黃子粵，劉文君，覃仁柳，龐師嬋，肖健，楊尚東?

1廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院/植物科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，南寧 530004；2廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，南寧 530007

0 引言

【研究意義】南瓜（Cucurbita moschata Duchesne）又稱番瓜、金瓜、倭瓜等，為葫蘆科一年生蔓性草本植物，是我國(guó)重要蔬菜作物之一。南瓜富含多糖、維生素和人體必需氨基酸、β-胡蘿卜素、蛋白質(zhì)、鈣、鐵、磷微量元素等營(yíng)養(yǎng)成分，具有良好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能[1]。南瓜產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)日益受到世界發(fā)達(dá)國(guó)家的重視，已被公認(rèn)為特效保健食品之一，具有廣闊的開(kāi)發(fā)利用前景。我國(guó)地域遼闊，南瓜作物資源、類型豐富多樣，但南瓜作物的育種研究工作長(zhǎng)期以來(lái)未能得到相應(yīng)的重視，缺乏系統(tǒng)深入的研究[2]。目前南瓜育種主要以生物技術(shù)為優(yōu)勢(shì)手段，如體細(xì)胞變異體離體篩選技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、分子標(biāo)記輔助育種等，但南瓜育種基礎(chǔ)研究相對(duì)薄弱，已成為當(dāng)前制約南瓜育種工作快速發(fā)展的瓶頸之一。植物內(nèi)生細(xì)菌（endophytic bacteria）是指能在健康植物組織內(nèi)棲居，但對(duì)植物不造成實(shí)質(zhì)性的危害并與植物建立了和諧（compatible association）關(guān)系的細(xì)菌；其包含一生或一生的某一階段生活在植物體內(nèi)的一類細(xì)菌[3]。內(nèi)生菌是植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在自然界長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中，內(nèi)生菌與寄主相互選擇，互相影響，形成互惠共生或者寄生的關(guān)系，且兩種關(guān)系在一定條件下可以相互轉(zhuǎn)換。近年來(lái)，已有針對(duì)同一作物不同品種間的內(nèi)生細(xì)菌多樣性與群落結(jié)構(gòu)特征的研究，如古麗尼沙·沙依木等[4]發(fā)現(xiàn)不同品種蘋(píng)果樹(shù)內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性較為豐富，種群組成與功能存在較大差異。開(kāi)展不同品種南瓜內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性分析，不僅有助于揭示不同品種南瓜內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征，而且對(duì)挖掘利用有益內(nèi)生細(xì)菌功能菌株，及開(kāi)拓南瓜輔助育種新方向具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】研究表明，植物內(nèi)生細(xì)菌可與植物結(jié)瘤固氮，促進(jìn)植物合成多種生長(zhǎng)激素助于生長(zhǎng)，產(chǎn)生抗生素類物質(zhì)增加植物的抗病性，以及促進(jìn)植物對(duì)多種礦質(zhì)元素的吸收，對(duì)宿主植物具有廣泛有益的生物學(xué)作用[5-7]。植物內(nèi)生細(xì)菌遺傳多樣性是由基因型和外部生長(zhǎng)環(huán)境等多種因素共同決定的[8]。近年來(lái)，已有研究表明不同種植物內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在很大差異，同一品種植物內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也有所不同。ZHANG等[9]發(fā)現(xiàn)不同基因型水稻種子內(nèi)的內(nèi)生細(xì)菌群落組成雖然不存在顯著差異，但內(nèi)生細(xì)菌的分布有明顯差異，特別是優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬。LAMIT等[10]研究也顯示窄葉楊基因型影響其嫩枝內(nèi)生真菌豐度以及群落組成。HARDOIM 等[11]的研究表明基因型在很大程度上決定了不同水稻品種內(nèi)生細(xì)菌群落的組成。【本研究切入點(diǎn)】雖然目前不同作物內(nèi)生細(xì)菌多樣性與群落結(jié)構(gòu)特征有研究，但缺少針對(duì)南瓜莖內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以不同品種南瓜作為研究對(duì)象，分析植株莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)特征，并進(jìn)行相關(guān)的基因功能預(yù)測(cè)；探究不同南瓜莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成差異及功能，旨在開(kāi)發(fā)和利用南瓜內(nèi)生細(xì)菌資源的同時(shí)，為構(gòu)建南瓜新品種選育評(píng)價(jià)新體系提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集和處理

