕中度黏膜肌層和(或)黏膜下層與固有層分離；E：E組(NEC模型+miR-34a干擾片段+SIRT1抑制劑組)，腸黏膜絨毛脫落，中重度黏膜肌層和黏膜下層與固有層分離。

2.3 腸管組織中miR-34a、SIRT1的mRNA相對(duì)表達(dá)情況 與A組比較，B組中的miR-34a表達(dá)增加(P<0.001)、SIRT1 mRNA表達(dá)減少(P<0.001)；C、D組分別與B組比較顯示，使用miR-34a干擾片段或SIRT1激動(dòng)劑后均可使miR-34a的表達(dá)顯著減少(P<0.001)，SIRT1 mRNA的表達(dá)明顯增加(P<0.05)；E組與C組比較顯示，使用SIRT1抑制劑后SIRT1 mRNA的表達(dá)相對(duì)減少(P<0.05)，miR-34a的表達(dá)相對(duì)增加(P<0.01，圖2)。

miR-34a：microRNA-34a；SIRT1：沉默信息調(diào)節(jié)因子1。A組：對(duì)照組；B組：NEC模型組；C組：NEC模型+miR-34a干擾片段組；D組：NEC模型+SIRT1激動(dòng)劑組；E組：NEC模型+miR-34a干擾片段+SIRT1抑制劑組。A：miR-34a；B：SIRT1 mRNA?！睿篜<0.05，☆☆：P<0.01，☆☆☆：P<0.001。

2.4 腸管組織中SIRT1、炎癥細(xì)胞因子的蛋白表達(dá)情況 腸管組織中SIRT1的蛋白表達(dá)情況與其mRNA的表達(dá)意義一致，且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。B組的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8蛋白水平較A組顯著增加(P<0.001)，而IL-10蛋白水平較A組降低(P<0.001)；C、D組分別與B組比較顯示，使用miR-34a干擾片段或SIRT1激動(dòng)劑后均可使TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8蛋白水平降低(P<0.05)，而IL-10蛋白水平增加(P<0.01)；E組與C組比較顯示，使用SIRT1抑制劑可使TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8蛋白水平增加(P<0.05)，而IL-10蛋白水平降低(P<0.01，圖3)。

SIRT1：沉默信息調(diào)節(jié)因子1；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL：白細(xì)胞介素；β-actin：β-肌動(dòng)蛋白(內(nèi)參)。A組：對(duì)照組；B組：NEC模型組；C組：NEC模型+miR-34a干擾片段組；D組：NEC模型+SIRT1激動(dòng)劑組；E組：NEC模型+miR-34a干擾片段+SIRT1抑制劑組。A：SIRT1蛋白；B：TNF-α蛋白；C：IL-1β蛋白；D：IL-6蛋白；E：IL-8蛋白；F：IL-10蛋白；G：各組Western-blot檢測(cè)結(jié)果比較?！睢睿篜<0.01，☆☆☆：P<0.001。

2.5 血清中炎癥細(xì)胞因子及氧化應(yīng)激相關(guān)因子的表達(dá)情況 血清中炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)情況與其在腸組織中蛋白的表達(dá)意義一致，且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。B組的MDA、MCP-1、VCAM-1濃度最高，SOD濃度最低。與A組比較，B組的MDA、MCP-1、VCAM-1濃度升高(P<0.05)，SOD濃度降低(P<0.001)；C、D組分別與B組比較顯示，使用miR-34a干擾片段或SIRT1激動(dòng)劑后，MDA、MCP-1、VCAM-1濃度降低(P<0.05)，SOD濃度升高(P<0.01)；E組與C組比較顯示，使用SIRT1抑制劑后，血清中MDA、MCP-1、VCAM-1的濃度升高(P<0.05)，SOD濃度降低(P<0.05，圖4)。

IL：白細(xì)胞介素；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；MCP-1：?jiǎn)魏思?xì)胞趨化蛋白-1；VCAM-1：血管細(xì)胞黏附分子-1；SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛。A組：對(duì)照組；B組：NEC模型組；C組：NEC模型+miR-34a干擾片段組；D組：NEC模型+SIRT1激動(dòng)劑組；E組：NEC模型+miR-34a干擾片段+SIRT1抑制劑組。A、B：炎癥細(xì)胞因子(IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10)的濃度；C、D：氧化應(yīng)激因子(MCP-1、VCAM-1、SOD、MDA)的濃度?！睿篜<0.05，☆☆：P<0.01，☆☆☆：P<0.001。

3 討 論

目前，大部分研究認(rèn)為，NEC的發(fā)病是由多種因素綜合作用所致，其中炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是關(guān)鍵因素[1]。本研究從炎癥反應(yīng)的角度出發(fā)，選取TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、MDA、MCP-1等已被證實(shí)與腸道炎性疾病關(guān)系密切的炎性介質(zhì)作為NEC炎癥程度的觀測(cè)指標(biāo)[8,20-22]，探討NEC的發(fā)病機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，參與癌癥及多種疾病調(diào)控的信號(hào)通路miR-34a/SIRT1也可影響炎癥介質(zhì)的釋放，與NEC的發(fā)病關(guān)系密切[15-17]。

