趙光耀，陸立東*，童 曉，李成萬(wàn)，姜東林，唐國(guó)榮

1江南大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，2檢驗(yàn)科，江蘇 無(wú)錫 214122；3無(wú)錫市兒童醫(yī)院消化科，江蘇 無(wú)錫 214023

輕度胃腸炎伴良性嬰幼兒驚厥（benign infantile convulsions associated with mild gastroenteritis，BICE），又稱輕度胃腸炎伴驚厥（convulsion with mild gastro?enteritis，CwG），是一種以輕度胃腸炎癥狀為主、體溫正常或僅低熱（＜37.8 ℃）、無(wú)明顯電解質(zhì)紊亂及酸堿平衡失調(diào)的病癥，好發(fā)于1 個(gè)月～6 歲的嬰幼兒［1-3］。其特點(diǎn)是伴發(fā)無(wú)熱驚厥，表現(xiàn)為全身強(qiáng)直性或局灶性陣攣抽搐，而非癲癇，目前國(guó)際癲癇聯(lián)盟尚未對(duì)其分類。

BICE驚厥發(fā)生機(jī)制尚不明確，主流觀點(diǎn)認(rèn)為與病毒感染、細(xì)胞因子和免疫失衡、嬰幼兒驚厥閾值偏低、一氧化氮（nitric oxide，NO）增多及遺傳易感性等因素有關(guān)［4-8］。約70%患兒在病程中出現(xiàn)2 次及以上驚厥，最多報(bào)道為8 次［9］。對(duì)癥及抗驚厥治療是目前控制急性期驚厥的常用方法，但缺乏統(tǒng)一規(guī)范的治療方案。多數(shù)患兒驚厥治療效果較好，但有接近50%的患兒服用單一抗驚厥藥物后驚厥再發(fā)，即使在服用2 種聯(lián)合抗驚厥藥后，仍有超過(guò)25%的驚厥持續(xù)發(fā)作［4］。驚厥頻發(fā)不僅影響患兒恢復(fù)和生活治療，給家屬帶來(lái)嚴(yán)重的精神負(fù)擔(dān)，同時(shí)也會(huì)延長(zhǎng)住院時(shí)間、增加醫(yī)療費(fèi)用及治療挫敗感。因此，如何準(zhǔn)確預(yù)測(cè)及有效管理BICE 驚厥頻發(fā)成為醫(yī)患共同關(guān)注的焦點(diǎn)。本研究回顧性分析本院2013 年10 月—2017 年12 月收治的BICE 患者資料，探討影響B(tài)ICE 驚厥頻發(fā)的危險(xiǎn)因素并構(gòu)建列線圖預(yù)測(cè)模型，為臨床的早期識(shí)別及治療提供參考。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象

選擇2013年10月—2017年12月在江南大學(xué)附屬醫(yī)院住院的BICE 患兒91 例，納入標(biāo)準(zhǔn)如下［9］：①既往體健的6 月齡至6 歲嬰幼兒出現(xiàn)無(wú)熱驚厥；②可有輕度脫水癥狀（＜5%的體重）；③驚厥發(fā)作在胃腸炎病程中，一般呈強(qiáng)直?陣攣樣發(fā)作，可為單次或多次發(fā)作；④發(fā)作間期腦電圖正常；⑤血清電解質(zhì)、血糖、腦脊液檢查正常。根據(jù)本研究納入的91例患兒驚厥發(fā)作次數(shù)的中位數(shù)，將BICE分為驚厥頻發(fā)組（＞3次）和對(duì)照組（≤3次）。根據(jù)糞便輪狀病毒（ro?tavirus，RV）抗原檢測(cè)結(jié)果分為陽(yáng)性和陰性組。排除患兒既往窒息、早產(chǎn)、熱性驚厥等，排除既往變態(tài)反應(yīng)性疾病、近期其他感染、免疫抑制劑應(yīng)用等。

熒光抗體CD3?FITC/CD4?PE、CD3?FITC/CD8?PerCP、溶血素（FACS1M）、流式細(xì)胞微球芯片捕獲技術(shù)人輔助T 淋巴細(xì)胞（T helper，Th）1/2 細(xì)胞因子試劑盒11（BD Biosciences公司，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 T細(xì)胞亞群檢測(cè)

取肝素抗凝的外周血0.3 mL分別加入Falcon管中，然后加入熒光抗體CD3?FITC/CD4?PE、CD3?FITC/CD8?PerCP，對(duì)照管中加入對(duì)應(yīng)的同型對(duì)照，25 ℃避光孵育30 min，4 ℃離心棄上清，往沉淀中加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗2次后，加入PBS 400 μL 懸浮細(xì)胞，然后用流式細(xì)胞儀（FACS Calibur，BD公司，美國(guó)）進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 細(xì)胞因子檢測(cè)