南瓜育苗時(shí)間為2019年8月，9月上旬定植于南寧市廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院里建科學(xué)研究基地（108°02′ E，23°14′N）。2019年12月采集不同品種、無(wú)明顯病狀、生長(zhǎng)性狀良好的南瓜健康植株（表1）相同節(jié)位的莖段樣品，每個(gè)品種隨機(jī)采集3株。采集后裝于經(jīng)滅菌處理的密封采樣袋中，低溫冷凍送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行PCR擴(kuò)增并利用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序分析。

表1 不同品種南瓜品質(zhì)特征Table 1 Quality characters of different pumpkin varieties

1.2 內(nèi)生細(xì)菌多樣性分析

內(nèi)生細(xì)菌多樣性分析，由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司基于MiSeq[12]平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序類型與引物序列見(jiàn)表2。

表2 引物名稱及序列Table 2 The primer name and sequence

DNA抽提和PCR擴(kuò)增流程：根據(jù)E.Z.N.A.? soil DNA kit（Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行微生物群落總DNA抽提，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的提取質(zhì)量，使用NanoDrop2000測(cè)定DNA 濃度和純度；使用 799F（5′-AACMGGATTAGAT ACCCKG-3′）對(duì)16S rRNA基因V5—V7可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序如下：95℃預(yù)變性3 min，27個(gè)循環(huán)（95℃ 變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 30 s），然后72℃穩(wěn)定延伸10 min，最后在4℃進(jìn)行保存（PCR儀：ABI GeneAmp? 9700型）。PCR反應(yīng)體系為：5×TransStart FastPfu 緩沖液 4 μL，2.5mmol·L-1dNTPs 2 μL，上、下游引物（5 μmol·L-1）各 0.8 μL，TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，補(bǔ)足至20 μL。每個(gè)樣本3次重復(fù)。

Illumina Miseq測(cè)序流程：將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后使用 2%瓊脂糖凝膠回收 PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences,Union City, CA, USA）進(jìn)行回收和產(chǎn)物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用 Quantus? Fluorometer（Promega,USA）對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行定量檢測(cè)。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit進(jìn)行建庫(kù)：（1）接頭鏈接；（2）使用磁珠篩選去除接頭自連片段；（3）利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫(kù)模板的富集；（4）磁珠回收PCR產(chǎn)物得到最終文庫(kù)。利用Illumina公司的Miseq PE250平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

原始數(shù)據(jù)上傳到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較。本研究選用ACE指數(shù)、Chao指數(shù)、Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)表征不同品種南瓜內(nèi)生細(xì)菌豐富度和多樣性。其中，ACE指數(shù)和Chao指數(shù)表示物種的豐富度；Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)用于估算樣本中細(xì)菌多樣性；不同指數(shù)的計(jì)算方法和結(jié)果均基于上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的 I-sanger云數(shù)據(jù)分析平臺(tái)（www.majorbio.com）進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)分析與處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2019和IBM SPSS Statistics 21統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并利用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司提供的數(shù)據(jù)分析平臺(tái) I-Sanger進(jìn)行多樣性在線分析；同時(shí)構(gòu)建物種群落豐度柱狀圖及OTU水平物種組成Venn圖，分析內(nèi)生細(xì)菌門(mén)、屬分類水平的群落多樣性，以及不同品種南瓜莖內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群占比，同時(shí)基于 I-sanger云數(shù)據(jù)分析平臺(tái)進(jìn)行PICRUSt基因功能預(yù)測(cè)。數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）”表示。

