徐靜蕾，胡伊樂，楊佳文，朱心雨，李 靜，霍夢惠，劉 玲

（河南科技大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 洛陽 471003）

肝癌是一種最常見的致命性惡性腫瘤，發(fā)現(xiàn)時往往已經(jīng)是晚期癌［1］。在所有肝癌病例中，超過90%是肝細胞癌（hepatocellular carcinoma cells，HCC），目前化學(xué)療法和免疫療法是治療的最佳選擇，當腫瘤為非彌漫型時，手術(shù)是最佳的治療方法，但對于肝硬化患者，化療就成為最佳選擇，因此，探索新的藥物治療方式是十分必要的。探索新的治療方式十分必要［2］。一氧化氮（nitric oxide，NO）是體內(nèi)一種重要的信號分子，參與調(diào)節(jié)許多關(guān)鍵的生理過程，如血管舒張，血小板聚集，激素分泌，胃腸道活動性和傷口愈合等。高濃度NO具有抗腫瘤作用，可通過抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移，促進細胞凋亡等影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，NO的靶向釋放為抗腫瘤治療提供新思路［3-4］。O2-（2，4-二硝基苯基）1-〔（4-乙氧基羰基）哌嗪-1-基〕重氮-1-1，2-二醇脂（C13H16N6O8，JS-K）是一種有效的NO前藥，是偶氮鎓二醇鹽化合物家族的新型NO供體。它在人體內(nèi)與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione-S-transferase，GST）產(chǎn)生反應(yīng)，在此過程中能夠持續(xù)在細胞內(nèi)釋放NO，而GST通常在腫瘤細胞中過表達［5］。越來越多的證據(jù)表明，JS-K在體外和體內(nèi)均可影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如胃癌、前列腺癌、腎癌和肝癌等［6-9］。

蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）屬于磷酸蛋白磷酸酶（phosphoprotein phosphatase，PPP）家族，包含細胞絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶［10］。多種類型腫瘤的發(fā)生都與PP2A活性降低有關(guān)［11-12］。PP2A作為一種腫瘤抑制因子，通過去磷酸化作用，下調(diào)與腫瘤進展相關(guān)的許多增殖信號通路以及通路中的蛋白質(zhì)表達，如Wnt/β-聯(lián)蛋白，細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）［13-15］。前期研究顯示，NO 供體 JS-K 通過調(diào)節(jié)PP2A活性可誘導(dǎo)細胞凋亡［16］。因此，本研究以人肝癌HepG2細胞為研究對象，觀察JS-K對肝癌細胞凋亡的影響，探索PP2A和PI3K/Akt通路在其中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和主要儀器

人肝癌HepG2細胞，由本實驗中心保存。DMEM高糖培養(yǎng)基（美國Gibco公司），胎牛血清（以色列BI公司），JS-K和小鼠抗人p-PP2A-c單克隆抗體（美國Santa Cruz公司），膜聯(lián)蛋白AnnexinVFITC/PI雙染試劑盒（美國BD公司），MTT（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司），NO清除劑2-（4-羧苯基）-4，4，5，5-四甲基咪唑烷-1-氧-3-氧化鉀（羧基-PTIO）和DAPI染色液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；PI3K抑制劑LY294002、PP2A抑制劑岡田酸（okadaic acid，OA）、兔抗人 PP2A、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of Rapamycin，mTOR）和p-mTOR單克隆抗體（美國Cell Signaling Technology公司），β肌動蛋白和辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）。

Microfuge 20R高速冷凍離心機（美國貝克曼庫爾特公司），Axio Observer 3倒置熒光顯微鏡（德國蔡司公司），電泳儀DYCZ-40D（北京六一科技有限公司）；全波長酶標儀（中國基因有限公司），全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析儀（上海天能科技有限公司），BD Accuri C6流式細胞分析儀（美國BD公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)和處理

將凍存的HepG2細胞復(fù)蘇后用含有10%胎牛血清、青霉素100 IU·mL-1和鏈霉素100 μg·mL-1的DMEM高糖培養(yǎng)基在含5%CO2、37℃濕潤環(huán)境培養(yǎng)至對數(shù)生長期，備用。將細胞隨機分為細胞對照組（只加等量二甲亞砜，終濃度＜0.01%）、JS-K 2.5，5.0 和 10.0 μmol·L-1組、LY294002 10 μmol·L-1組、OA 1 nmol·L-1組、羧基-PTIO 50 μmol·L-1組、JS-K 10.0 μmol·L-1+LY294002 10 μmol·L-1組、JS-K 10.0 μmol·L-1+OA 1 nmol·L-1組和 JS-K 10.0 μmol·L-1+羧基-PTIO 50 μmol·L-1組。以上分組藥物單獨處理細胞24 h，聯(lián)合用藥中LY294002、OA和羧基-PTIO單獨預(yù)處理細胞1 h后加JS-K 10.0 μmol·L-1共同處理24 h。