取外周血2 mL，于37 ℃水浴2 h 后分離血清備用。試劑于室溫放置1 h 后將白介素（interleukin，IL）IL?2、IL?4、IL?6、IL10、腫瘤壞死因子?α（tumor ne?crosis factor?α，TNF?α）、γ干擾素（interferon?γ，IFN?γ）捕獲微球混合，離心后棄上清，同體積加入血清樣本增強(qiáng)緩沖液，重懸微球避光反應(yīng)30 min，每個(gè)FACS管加入50 μL混合捕獲微球，50 μL待檢血清和標(biāo)準(zhǔn)品，50 μL 藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）熒光抗體混勻。室溫避光孵育3 h，每管加1 mL 洗液，然后離心5 min，棄上清后每管加300 μL洗液重懸，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)檢測(cè)獲取的數(shù)據(jù)，用CBA軟件自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本中各細(xì)胞因子含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

對(duì)正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)；偏態(tài)分布的計(jì)量資料以中位值和極值（median，minimum，maximum）的形式表示，兩組間采用Mann?WhitneyU檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用百分比（%）表示，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Logistic回歸分析探索危險(xiǎn)因素，并依據(jù)獨(dú)立危險(xiǎn)因素構(gòu)建列線圖，采用受試者工作（receiver operating curve，ROC）曲線及曲線下面積（area under curve，AUC）、一致性指數(shù)（C?index）、校準(zhǔn)曲線及決策曲線分析（decision curve analysis，DCA）對(duì)列線圖效能進(jìn)行檢驗(yàn)。其中，C?index 和AUC范圍0.5～1.0，越接近1 說(shuō)明模型預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際一致性越好。所有的統(tǒng)計(jì)分析通過(guò)R 軟件（4.0.2）完成。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況分析

本研究共納入91例BICE患兒，其中對(duì)照組62例，驚厥頻發(fā)組29 例。對(duì)照組患兒的CD4+T 和CD8+T細(xì)胞含量明顯高于頻發(fā)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001，＜0.001）。驚厥頻發(fā)組患兒的輪狀病毒陽(yáng)性率、IL?6、IL?10 和TNF?α水平明顯高于對(duì)照組（P均＜0.05）。兩組患兒的性別構(gòu)成、CD4+/CD8+、IL?2、IL?4和IFN?γ水平無(wú)顯著差異（P>0.05，表1）。

表1 兩組患兒的臨床指標(biāo)比較Table 1 Comparison of clinical indicators between the control group and the BICE group

2.2 單因素及多因素Logistic回歸分析

單因素Logistic 回歸分析結(jié)果顯示，輪狀病毒、CD4+T細(xì)胞含量、IL?10和TNF?α水平是影響B(tài)ICE患兒驚厥頻發(fā)的危險(xiǎn)因素（P＜0.05）；將上述4個(gè)變量納入多因素Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示輪狀病毒、CD4+T 細(xì)胞含量、IL?10 和TNF?α水平等均是影響B(tài)ICE患兒驚厥頻發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05，表2）。

表2 單因素和多因素Logistic回歸分析Table 2 Univariate and multivariate logistic regression analysis

2.3 列線圖的構(gòu)建及驗(yàn)證

基于多因素Logistic 回歸篩選出的4 個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素構(gòu)建列線圖（圖1）。每個(gè)因素的得分對(duì)應(yīng)列線圖上方標(biāo)尺的標(biāo)注，通過(guò)對(duì)各項(xiàng)因素得分的相加，可以計(jì)算出對(duì)應(yīng)的總分，得分越高，驚厥頻發(fā)的可能性越大。

圖1 BICE驚厥頻發(fā)列線圖預(yù)測(cè)模型Figure 1 Nomogram prediction model of BICE

本研究構(gòu)建的列線圖的C?index 為0.875，說(shuō)明預(yù)測(cè)效果較好。AUC 為0.848，靈敏度為69.5%，特異度為91.8%（圖2A）。校準(zhǔn)圖顯示模型預(yù)測(cè)曲線和理想曲線基本符合（圖2B）。使用Bootstrap 法對(duì)列線圖進(jìn)行內(nèi)部驗(yàn)證，重復(fù)取樣1 000次，C?index為0.854。決策曲線解釋，圖上3 條線分別表示：驚厥不頻發(fā)（所有的患兒均不會(huì)出現(xiàn)驚厥頻發(fā)，水平線）；頻發(fā)（所有的患兒均出現(xiàn)驚厥頻發(fā)，斜線）和模型（根據(jù)列線圖預(yù)測(cè)驚厥頻發(fā)，曲線）。可以看出，當(dāng)閾值在2%～78%時(shí)，模型預(yù)測(cè)對(duì)BICE患兒體現(xiàn)出較高的獲益率（圖2C）。