2 結(jié)果

2.1 不同品種南瓜內(nèi)生細(xì)菌多樣性分析

覆蓋率（Coverage）指數(shù)越高，則說(shuō)明樣本中序列被測(cè)出的概率越高，而沒(méi)有被測(cè)出的概率越低[13]。由表3可知，樣品分析覆蓋率均達(dá)到99%，表明文中分析數(shù)據(jù)真實(shí)可信。5個(gè)不同品種南瓜莖部中內(nèi)生細(xì)菌多樣性Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)在不同品種南瓜莖部中均無(wú)顯著差異；同時(shí)，豐富度Chao1和Ace指數(shù)在5個(gè)不同南瓜品種中也不存在顯著差異（表3）。這一結(jié)果表明栽植于相同環(huán)境條件下，不同品種南瓜莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌多樣性和豐富度基本一致。由此推測(cè)，同一種作物不同品種間，植株內(nèi)生細(xì)菌多樣性和豐富度受環(huán)境的支配可能大于品種自身的影響。

表3 不同品種南瓜莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)Table 3 Alpha diversity index of endophytic bacteria in terms of different pumkin varieties

2.2 不同品種南瓜內(nèi)生細(xì)菌群落歸類分析

5個(gè)不同品種南瓜莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌分類水平上，共獲得18個(gè)門(mén)，30個(gè)綱，101個(gè)目，199個(gè)科，362個(gè)屬，567個(gè)種和863個(gè)OTU（表4）。本研究中南瓜作物共有的內(nèi)生細(xì)菌OTU數(shù)目為369，不同品種南瓜莖部特有的內(nèi)生細(xì)菌OTU數(shù)目存在一定差異；其中，‘桂豐 7 號(hào)’‘桂豐 8號(hào)’、雜交 F1代（G1519×G1511）、G1519、G1511品種莖部特有的內(nèi)生細(xì)菌OTU數(shù)目分別為21、21、25、15和22；雜交F1代的屬、種及OTU數(shù)目均高于父母本（G1519和G1511）（圖 1）。由此可知，相同生長(zhǎng)環(huán)境條件下，不同品種南瓜莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌基于不同分類水平均存在數(shù)量上的差異。

表4 不同品種南瓜莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌物種豐富度統(tǒng)計(jì)表Table 4 Statistical table of species abundance of different pumpkin varieties

2.3 不同品種南瓜內(nèi)生細(xì)菌群落門(mén)分類水平

基于門(mén)分類水平發(fā)現(xiàn)（圖 2），不同品種南瓜莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌共有的優(yōu)勢(shì)門(mén)類數(shù)量?jī)H為3個(gè)，分別為變形菌門(mén)（Proteobacteria）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）和厚壁菌門(mén)（Firmicutes）。其中，變形菌門(mén)（Proteobacteria）是5個(gè)不同品種南瓜莖部最主要的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)類，達(dá)63.49%—76.55%；其次分別為放線菌門(mén)（Actinobacteria，14.55%—32.28%）；厚壁菌門(mén)（Firmicutes，2.10%—4.51%）；擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）細(xì)菌雖然是‘桂豐 7號(hào)’‘桂豐 8號(hào)’以及雜交 F1代（G1519×G1511）和G1511品種南瓜的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，占比分別達(dá)1.46%、2.47%、1.64%和1.06%，但在G1519品種中占比低于1%，表明該細(xì)菌門(mén)類在G1519品種莖部屬于非優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌門(mén)類；此外，衣原體門(mén)（Chlamydiae）細(xì)菌僅作為‘桂豐8號(hào)’南瓜莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)門(mén)類，占比2.27%，而在其他4個(gè)品種南瓜中占比均低于1%（表5）。

表5 優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)分類水平豐度占比Table 5 Percent of dominant bacterial community on Phylum level

