劉永駿 ，王 穎 ，楊 眉 ，殷娥高 ，李 婷 ，董昭興

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥科一病區(qū)，云南 昆明 650101；2）云南師范大學(xué)校醫(yī)院，云南 昆明 650101；3）中國科學(xué)院大學(xué)寧波華美醫(yī)院，浙江 寧波 315000）

百草枯（paraquat，PQ）是一種全世界廣泛使用的廉價、有效且對環(huán)境無害的非選擇性除草劑，同時也是一種口服攝入致死率極高的毒藥[1]。PQ攝入后通過多胺轉(zhuǎn)運系統(tǒng)選擇性的在肺組織中聚集，通過炎性細(xì)胞浸潤、氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化等多種機制導(dǎo)致急性肺損傷和肺纖維化，最終導(dǎo)致患者死亡。盡管口服PQ中毒致死率超過90%，但目前尚無特效的治療辦法[2-3]。

肺纖維化是由多種原因?qū)е碌姆闻萆掀ぜ?xì)胞持續(xù)性損傷、肺泡異常修復(fù)以及細(xì)胞外基質(zhì)沉積所導(dǎo)致[4]。自噬是機體維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵，研究發(fā)現(xiàn)自噬可以保護肺泡上皮細(xì)胞免受博萊霉素誘導(dǎo)的應(yīng)激和凋亡，并調(diào)節(jié)炎癥[5]，相反自噬不足可加速肺泡上皮細(xì)胞衰老，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成細(xì)胞分化，促進肺纖維化的形成[6]。

分子氫因其可以迅速擴散到組織和細(xì)胞中發(fā)揮出強大的抗氧化、抗炎、抗凋亡作用，已被廣泛運用到多種疾病的治療中[7]。最近有多項研究報道了分子氫可以通過調(diào)控自噬來發(fā)揮對疾病的治療作用，但分子氫對自噬的調(diào)控作用尚無統(tǒng)一認(rèn)識[8-11]。氫分子可以通過多種方式予以給藥，包括吸入氫氣、飲用氫氣水，氫生理鹽水腹腔注射等方式被廣泛用于動物研究[12-13]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)了氫氣水可以通過調(diào)節(jié)Nrf2（nuclear factor-erythroid 2 related factor）發(fā)揮抗氧化作用從而減輕了肺纖維化[14]，但前期研究僅在體外實驗中進行驗證，暫無體內(nèi)實驗支持，并且對于氫氣水治療肺纖維化作用的機制研究尚不足。

本研究旨在通過觀察氫氣水作用于PQ中毒的肺纖維化大鼠模型中自噬的變化，進一步通過體內(nèi)實驗驗證氫氣水對于肺纖維化的治療作用，并且解釋氫氣水治療PQ所致肺纖維化的可能機制，為治療PQ所致肺纖維化開辟新的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑

本試驗采用6～8周的雄性SD大鼠50只，體重（230 ± 30）g，飼養(yǎng)于22～24 ℃環(huán)境中，自由飲食飲水，光照周期為12 h。本實驗SD大鼠均由昆明動物研究所[許可證號：SCXK（滇）2016-0001]購買，經(jīng)動物倫理審查通過后，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

主要試劑：百草枯（江蘇省先正達南通保護有限公司）、雷帕霉素（美國 Sigma公司）、使用制氫設(shè)備將氫氣在高壓（0.4 Mpa）下溶解于0.9%的鹽水中至飽和。4 ℃下滅菌保存于鋁袋中以備用，每周重新制備1次，確保濃度保持在0.6 mmol/L。一抗LC3、p62抗體（美國Proteintech公司）、βactin內(nèi)參抗體、鼠/兔二抗（中國萬類生物公司）、PCR 引物（中國擎科生物科技有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物模型建立及分組（1）百草枯中毒大鼠模型建立方法：將SD大鼠頸部固定，暴露腹部，持灌胃針進入大鼠口腔，順著上顎到達食管，沿食管垂直進針3～4 cm，確定灌胃針進入大鼠胃部后根據(jù)分組給予不同處理。灌胃操作完成后，密切觀察大鼠有無呼吸困難、嘔吐等癥狀。灌胃1 h后根據(jù)不同分組進行相應(yīng)的藥物處理，在模型建立第28天處死大鼠，取大鼠肺組織標(biāo)本。由于百草枯毒性較大，死亡的大鼠需補齊至每組10只，處理方法同前。（2）將50只大鼠禁食10 h后，隨機的分為5組，每組10只大鼠。對照組：予等體積蒸餾水一次性灌胃；PQ染毒組：予百草枯50 mg/kg一次性灌胃；雷帕霉素治療組：予百草枯50 mg/Kg一次性灌胃并予雷帕霉素4 mg/（kg·d）腹腔注射；氫氣水治療組：予百草枯50 mg/Kg一次性灌胃并予氫氣水10 mL/（kg·d）腹腔注射；綜合治療組：予百草枯50 mg/kg一次性灌胃并予雷帕霉素4 mg/（kg·d）腹腔注射，間隔30 min后再次給予氫氣水10 mL/（kg·d）腹腔注射。