本研究中的實(shí)驗(yàn)組在建模過程中出現(xiàn)了不同程度的食量下降、活動(dòng)減少、排便異常等表現(xiàn)，模型組的腸道標(biāo)本病理評(píng)分為(3.88±0.35)分，提示大鼠NEC模型造模成功，所檢測(cè)的各種指標(biāo)有代表意義。

SIRT1屬于Ⅲ類組蛋白去乙?；福稍诖笫蠹叭梭w的各細(xì)胞、組織中穩(wěn)定表達(dá)，已被證實(shí)可抑制相關(guān)炎癥介質(zhì)釋放，以減輕炎性反應(yīng)對(duì)機(jī)體造成的損傷[7,23-24]。本研究結(jié)果顯示，SIRT1在NEC新生大鼠體內(nèi)呈低表達(dá)狀態(tài)，而使SIRT1表達(dá)水平增高可以使促炎因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8)、促氧化因子(MDA、MCP-1、VCAM-1)的表達(dá)降低，而使抗炎因子(IL-10)、抗氧化因子(SOD)表達(dá)增加，從而使腸黏膜、肌層水腫減輕，腸黏膜絨毛脫落減少，病理評(píng)分降低。提示SIRT1的表達(dá)水平與NEC密切相關(guān)，SIRT1表達(dá)增加可能對(duì)減輕炎癥反應(yīng)及改善NEC腸組織損傷有一定作用，這與Bai等的研究結(jié)果一致[11]。

miRNA可影響細(xì)胞的增殖、分化和遷移，參與多種疾病的調(diào)控[25]。miR-34a作為目前國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)，不僅被證實(shí)與腫瘤、骨關(guān)節(jié)疾病等關(guān)系密切[14-17]，還與先天性巨結(jié)腸等腸道疾病有關(guān)[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a在NEC新生大鼠體內(nèi)呈高表達(dá)狀態(tài)，降低miR-34a的表達(dá)水平，可使NEC大鼠體內(nèi)炎癥應(yīng)激反應(yīng)減輕，組織損傷減輕，可見miR-34a是導(dǎo)致NEC炎癥反應(yīng)發(fā)生的重要因素。

本研究還發(fā)現(xiàn)，SIRT1激動(dòng)劑不僅調(diào)控了下游的炎癥因子的表達(dá)水平，還影響了SIRT1及miR-34a的表達(dá)水平，原因可能是SIRT1激動(dòng)劑調(diào)控了下游炎癥因子濃度，而下游炎癥因子濃度的改變間接影響了SIRT1和miR-34a的表達(dá)水平。Huang等[27]發(fā)現(xiàn)，低濃度TNF-α處理的成骨細(xì)胞中SIRT1的蛋白表達(dá)較高濃度組增加，證實(shí)了炎癥因子的濃度變化導(dǎo)致SIRT1表達(dá)變化的現(xiàn)象，但具體是通過何種機(jī)制進(jìn)行調(diào)控，有待實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究。研究發(fā)現(xiàn)，IL-6水平發(fā)生變化會(huì)激發(fā)IL-6R/STAT3/miR-34a反饋環(huán)，從而導(dǎo)致miR-34a的表達(dá)變化[28]，還有一項(xiàng)關(guān)于炎癥反應(yīng)與miR關(guān)系的研究也證實(shí)了IL-6、IL-8及IL-10等炎癥因子可影響miR的表達(dá)[29]，故SIRT1激動(dòng)劑對(duì)miR-34a表達(dá)的影響很可能是通過調(diào)控炎癥因子的濃度來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

研究顯示，miR-34a可與SIRT1的3′端不翻譯區(qū)結(jié)合，抑制SIRT1的表達(dá)，從而影響腸上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡的調(diào)控，參與小腸缺血再灌注損傷的病理過程[14-15,24]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a干擾片段可上調(diào)SIRT1的表達(dá)水平，改善NEC大鼠腸組織損傷，當(dāng)使用SIRT1抑制劑下調(diào)SIRT1的表達(dá)后，miR-34a干擾片段對(duì)NEC的修復(fù)作用也受抑制，證實(shí)miR-34a是通過調(diào)控SIRT1的表達(dá)參與NEC的發(fā)病。

本研究從炎癥反應(yīng)的角度出發(fā)，為NEC的發(fā)病機(jī)制提供了新的思路，但是上述結(jié)果系基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得出，且實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量有限，其結(jié)論是否可用于臨床，仍需要多中心、大樣本量的人體臨床實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，miR-34a/SIRT1通路參與新生大鼠NEC的發(fā)生，機(jī)制可能是miR-34a下調(diào)SIRT1的表達(dá)，使促炎因子、促氧化因子釋放增加，抗炎、抗氧化水平降低，激發(fā)炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致NEC的發(fā)生發(fā)展。