針對(duì)父母本（G1519和G1511）與其雜交F1代的門(mén)分類水平豐度占比分析，F(xiàn)1的厚壁菌門(mén)（Firmicutes）相對(duì)G1519（2.81%）和G1511（2.10%）較高，達(dá)到了4.51%；擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）在G1519中基本無(wú)分布，但在G1511和雜交F1代中占比均超過(guò)了1%；衣原體門(mén)（Chlamydiae）在父母本和F1中均無(wú)分布。上述結(jié)果表明，不同品種南瓜莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌門(mén)分類水平結(jié)構(gòu)組成相似，不同門(mén)類細(xì)菌豐度占比存在明顯差異。雜交品種與父母本品種的門(mén)分類水平優(yōu)勢(shì)內(nèi)生菌屬組成及占比基本相同，可推測(cè)不同種類內(nèi)生菌的聚集與作物品種之間存在關(guān)聯(lián)。

2.4 不同品種南瓜莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌屬分類水平

屬分類水平分析發(fā)現(xiàn)（圖3），不同品種南瓜莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌群落組成占比大于 1%的共有優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬有假單胞菌屬（Pseudomonas）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）、劍菌屬（Ensifer）、德沃斯氏菌屬（Devosia）、苯基桿菌（Phenylobacterium）、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）、鏈霉菌屬（Streptomyces）等 13個(gè)優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬。其中，假單胞菌屬（Pseudomonas）是 5個(gè)不同品種南瓜莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌群落組成中占比最高的菌屬，其占比在‘桂豐7號(hào)’‘桂豐8號(hào)’、雜交F1代、G1519、G1511品種中分別達(dá)26.86%、33.02%、19.45%、12.93%和25.88%；其次占比在前5位的共有優(yōu)勢(shì)菌屬分別為分支桿菌屬（Mycobacterium）、Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium、劍菌屬（Ensifer）、unclassified_f__Rhizobiaceae、德沃斯氏菌屬（Devosia）（表6）。

表6 細(xì)菌屬分類水平結(jié)構(gòu)占比Table 6 Percent of dominant community on Genus level of bacteria

此外，糖霉菌屬（Glycomyces）、Candidatus_Rubidus和Actinokineospora細(xì)菌僅是‘桂豐7號(hào)’南瓜特有的優(yōu)勢(shì)菌屬；纖發(fā)菌屬（Methylibium）細(xì)菌僅是G1519南瓜的特有優(yōu)勢(shì)菌屬。同時(shí)，就雜交F1屬分類水平上的優(yōu)勢(shì)菌屬進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)F1的內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬占比介于父母本（G1519和G1511）優(yōu)勢(shì)菌屬占比之間；父母本樣品中均無(wú)分布的菌屬如糖霉菌屬（Glycomyces）、Candidatus_Rubidus和Actinokineospora在雜交F1代的植株莖部中同樣未被檢測(cè)到。上述結(jié)果表明，內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬組成及豐度隨南瓜品種的不同而異，雜交品種內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)組成占比與父母本之間無(wú)明顯差異?！鹭S7號(hào)’香芋南瓜莖部中特有的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生菌屬數(shù)量均高于其余4個(gè)南瓜品種；另一方面，‘桂豐7號(hào)’南瓜的可溶性固形物和維生素C含量均顯著高于其余4個(gè)南瓜品種；可溶性蛋白含量雖然與‘桂豐8號(hào)’和G1511間無(wú)顯著差異，但顯著高于相應(yīng)的雜交F1代和G1519（表1）。由此推測(cè)，更為多樣的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬可能是相同生長(zhǎng)環(huán)境下，‘桂豐7號(hào)’南瓜可溶性固形物和維生素C含量顯著高于其他4個(gè)品種的重要原因之一；糖霉菌屬（Glycomyces）、Candidatus_Rubidus和Actinokineospora屬細(xì)菌有望作為提高南瓜品質(zhì)的備選有益功能菌屬，以及作為南瓜品質(zhì)評(píng)價(jià)的敏感生物學(xué)指標(biāo)。