1.2.2 蘇木精-伊紅染色（HE染色）評定肺纖維化程度取大鼠右肺組織標(biāo)本，經(jīng)4%多聚甲醛固定1周后，經(jīng)脫水、包埋、切片制成石蠟切片；將石蠟切片置于載玻片上脫蠟、水化后，予蘇木素染色30 s，流水沖洗5 min，伊紅染色30 s，再次流水沖洗5 min，最后放入透明劑中浸泡10 min透明化后予中性樹脂封片。光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠肺組織形態(tài)變化。

1.2.3 馬松染色（Masson’s 染色）評定肺纖維化程度取大鼠右肺組織標(biāo)本，經(jīng)4%多聚甲醛固定1周后，經(jīng)脫水、包埋、切片制成石蠟切片；將石蠟切片置于載玻片上脫蠟、水化后，予蘇木素染色5 min，酸性乙醇分化液分化5 s，流水沖洗5 min，Masson藍化液反藍3 min，蒸餾水沖洗5 min，予麗春紅品紅染色5 min，磷鉬酸溶液浸洗1 min，弱酸溶液浸洗1 min，苯胺藍染色1 min，再次弱酸溶液洗1 min，最后無水酒精以及二甲苯脫水后予中性樹脂封片。光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠肺組織形態(tài)變化。

1.2.4 RT-PCR 技術(shù)檢測各組Col-I、Col-IImRNA的表達取大鼠右肺組織標(biāo)本，加入1 mL Trizol充分研磨，冰上靜置裂解5 min，加入200 μL氯仿混勻后靜置5min。設(shè)置低溫冷凍離心機溫度為4 ℃，轉(zhuǎn)速為12 000 r/min，離心15 min，取上清液，加入等體積異丙醇，混勻后靜置15 min，再次使用低溫冷凍離心機離心15 min，棄上清液，使用75%酒精洗滌沉淀2次，晾干，加入超純水50 μL溶解獲得RNA提取物。將得到的RNA提取物進行逆轉(zhuǎn)錄，獲得相應(yīng)的cDNA。將cDNA模版、上下游引物、2XTaqPCRMaster-mix混合后置于96孔板中，上機，設(shè)置反應(yīng)程序95 ℃變性20 s，95 ℃變性1 s、60 ℃退火20 s，共循環(huán)40次。獲取各樣本中mRNA含量值，重復(fù)3次實驗，取平均值。

引物序列如下：

Col-IF：5′ AAAACGGGAGGGCGAGTG 3′

R：5′ CCATAGGACATCTGGGAAGCAA 3′

Col-IIIF：5′CTGGTTTCTTCTCACCCTGCTT 3′

R：5′ TTTGACATGGTTCTGGCTTCC 3′

1.2.5 Western blot 法檢測各組細(xì)胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62蛋白的表達取大鼠右肺組織標(biāo)本，加入500 μL Ripa充分研磨，冰上靜置裂解5 min。設(shè)置低溫冷凍離心機4 ℃ 12 000 r/min，離心15 min，取上清液。使用BSA法測定蛋白含量，將蛋白溶液混入緩沖液，沸水中煮15 min變性。根據(jù)蛋白含量，在SDS聚丙烯酰胺凝膠上加樣，電泳1 h，轉(zhuǎn)PVDF膜1 h，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗放置4 ℃冰箱孵育過夜，TBST洗膜3次后，加入二抗孵育1 h，再使用TBST洗膜3次后，予顯影劑上機顯影。使用ImageJ軟件以內(nèi)參蛋白 β-actin 的比值作為半定量比較的依據(jù)，測定膜上圖像灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用Graphpad Prism 5.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，計量資料符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析，選取Tukey’s Multiple Comparison Test進行組間差異性分析，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色及Masson’s 染色結(jié)果