1.3 DAPl染色檢測細胞凋亡形態(tài)

按1.2分組，將對數(shù)生長期的HepG2細胞接種于48孔細胞板中培養(yǎng)貼壁后，給藥處理24 h后，后用PBS洗滌2次，加適量DAPI染色液，避光孵育5 min后，棄DAPI染色液，PBS洗滌2次，用熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)。

1.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡率

按1.2分組，將HepG2細胞接種于6孔板中，給藥處理24 h，用胰酶消化并收集細胞于離心管內(nèi)，367×g離心5 min后棄去上清，重新懸浮于500 μL緩沖液中。然后加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，在黑暗環(huán)境中放置20 min之后將染色細胞進行流式細胞儀分析，并用Cell Quest軟件計算凋亡率。

1.5 Western印跡法檢測細胞PP2A，Pl3K，Akt和mTOR蛋白磷酸化水平

按1.2分組，藥物處理細胞24 h后，加含有PMSF的蛋白裂解液提取細胞蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，充分變性后用12%SDS-PAGE進行電泳，再將電泳后的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，后用5%脫脂奶粉將膜封閉1 h，一抗（1∶1000）4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min。二抗（1∶3000）37℃室溫孵育1 h后，TBST洗膜3次，每次10 min。用ECL發(fā)光液顯影，采用Image J軟件對蛋白條帶積分吸光度值進行半定量分析。以磷酸化蛋白與總蛋白積分吸光度比值表示蛋白磷酸化水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 JS-K對HepG2細胞形態(tài)的影響

DAPI染色結(jié)果（圖1）顯示，OA 1 nmol·L-1組和羧基-PTIO 50 μmol·L-1組細胞染色質(zhì)和細胞核無明顯形態(tài)上的變化，JS-K 2.5～10.0 μmol·L-1組、LY294002 10 μmol·L-1組、JS-K 10.0 μmol·L-1+LY294002 10 μmol·L-1組、JS-K 10.0 μmol·L-1+OA 1 nmol·L-1組和 JS-K 10.0 μmol·L-1+羧基-PTIO 50 μmol·L-1組出現(xiàn)細胞染色質(zhì)濃縮、核碎裂等凋亡特征的細胞。JS-K 10.0 μmol·L-1+LY294002 10 μmol·L-1組細胞染色質(zhì)濃縮、核碎裂等凋亡特征的細胞數(shù)有所增加，JS-K 10.0 μmol·L-1+OA 1 nmol·L-1組和 JS-K 10.0 μmol·L-1+羧基-PTIO 50 μmol·L-1組細胞染色質(zhì)濃縮、核碎裂等凋亡特征的細胞數(shù)有所減少。

Fig.1 Effect of JS-K on HepG2 cell apoptosis by DAPl staining.HepG2 cells were treated with JS-K 2.5，5.0 and 10.0 μmol·L-1，LY294002 10 μmol·L-1，okadaic acid（OA）1 nmol·L-1，and carboxy-PTIO 50 μmol·L-1alone for 24 h.The cells were pretreated with LY294002 10 μmol·L-1，OA 1 nmol·L-1，or carboxy-PTIO 50 μmol·L-1for 1 h，followed by JS-K 10.0 μmol·L-1for 24 h.1：cell control group；2：JS-K 2.5 μmol·L-1；3：JS-K 5.0 μmol·L-1；4：JS-K 10.0 μmol·L-1；5：LY294002 10 μmol·L-1；6：OA 1 nmol·L-1；7：carboxy-PTIO 50 μmol·L-1；8：JS-K 10.0 μmol·L-1+LY294002 10 μmol·L-1；9：JS-K 10.0 μmol·L-1+OA 1 nmol·L-1；10.JS-K 10.0 μmol·L-1+carboxy-PTIO 50 μmol·L-1.Arrows show the changes of nuclear morphology.