2.5 PICRUSt功能預(yù)測(cè)

PICRUSt是基于比對(duì)微生物群落的豐富度與數(shù)據(jù)庫(kù)，從而在不可觀測(cè)的情況下推測(cè)出生物群落的功能信息[14]。基于高通量測(cè)序技術(shù)和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)5個(gè)不同品種南瓜莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌在一級(jí)功能層共包含6類生物代謝通路（圖4），即：代謝、環(huán)境信息處理、細(xì)胞過(guò)程、遺傳信息處理、人類疾病和有機(jī)系統(tǒng)。其中，代謝通路為5個(gè)不同南瓜品種的主要功能組成，占比分別為 67.46%、65.45%、67.43%、66.44%和67.66%（表7）。

表7 預(yù)測(cè)功能基因在不同樣品間的占比（一級(jí)功能層）Table 7 The proportion of predicted functional profiles in different pumpkin samples (Pathway level 1)

同時(shí)，針對(duì)不同品種南瓜莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌基因二級(jí)功能層進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同品種南瓜莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌基因二級(jí)功能層主要由發(fā)育、感官系統(tǒng)、信號(hào)分子和相互作用、細(xì)胞群落-真核生物、排泄系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等46個(gè)子功能組成（圖5）。

其中，‘桂豐7號(hào)’南瓜的能量代謝、類脂化合物代謝作用、碳水化合物代謝、氨基酸代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、其他氨基酸的代謝、翻譯、輔助因子和維生素的代謝等37個(gè)二級(jí)功能層預(yù)測(cè)基因拷貝數(shù)均為5個(gè)品種中最多；細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、循環(huán)系統(tǒng)和感染性疾病方面，病毒性的預(yù)測(cè)基因拷貝數(shù)最多的品種為‘桂豐8號(hào)’；信號(hào)分子和相互作用及發(fā)育的預(yù)測(cè)基因拷貝數(shù)最多的品種為雜交 F1代（G1519×G1511）；細(xì)胞生長(zhǎng)和死亡與環(huán)境適應(yīng)的預(yù)測(cè)基因拷貝數(shù)最多的是G1519；消化系統(tǒng)的預(yù)測(cè)基因拷貝數(shù)最多的品種為G1511。

此外，46個(gè)子功能組成中，除感官系統(tǒng)、信號(hào)分子和相互作用、發(fā)育（Development）、感染性疾病:病毒性和細(xì)胞群落-真核生物之外，雜交 F1代莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌的預(yù)測(cè)基因拷貝數(shù)均最低。由以上結(jié)果可知，雖然不同品種南瓜莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌基因二級(jí)功能層預(yù)測(cè)基因種類基本無(wú)差異，但基因拷貝數(shù)卻因品種不同而異?！鹭S7號(hào)’南瓜的可溶性固形物、Vc、可溶性蛋白和淀粉含量均表現(xiàn)為5個(gè)品種中最高（表1）；其莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌功能基因的碳水化合物代謝、氨基酸代謝和輔助因子和維生素代謝的基因拷貝數(shù)均為5個(gè)南瓜品種中表現(xiàn)最高。由此推測(cè)，同種作物不同品種間，不同群落組成和豐度的植株內(nèi)生細(xì)菌發(fā)揮各自的功能基因影響南瓜植株內(nèi)部的合成代謝途徑，從而形成了不同品種南瓜即使栽植生長(zhǎng)于相同的環(huán)境條件，也形成其相異品質(zhì)果實(shí)的現(xiàn)象。

表8 部分預(yù)測(cè)功能基因在不同樣品間的占比（二級(jí)功能層）Table 8 The proportion of some predicted functional profiles in different samples (Pathway level 2)