圖2 列線圖驗(yàn)證模型Figure 2 Nomogram validation models

3 討論

嬰幼兒驚厥是一種陣發(fā)性、單次或成簇性的神經(jīng)功能異常的陣攣抽搐，伴或不伴大腦皮質(zhì)異常放電，多數(shù)BICE患兒間發(fā)作期和間歇期腦電圖檢查正常［1，10］。BICE驚厥發(fā)生機(jī)制不明確，發(fā)作形式多樣，表現(xiàn)不典型，持續(xù)時(shí)間不固定，為臨床的規(guī)范化治療和管理帶來(lái)了挑戰(zhàn)。因此，研究BICE驚厥的危險(xiǎn)因素對(duì)有效防止驚厥再發(fā)及改善患兒生活質(zhì)量具有重要意義。本研究基于輪狀病毒、CD4+T 細(xì)胞含量、IL?10 和TNF?α水平等4 個(gè)危險(xiǎn)因素，首次將BI?CE 驚厥頻發(fā)的預(yù)測(cè)模型通過(guò)列線圖快速、直觀、精確地展現(xiàn)出來(lái)，為臨床識(shí)別最有可能發(fā)展為驚厥頻發(fā)的患兒及后續(xù)合理治療，提供了理論依據(jù)。

輪狀病毒感染是引起B(yǎng)ICE 驚厥發(fā)生的主要原因之一［11-12］。輪狀病毒寄生于腸道內(nèi)，從外周血通過(guò)血腦屏障，進(jìn)入嬰幼兒發(fā)育尚不完善的神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，誘發(fā)驚厥［13］。同時(shí)可在輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3（non?structural protein 3，NSP3）和VP6 衣殼蛋白的作用下，經(jīng)淋巴途徑入侵腸外組織，通過(guò)非結(jié)構(gòu)蛋白4（non?structural protein，NSP4）介導(dǎo)的Ca2+動(dòng)員觸發(fā)氨基酸、多肽及其他細(xì)胞因子的釋放，影響神經(jīng)傳導(dǎo)，誘發(fā)癲癇樣放電［14-15］。另有研究表明，輪狀病毒會(huì)改變腸道菌群的種類及削弱腸道黏膜屏障，誘發(fā)驚厥，可能與以下原因有關(guān)：①腸道菌群產(chǎn)生過(guò)多的NO，使神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，進(jìn)而使興奮性氨基酸谷氨酸鹽釋放增加，最終導(dǎo)致驚厥發(fā)生；②輪狀病毒和富含唾液酸的糖蛋白及組織血型抗原（histo?blood group antigen，HBGA）相互作用，導(dǎo)致腸道免疫功能受損，誘發(fā)驚厥［16-17］。輪狀病毒疫苗的應(yīng)用，使兒童驚厥相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)降低了18%～21%［18］。與已有研究相符［12-13］，本研究結(jié)果表明驚厥頻發(fā)組患兒的輪狀病毒陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組，而且是預(yù)測(cè)驚厥頻發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。但近年來(lái)部分學(xué)者認(rèn)為病毒感染與BICE 并無(wú)直接相關(guān)性［19］，因此，病毒感染尤其是輪狀病毒感染在BICE 發(fā)生中的作用機(jī)制仍然需要進(jìn)一步的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和大樣本的臨床研究去證實(shí)。

腸道免疫又稱黏膜免疫，是人體免疫系統(tǒng)中最大的免疫組成部分。腸道不斷暴露在各種免疫原的刺激下，通過(guò)黏膜屏障及免疫調(diào)節(jié)體內(nèi)平衡。炎癥因子及其介導(dǎo)的免疫功能紊亂是BICE 發(fā)病機(jī)制之一［20］。本研究發(fā)現(xiàn)BICE 驚厥頻發(fā)組患兒CD4+T和CD8+T 細(xì)胞含量明顯低于對(duì)照組，而IL?6、IL?10和TNF?α高于對(duì)照組，且列線圖表明CD4+T和IL?10在預(yù)測(cè)模型中賦值分較高，提示BICE患兒體內(nèi)過(guò)度表達(dá)的細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞比例失衡可能是造成其驚厥頻發(fā)的重要原因。CD4+T細(xì)胞是T細(xì)胞的一個(gè)亞群，CD4+是輔助T 淋巴細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞（regulatory T，Treg）的表面分子標(biāo)志物［21］。CD4+T細(xì)胞能幫助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，可以增強(qiáng)和維持CD8+T 細(xì)胞的反應(yīng)能力及對(duì)巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)功能；此外CD4+T 還是免疫記憶的重要介質(zhì)，當(dāng)其數(shù)量下降時(shí)，引起具有免疫調(diào)節(jié)及抗感染作用的γ干擾素（IFN?γ）水平下降，機(jī)體啟動(dòng)免疫應(yīng)答能力減弱，易感性增加［21］。