2.2 JS-K對HepG2細胞凋亡率的影響

Annexin V-FITC/PI雙染結(jié)果（圖2）顯示，與細胞對照組比較，OA 1 nmol·L-1組和羧基-PTIO 50 μmol·L-1組細胞凋亡率無明顯變化，JS-K 2.5～10.0 μmol·L-1組、LY294002 10 μmol·L-1組、JS-K 10.0 μmol·L-1+LY294002 10 μmol·L-1組、JS-K 10.0 μmol· L-1+OA 1 nmol· L-1組 和 JS-K 10.0 μmol·L-1+羧基-PTIO 50 μmol·L-1組細胞凋亡率明顯增加（P＜0.01）。與JS-K 10.0 μmol·L-1組比較，JS-K 10.0 μmol·L-1+LY294002 10 μmol·L-1組細胞凋亡率明顯增加（P＜0.05），JS-K 10.0 μmol·L-1+OA 1 nmol·L-1組和 JS-K 10.0 μmol·L-1+羧基-PTIO 50 μmol·L-1組細胞凋亡率明顯下降（P＜0.01）。

Fig.2 Effect of JS-K on apoptotic rate of HepG2 cells by flowcytometry.See Fig.1 for the cell teatement and the legend.B was the quantitative result of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with JS-K 10.0 μmol·L-1 alone group.

2.3 JS-K對HepG2細胞內(nèi)PP2A蛋白磷酸化水平的影響

Western印跡實驗結(jié)果（圖3）顯示，與細胞對照組相比，LY294002 10 μmol·L-1組和羧基-PTIO 50 μmol·L-1組PP2A蛋白磷酸化水平無顯著變化，OA 1 nmol·L-1組PP2A蛋白磷酸化水平顯著升高（P＜0.05），JS-K 2.5～10.0 μmol·L-1組、JS-K 10.0 μmol·L-1+LY294002 10 μmol·L-1組、JS-K 10.0 μmol·L-1+OA 1 nmol·L-1組和 JS-K 10.0 μmol·L-1+羧基-PTIO 50 μmol·L-1組PP2A蛋白磷酸化水平顯著降低（P＜0.01）；與 JS-K 10.0 μmol·L-1組比較，JS-K 10.0 μmol·L-1+OA 1 nmol·L-1組和 JS-K 10.0 μmol·L-1+羧基-PTIO 50 μmo·L-1組 PP2A 蛋白磷酸化水平顯著升高（P＜0.01）。

Fig.3Effect of JS-K on phosphorylation levels of protein phosphatase 2A（PP2A）in HepG2 cells by Western blotting.See Fig.1 for the cell treatment and the leged.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with JS-K 10.0 μmol·L-1alone group.

2.4 JS-K對Pl3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白磷酸化的影響

Western印跡實驗結(jié)果（圖4）顯示，與細胞對照組相比，OA 1 nmol·L-1組和羧基-PTIO 50 μmol·L-1組PI3K，Akt和mTOR蛋白磷酸化水平無顯著變 化，JS-K 2.5～10.0 μmol· L-1組、LY294002 10 μmol· L-1組、JS-K 10.0 μmol· L-1+LY294002 10 μmol·L-1組、JS-K 10.0 μmol·L-1+OA 1 nmol·L-1組和 JS-K 10.0 μmol·L-1+羧基-PTIO 50 μmol·L-1組PI3K，Akt和mTOR蛋白磷酸化水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；與JS-K 10.0 μmol·L-1組比較，JS-K 10.0 μmol· L-1+LY294002 10 μmol· L-1組PI3K、Akt和mTOR蛋白磷酸化水平顯著降低（P＜0.05），JS-K 10.0 μmol·L-1+OA 1 nmol·L-1組和JS-K 10.0 μmol·L-1+羧基-PTIO 50 μmol·L-1組PI3K，Akt和mTOR蛋白磷酸化水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.4 Effect of JS-K on phosphorylation levels of phosphatidylinositol 3-kinase（Pl3K），protein kinase B（Akt）and mammalian target of Rapamycin（mTOR）of HepG2 cells by Western blotting.See Fig.1 for the cell treatment and the legend.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with JS-K 10.0 μmol·L-1alone group.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，NO供體JS-K 2.5～10.0 μmol·L-1可顯著增加HepG2細胞凋亡率，且核碎裂、染色質(zhì)聚集等凋亡特征的細胞數(shù)明顯增加，降低PP2A蛋白磷酸化水平，減少PI3K，Akt和mTOR蛋白磷酸化水平。JS-K 10.0 μmol·L-1與LY294002聯(lián)用，可增強JS-K誘導(dǎo)的HepG2細胞凋亡率，進一步降低PI3K，Akt和mTOR蛋白磷酸化水平。JS-K 10.0 μmol·L-1分別與 OA 1 nmol·L-1和羧基-PTIO 50 μmol·L-1聯(lián)用，可降低JS-K誘導(dǎo)的HepG2細胞凋亡率，PI3K，Akt和mTOR蛋白磷酸化水平升高。