大鼠肺組織病理切片HE染色顯示，PQ染毒組標(biāo)本表現(xiàn)出肺泡結(jié)構(gòu)大面積破壞，肺泡間隔明顯增厚，炎性細(xì)胞大量浸潤，形成斑片狀纖維化病灶；雷帕霉素治療組和氫氣水治療組也表現(xiàn)出了肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔增厚，炎性細(xì)胞浸潤，但較PQ組表現(xiàn)較輕；綜合治療組對比對照組標(biāo)本的上皮細(xì)胞脫落和肺泡間隔增厚、炎性細(xì)胞浸潤表現(xiàn)更輕，程度介于對照組和氫氣水治療組或雷帕霉素治療組之間，見圖1A。

大鼠肺組織病理切片Masson’s 染色顯示，PQ染毒組表現(xiàn)出肺泡結(jié)構(gòu)完全丟失，大量膠原堆積在肺泡間隔中，膠原染色明顯；氫氣水治療組和雷帕霉素治療組膠原染色陽性率下降，肺泡結(jié)構(gòu)丟失但較PQ染毒組輕；綜合治療組膠原染色陽性率顯著下降，肺泡組織結(jié)構(gòu)與氫氣水治療組或雷帕霉素治療組相比更加完整，見圖1B。

圖1 肺組織染色結(jié)果（× 200）Fig.1 Lung tissue staining（× 200）

2.2 RT-PCR測定Col-I和Col-IIImRNA結(jié)果

PQ染毒組大鼠肺組織中的Col-ImRNA表達與對照組相比顯著升高（P＜ 0.01），經(jīng)氫氣水治療后Col-ImRNA表達下降（P＜ 0.05），雷帕霉素治療組和綜合治療組Col-I mRNA表達較氫氣水治療組更低（P＜ 0.01），且二者表達量，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05），見圖2A。

PQ染毒組大鼠肺組織中Col-IIImRNA表達與對照組相比顯著升高（P＜ 0.01），經(jīng)氫氣水治療后Col-IIImRNA表達下降（P＜ 0.05），雷帕霉素治療組較氫氣水組Col-IIImRNA表達低（P＜ 0.05），但二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05），綜合治療組Col-IIImRNA表達最低（P＜ 0.01），見圖2B。

圖2 不同處理組Col-ImRNA和Col-IIImRNA的表達Fig.2 Expression of Col-I mRNA and Col-III mRNA in lung tissues in different groups

2.3 Westernblot測定LC3-I、LC3-II和p62結(jié)果

在Westernblot測定大鼠肺組織中P62表達時發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，PQ染毒組中P62表達顯著上升（P＜ 0.001），與PQ染毒組相比，氫氣水治療組P62表達下降（P＜ 0.05），雷帕霉素和綜合治療組P62表達較PQ染毒組顯著下降（P＜ 0.01），且二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05），見圖3A、圖3B。

在Westernblot測定大鼠肺組織中LC3表達，通過計算LC3-II/LC3-I比值觀察自噬流變化，結(jié)果顯示與對照組相比，PQ染毒組LC3II/I比值降低（P＜ 0.05）；與PQ染毒組相比，氫氣水治療LC3II/I值上升（P＜ 0.05），雷帕霉素治療組較PQ染毒組LC3II/I值上升（P＜ 0.01），綜合治療組LC3/II/I值較PQ染毒組顯著上升（P＜ 0.001），見圖3A、圖3C。

圖3 不同處理組P62的表達和LC3-II/LC3-I比值變化Fig.3 Expression of P62 and change of LC3-II/LC3-I ratio in different treatment groups