3 討論

3.1 不同品種南瓜內(nèi)生細(xì)菌豐富度與多樣性

植物內(nèi)生菌廣泛存在于植物的各組織和器官中，表現(xiàn)豐富的物種與群落多樣性，是植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，對(duì)宿主植物的生長(zhǎng)和健康均起著重要的作用[15-16]。內(nèi)生菌的群落多樣性不僅取決于宿主植物基因型和內(nèi)生菌種類，還與地理位置、氣候條件、土壤類型、養(yǎng)分脅迫、光溫、雨水、空氣濕度等環(huán)境因素緊密相關(guān)[17]。本研究基于高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì) 5個(gè)不同品種南瓜莖部的內(nèi)生細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)相同環(huán)境條件下栽培的不同品種南瓜莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌多樣性和豐富度基本一致。高增貴等[18]通過(guò)對(duì)不同玉米品種在不同生長(zhǎng)期內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)其種類和數(shù)量均存在差異；劉洋等[19]研究超級(jí)雜交水稻種子內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其多樣性時(shí)，得到水稻種子基因型對(duì)其內(nèi)生細(xì)菌的豐度及多樣性具有一定影響的結(jié)論；劉波等[20]探究不同品種水稻莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與其品種特性是否存在關(guān)聯(lián)的過(guò)程中，觀察發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌含量與穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒重、理論畝產(chǎn)存在極顯著正相關(guān)，而與水稻有效穗呈負(fù)相關(guān)；吳燕燕等[21]調(diào)查了 4個(gè)不同品種果桑植株內(nèi)生菌多樣性特征后，發(fā)現(xiàn)各品種桑樹(shù)內(nèi)生細(xì)菌多樣性特征存在較大差異；馬冠華和肖崇光[22]在針對(duì)不同品種和不同生長(zhǎng)時(shí)期的煙草內(nèi)生細(xì)菌類群做了初步分析后，指出不同煙草品種中的內(nèi)生細(xì)菌種群不盡相同，內(nèi)生細(xì)菌種群會(huì)隨著植株生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的不同而發(fā)生變化。內(nèi)生細(xì)菌菌群密度在不同品種煙草葉片中不盡相同，可能與內(nèi)生細(xì)菌對(duì)宿主的選擇性有關(guān)，煙草內(nèi)生細(xì)菌與煙草共生關(guān)系的形成是長(zhǎng)期自然選擇的結(jié)果[23]。以上研究均表明相同栽培條件下，同種作物不同品種間的內(nèi)生細(xì)菌多樣性特征隨著植株自身基因型呈現(xiàn)差異。本研究結(jié)果與上述水稻、煙草和桑樹(shù)植株內(nèi)生細(xì)菌多樣性研究的結(jié)果不一致，這一現(xiàn)象可能與作物的科屬有關(guān)，水稻、煙草和桑樹(shù)分別屬于禾本科、茄科和?？谱魑?，而南瓜屬于葫蘆科作物，具體原因有待進(jìn)一步探討。另外，本研究發(fā)現(xiàn)在相同環(huán)境條件下生長(zhǎng)的不同品種南瓜莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌基于不同分類水平均存在數(shù)量上的差異。由此推測(cè)，雖然不同品種南瓜莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌多樣性和豐富度受環(huán)境的影響可能大于品種，但內(nèi)生細(xì)菌不同分類水平數(shù)量以及特有的細(xì)菌OTU數(shù)量仍根據(jù)品種的不同而異，而且雜交品種相較于父母本更能富集多種內(nèi)生菌群落。