CD4+T 細(xì)胞初始態(tài)有一定的可塑性，在不同的免疫微環(huán)境及細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下可以分化為T(mén)h1、Th2、Th3、Th9、Th17、Th22 和Treg 等細(xì)胞［22］。其中，Th1分泌IL?2、IFN?γ，輔助產(chǎn)生抗體，在細(xì)菌和病毒感染時(shí)發(fā)揮作用；Th2 分泌IL?4、IL?6 和IL?10，在體液免疫中發(fā)揮重要作用；Th17可以分泌TNF?α，起促炎和調(diào)節(jié)腸道屏障功能的作用；Treg細(xì)胞分泌IL?10，介導(dǎo)免疫耐受，在炎性腸病中發(fā)揮重要作用［23-24］。腸道菌群及其代謝產(chǎn)物對(duì)CD4+T細(xì)胞的分化及穩(wěn)態(tài)有重要的調(diào)節(jié)作用［25］。嬰幼兒腸道菌群組成和豐度個(gè)體差異大，敏感性高，且胃腸炎患兒腸道功能失調(diào)，免疫防御機(jī)制不完善，與BICE 的發(fā)生密切相關(guān)［26］。與先前研究一致，BICE驚厥頻發(fā)患兒體內(nèi)免疫失調(diào)較無(wú)驚厥或驚厥次數(shù)較少患兒更強(qiáng)烈，其分泌的細(xì)胞因子如IL?6、IL?10等顯著升高，提示IL?10水平隨驚厥次數(shù)的增加而增高。IL?10 表達(dá)水平升高有利于神經(jīng)組織的保護(hù)和修復(fù)，而過(guò)表達(dá)的IL?10 反而會(huì)影響其他細(xì)胞因子的釋放，也會(huì)提高神經(jīng)元的興奮性，誘導(dǎo)驚厥發(fā)生［26］。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，CD4+T、CD8+T表達(dá)降低可能影響驚厥發(fā)作的次數(shù)和持續(xù)時(shí)間，與本次CD4+T、CD8+T表達(dá)水平在驚厥頻發(fā)組明顯降低的結(jié)果相符［5］。

本研究將上述獨(dú)立危險(xiǎn)因素納入構(gòu)建列線圖，并將每個(gè)因素進(jìn)行量化，通過(guò)列線圖校準(zhǔn)曲線和內(nèi)部驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)效能和實(shí)際觀測(cè)有良好的一致性，說(shuō)明列線圖對(duì)BICE 驚厥頻發(fā)有良好的預(yù)測(cè)價(jià)值。從列線圖可以看出，賦值分?jǐn)?shù)由高到低的變量依次是輪狀病毒、IL?10、CD4+T 和TNF?α，且前3 種因素賦值分?jǐn)?shù)較高，表明對(duì)驚厥頻發(fā)貢獻(xiàn)值最大，這就要求在臨床工作中重點(diǎn)關(guān)注輪狀病毒陽(yáng)性的BICE患兒，及時(shí)糾正IL?10和CD4+T至正常范圍，避免驚厥再發(fā)。當(dāng)然，本研究尚存在不足之處：①樣本量偏小，造成檢驗(yàn)效能偏低，不足以適用于所有BICE患兒；②缺少來(lái)源于其他機(jī)構(gòu)或研究中心的數(shù)據(jù)對(duì)列線圖進(jìn)行外部驗(yàn)證；③BICE發(fā)病機(jī)制涉及基因組學(xué)改變，由于當(dāng)下對(duì)BICE 基因檢測(cè)未普及，未能納入基因?qū)用娴臄?shù)據(jù)。在今后工作中，將繼續(xù)擴(kuò)大樣本量，篩選更多影響B(tài)ICE 驚厥頻發(fā)的影響因素，同時(shí)開(kāi)展多中心前瞻性的隨機(jī)對(duì)照研究，改進(jìn)列線圖預(yù)測(cè)模型，為BICE患兒制定個(gè)體化的預(yù)防及治療提供參考。

綜上所述，BICE患兒驚厥頻發(fā)是多種因素綜合作用的結(jié)果，且各種危險(xiǎn)因素在驚厥發(fā)作次數(shù)不同的患兒間存在差異。臨床上可依據(jù)基于上述危險(xiǎn)因素構(gòu)建的列線圖，評(píng)估患兒病情，調(diào)整治療方案，提高BICE驚厥的管理。