細胞凋亡的抑制或調(diào)節(jié)失控與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密不可分。PP2A是細胞內(nèi)重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，可使已磷酸化的蛋白質(zhì)脫磷酸，從而對細胞內(nèi)眾多信號通路起到重要的調(diào)節(jié)作用。PP2A活性增強可促進細胞凋亡，PP2A活性喪失，則細胞凋亡受阻。在體內(nèi)重要的抗凋亡途徑中，PI3K/Akt途徑的重要成員Akt的活性也受到PP2A的調(diào)節(jié)。PP2A B55α亞基的表達減少導(dǎo)致Akt的激活增加，從而促進腫瘤細胞的生長和增殖；而增強PP2A介導(dǎo)的Akt的脫磷酸化作用，可引起mTOR復(fù)合體1受到抑制，則進一步抑制腫瘤的增殖［17］。本研究結(jié)果顯示，JS-K可顯著增加HepG2細胞凋亡，PI3K抑制劑LY294002和JS-K聯(lián)合處理細胞后，細胞凋亡率顯著增加；但經(jīng)PP2A抑制劑OA或NO清除劑羥基-PTIO處理后，JS-K誘導(dǎo)的HepG2細胞凋亡率明顯減少，具有細胞染色質(zhì)濃縮、核碎裂等凋亡特征的細胞數(shù)也顯著減少。由此提示，JS-K誘導(dǎo)細胞凋亡與其釋放NO、激活PP2A，以及抑制PI3K/Akt有關(guān)。

由于PP2A參與了JS-K誘導(dǎo)的HepG2細胞凋亡，本研究進一步驗證JS-K對HepG2細胞內(nèi)PP2A蛋白磷酸化水平的影響。本研究結(jié)果顯示，JS-K可顯著降低PP2A的磷酸化水平，OA或羥基-PTIO均可減弱JS-K對PP2A蛋白磷酸化水平的降低作用，而LY294002對PP2A蛋白磷酸化水平未見明顯影響。結(jié)果提示，JS-K通過釋放NO而降低細胞內(nèi)PP2A磷酸化水平。在腫瘤細胞中，PP2A通過多種機制失活，包括體細胞突變、磷酸化和（或）催化亞單位C端甲基化，以及通過增加內(nèi)源性PP2A抑制劑的表達；一些如表皮生長因子、胰島素受體的酪氨酸激酶均可使PP2A磷酸化而失活［18］。有研究表明，NO能夠通過影響催化亞基C端尾部的翻譯后修飾提升PP2A活性；NO活性氮引起的PP2A活性增加［19］。本課題組前期研究結(jié)果顯示，JS-K可激活PP2A蛋白，激活活化胱天蛋白酶9/3和活化 PARP［16］。結(jié)合本實驗結(jié)果提示，JS-K引起PP2A的激活與其降低磷酸化PP2A水平有關(guān)。

本研究隨后通過加入PI3K抑制劑、PP2A抑制劑和NO清除劑來進一步探討PI3K/Akt、PP2A和NO間的關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，JS-K可顯著降低PI3K，Akt和mTOR蛋白磷酸化水平，LY294002處理后可顯著增強JS-K對PI3K/Akt通路的抑制，而OA或羥基-PTIO處理后則減弱了JS-K對PI3K/Akt通路的抑制，使PI3K，Akt和mTOR蛋白磷酸化水平升高。一些新型化合物可通過抑制PP2A/Akt途徑在卵巢癌細胞中誘導(dǎo)線粒體途徑凋亡［20］。劉雪文等［21］發(fā)現(xiàn)，活性化合物重樓皂苷G可通過激活PP2A而抑制Akt信號通路，從而抑制淋巴瘤細胞生長并促進凋亡及自噬。因此，通過影響PP2A/Akt通路是一種有效的抗腫瘤方法。結(jié)合上述研究報道提示，JS-K降低PI3K/Akt/mTOR通路蛋白磷酸化水平與其釋放NO激活PP2A有關(guān)。

綜上所述，NO供體JS-K可通過在HepG2細胞內(nèi)釋放NO，激活PP2A，降低PI3K/Akt/mTOR通路蛋白磷酸化水平，誘導(dǎo)細胞凋亡。這為進一步研究NO在腫瘤調(diào)控中的作用提供了重要的理論基礎(chǔ)，更為NO供體型藥物的開發(fā)和利用提供了一定的理論依據(jù)。