3.2 不同品種南瓜內(nèi)生細(xì)菌門(mén)屬水平優(yōu)勢(shì)菌群

變形菌門(mén)（Proteobacteria）細(xì)菌是5個(gè)品種南瓜莖部中豐度最高的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，占比均達(dá)60%以上，其次分別是放線菌門(mén)和厚壁菌門(mén)。變形菌門(mén)細(xì)菌是植物內(nèi)生細(xì)菌中最為普遍的一個(gè)門(mén)類，本研究結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致[24-25]。變形菌門(mén)細(xì)菌包括許多負(fù)責(zé)固氮的物種，影響植物對(duì)疾病的易感性[26]。放線菌是生物活性化合物的常見(jiàn)生產(chǎn)者，天然抗生素的重要來(lái)源之一，在植物中廣泛存在[27-30]。長(zhǎng)期的進(jìn)化讓內(nèi)生放線菌與植物形成了密切關(guān)系。在抵御逆境、抵抗病蟲(chóng)害侵襲與促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)過(guò)程中，內(nèi)生放線菌均發(fā)揮著不可替代的作用[31-36]。厚壁菌門(mén)細(xì)菌也是一類極為重要的微生物資源，在固氮、降解土壤中難溶化合物，并通過(guò)抑制病原微生物群，選擇植物有益微生物防治植物病蟲(chóng)害等方面均發(fā)揮重要的作用[37-40]。微生物類群的豐富度和多樣性對(duì)維持植物生長(zhǎng)健康至關(guān)重要。本研究中，南瓜植株莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)門(mén)類與多數(shù)作物相似，且與品種無(wú)關(guān)，證實(shí)了內(nèi)生細(xì)菌與宿主作物相互依存與共生的友好關(guān)系。

此外，假單胞菌屬（Pseudomonas）細(xì)菌均是 5個(gè)品種南瓜植株中占比最高的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬。這一結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致[41]。假單胞菌屬細(xì)菌是一種具有促進(jìn)磷吸收和植物生長(zhǎng)的生防菌[42]，在干旱脅迫條件下，一些假單胞菌株可通過(guò)產(chǎn)生胞外多糖保護(hù)細(xì)菌免受水分威脅[43]。SANDHYA等[44]在篩選分離有效的適應(yīng)脅迫的植物生長(zhǎng)促進(jìn)菌（PGPR）時(shí)發(fā)現(xiàn)，接種假單胞菌可提高植物脯氨酸、氨基酸和可溶性糖的含量，減輕干旱對(duì)植株造成的傷害，從而提高植物的抗性。本研究也發(fā)現(xiàn)南瓜果實(shí)可溶性固形物含量高的品種，其假單胞菌屬內(nèi)生細(xì)菌的豐度占比相對(duì)較高。

‘桂豐7號(hào)’香芋南瓜除了擁有與其余4個(gè)品種南瓜共有的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生菌屬外，糖霉菌屬、Candidatus_Rubidus和Actinokineospora等菌屬均為其特有的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬；其中，糖霉菌屬細(xì)菌分離自土壤或藥用植物，絕大部分菌屬均分離自普通環(huán)境，只有Glycomyces halotolerans分離自極端特殊環(huán)境，并且研究表明該屬可耐受10%鹽濃度[45-47]；Actinokineospora在自然界中則是與土壤和植物凋落物密切相關(guān)[48]。更為多樣的特有優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬，可能是‘桂豐7號(hào)’香芋南瓜果實(shí)中可溶性固形物、Vc以及淀粉含量顯著高于其余4個(gè)品種南瓜的原因之一。其中，特有優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬的促生功能及其與南瓜品質(zhì)的相關(guān)性，有待進(jìn)一步的證實(shí)。