3 討論

分子氫作為氣體小分子，可以在組織和細(xì)胞中快速擴散發(fā)揮作用。在室溫和大氣壓下，分子氫可以溶解于水中，形成氫氣水，并且飲用氫氣水與吸入氫氣作用相當(dāng)[7]。盡管目前氫氣水治療作用的研究著重于抗氧化和抗凋亡作用方面，但越來越多的研究報道了氫氣水可以通過調(diào)控自噬對抗多種疾病進程，包括心肌缺血/再灌注損傷[9]、急性腎損傷[10]、急性肺損傷[15-16]等。PQ所致的肺纖維化中自噬被激活還是抑制，目前研究尚存爭議，Yao等[17]的研究報道了對于16HBE細(xì)胞，低劑量的PQ可以激活自噬，而高劑量PQ卻抑制了自噬；Gxu等[18]的研究報道了急性PQ中毒致死的肺纖維化患者的肺組織中纖維化區(qū)域的細(xì)胞自噬功能障礙，自噬在PQ誘導(dǎo)肺纖維化形成的過程中起到了重要作用。根據(jù)本實驗，得到以下結(jié)論：（1）百草枯染毒誘導(dǎo)大鼠肺纖維化形成并抑制了自噬。本研究采用病理組織切片及RT-PCR檢測膠原蛋白的轉(zhuǎn)錄水平來評判肺纖維化程度。根據(jù)百草枯染毒后大鼠肺組織出現(xiàn)了急性肺損傷及肺纖維化表現(xiàn)，檢測Col-Ⅰ mRNA及Col-ⅢmRNA的表達水平上升，證明本實驗中百草枯誘導(dǎo)大鼠肺纖維化形成。通過WesternBlot檢測自噬相關(guān)蛋白LC3，與對照組相比，PQ組的LC3II/I比值無統(tǒng)計學(xué)差異，但P62表達升高，考慮PQ所致肺纖維化中的自噬流發(fā)生障礙，自噬被抑制[19]。（2）雷帕霉素激活自噬并減輕了百草枯誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化。使用雷帕霉素治療后，觀察PQ染毒組大鼠的肺組織病理切片，與PQ組相比，發(fā)現(xiàn)雷帕霉素治療組大鼠的肺組織結(jié)構(gòu)破壞減輕，Col-ⅠmRNA、Col-ⅢmRNA表達較PQ組下降，提示大鼠肺纖維化減輕。LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ較PQ組上升，P62表達下降，提示自噬受到促進。結(jié)果還顯示雷帕霉素促進自噬作用優(yōu)于氫氣水。（3）氫氣水減輕了百草枯誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化并促進了自噬。使用氫氣水治療后，觀察PQ染毒組大鼠的肺組織病理切片，與PQ組相比，發(fā)現(xiàn)氫氣水治療組大鼠的肺組織結(jié)構(gòu)破壞減輕，同時檢測Col-Ⅰ mRNA、Col-Ⅲ mRNA表達下降，提示大鼠肺纖維化減輕，WesternBlot檢測自噬相關(guān)蛋白LC3，計算LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值較PQ組上升，P62表達下降，提示大鼠肺組織中自噬流增加，自噬功能障礙得到改善。（4）氫氣水聯(lián)合雷帕霉素治療百草枯誘導(dǎo)的肺纖維化優(yōu)于二者單用，將氫氣水與雷帕霉素合用于治療PQ所致大鼠肺纖維化后，肺組織結(jié)構(gòu)破壞比單用雷帕霉素或氫氣水治療更輕，Col-ⅠmRNA、Col-ⅢmRNA表達較單用雷帕霉素或氫氣水組更低，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及p62表達水平均反應(yīng)出綜合治療組自噬水平高于雷帕霉素或氫氣水單用治療組。

以上實驗驗證了自噬與PQ所致肺纖維化存在密切關(guān)系，PQ所致肺纖維化中存在自噬功能的障礙；通過促進自噬，恢復(fù)自噬功能，可以減輕PQ所致大鼠的肺纖維化程度；氫氣水可以促進自噬，部分恢復(fù)自噬功能，從而減輕PQ所致的肺纖維化，為肺纖維化的治療提供了新的思路。

目前研究認(rèn)為肺纖維化的發(fā)病機制復(fù)雜[20]，本實驗僅用百草枯進行肺纖維化造模存在局限性，還需在其他因素誘導(dǎo)肺纖維化模型中加以印證。另外，大鼠肺纖維化模型中同一部位肺纖維化程度不一至，檢測結(jié)果可能存在一定誤差。最后，在既往研究顯示氫氣水可以通過多種途徑調(diào)節(jié)自噬[8-11]，本實驗中氫氣水究竟通過何種機制調(diào)控自噬治療肺纖維化尚不清楚，需后期研究進一步深入。