3.3 不同品種南瓜內(nèi)生細(xì)菌基因一、二級(jí)功能層預(yù)測(cè)分析

近年來(lái)，基于高通量測(cè)序技術(shù)分析植物內(nèi)生細(xì)菌的研究主要集中在細(xì)菌的多樣性和群落結(jié)構(gòu)[49-52]分析上，針對(duì)細(xì)菌的有益功能研究相對(duì)較少。本研究基于MiSeq高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行PICRUSt功能預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，不同品種南瓜莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌基因功能主要涉及代謝、遺傳信息處理等6個(gè)一級(jí)功能代謝通路以及能量代謝、類脂化合物代謝作用、碳水化合物代謝、氨基酸代謝等46個(gè)二級(jí)功能層。并發(fā)現(xiàn)5個(gè)品種南瓜中，‘桂豐7號(hào)’香芋南瓜莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌的碳水化合物代謝、氨基酸代謝、輔助因子和維生素代謝等37個(gè)二級(jí)功能層預(yù)測(cè)基因拷貝數(shù)最多。眾所周知，碳水化合物是植物生長(zhǎng)的基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并與果實(shí)品質(zhì)的形成密切相關(guān)[53-54]；維生素C是植物代謝過(guò)程不可缺少的產(chǎn)物，參與體內(nèi)活性氧清除，調(diào)控細(xì)胞分裂和細(xì)胞生長(zhǎng)等多種生理過(guò)程[55-57]；另一方面，氨基酸是蛋白質(zhì)合成的基礎(chǔ)，環(huán)境脅迫下植物體內(nèi)的游離氨基酸代謝可以對(duì)植物的抗逆性起到指示作用[58]。本研究發(fā)現(xiàn)‘桂豐7號(hào)’香芋南瓜莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌二級(jí)功能層中，碳水化合物代謝、氨基酸代謝、輔助因子和維生素的代謝預(yù)測(cè)基因拷貝數(shù)最多，對(duì)應(yīng)的果實(shí)中可溶性固形物、Vc和可溶性蛋白含量也最高。由此推測(cè)，不同品種植株中，由于其各異的內(nèi)生細(xì)菌組成與豐度而形成的相異功能基因，影響著植株體內(nèi)諸如碳水化合物、維生素以及氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝途徑，從而表現(xiàn)出相同生長(zhǎng)環(huán)境條件下，不同品種果實(shí)品質(zhì)相異的現(xiàn)象。鑒于PICRUSt功能預(yù)測(cè)的局限性，諸多內(nèi)生細(xì)菌的基因功能尚不清楚，有待進(jìn)一步探究。

植株內(nèi)部微環(huán)境共生的內(nèi)生微生物不僅影響植物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收與循環(huán)，還關(guān)系著植物的健康與存活。目前研究已發(fā)現(xiàn)，不同基因型影響著植株內(nèi)生微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)與組成[59-61]。這一現(xiàn)象也表明，隨著分析技術(shù)的發(fā)展和涉及微生物分類及功能數(shù)據(jù)庫(kù)的完善，內(nèi)生微生物群落結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測(cè)有望作為作物育種和開(kāi)發(fā)過(guò)程中的一個(gè)常規(guī)評(píng)價(jià)指標(biāo)或縮短作物育種周期的有效技術(shù)指標(biāo)。

4 結(jié)論

相同環(huán)境條件下，5個(gè)不同品種南瓜莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌多樣性（Shannon和Simpson）和豐富度（Chao1和Ace）指數(shù)無(wú)顯著差異，表明環(huán)境條件對(duì)南瓜植株內(nèi)生細(xì)菌多樣性和豐富度的影響高于品種間的影響；優(yōu)良的雜交品種具有富集內(nèi)生細(xì)菌的趨勢(shì)，不同品質(zhì)南瓜植株具有相異的內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。不同品種南瓜莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌群落組成相似，但豐度占比存在明顯差異；雜交品種內(nèi)生菌群落豐度占比與父本和母本之間均無(wú)顯著差異；變形菌門(mén)、放線菌門(mén)和厚壁菌門(mén)是 5個(gè)品種南瓜共有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)類。5個(gè)品種南瓜莖部?jī)?nèi)生細(xì)菌基因功能主要涉及代謝、環(huán)境信息處理、細(xì)胞過(guò)程、遺傳信息處理、人類疾病和有機(jī)系統(tǒng)6個(gè)生物一級(jí)功能層代謝通路，以及氨基酸代謝、轉(zhuǎn)錄、信號(hào)分子和相互作用等46個(gè)二級(jí)功能層代謝通路。假單胞菌屬（Pseudomonas）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）、劍菌屬（Ensifer）、德沃斯氏菌屬（Devosia）等 13個(gè)菌屬是5個(gè)不同品種南瓜莖部的共有優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬；糖霉菌屬（Glycomyces）、Candidatus_Rubidus屬和Actinokineospora屬是高品質(zhì)南瓜—‘桂豐7號(hào)’莖部特有的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌屬，有望作為提高南瓜品質(zhì)的備選有益功能菌屬，以及品質(zhì)評(píng)價(jià)的敏感生物學(xué)指標(biāo)。