張輔君 ，龔 容

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年胸外科；2）云南省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南省實(shí)驗(yàn)診斷研究所，昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南 昆明 650032）

近年來(lái)，隨著食管癌的免疫治療研究的逐步推進(jìn)，免疫檢查點(diǎn)抑制劑已被批準(zhǔn)用于食管癌的二線或三線療法，越來(lái)越多的患者開始接受化免聯(lián)合或序貫治療。但既往的多數(shù)研究認(rèn)為化療對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生抑制作用，其中以T淋巴細(xì)胞數(shù)量與功能的下降最為明顯[1]，而在免疫治療中起關(guān)鍵作用的程序性細(xì)胞死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PD-1）和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）均與T淋巴細(xì)胞密切相關(guān)，是重要的抑制性表面標(biāo)志物。國(guó)外多項(xiàng)研究表明[2-4]若腫瘤抗原特異性T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，作為直接的臨床結(jié)果，則表現(xiàn)出患者對(duì)PD1/PDL-1途徑免疫治療的反應(yīng)較差。因此動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)患者的T淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞水平指標(biāo)，以了解患者的免疫狀態(tài)對(duì)后續(xù)免疫治療有重要意義。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2018年1月至2020年12月于昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院的食管癌手術(shù)+化療治療的患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）入院前無(wú)手術(shù)、放療、化療、免疫治療史；（2）術(shù)前經(jīng)胃鏡活檢確診為食管惡性腫瘤[5]；（3）術(shù)后均有明確的病理診斷及TNM分期。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）存在嚴(yán)重?fù)p害免疫功能的疾病如獲得性免疫缺陷綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、慢性乙型病毒性肝炎等；（2）近期存在明確感染史；（3）近期使用過胸腺肽等免疫增強(qiáng)劑。最終入組39例，年齡42～70歲，其中男性37例，女性2例。病理組織類型分布：39例均為鱗癌，分化程度：低分化9例，中-低分化19例，中分化10例，中高分化1例。根據(jù)食管癌TNM分期（UICC/AJCC 2017第8版）[6]：Ⅱ期29例，Ⅲ期10例。

同時(shí)隨機(jī)選取39例同期體檢者作為正常對(duì)照組，年齡35～72歲，平均59歲，其中男性35例，女性4例，見表1。

表1 患者基本信息（n）Tab.1 Clinical and pathological characteristics of patients enrolled in the study（n）

1.2 臨床資料處理流程

患者入院后行開胸手術(shù)切除食管病變+胃代食管吻合術(shù)+淋巴結(jié)清掃術(shù)，術(shù)后禁食7 d，予全腸外營(yíng)養(yǎng)治療。7 d后復(fù)查食道造影，1例出現(xiàn)食管吻合口瘺，造成化療時(shí)間推遲4周，其余病例均按期（術(shù)后3～4周）接受化療治療。化療方案選擇：奧沙利鉑+紫杉醇。

所有患者均在不同時(shí)間點(diǎn)：手術(shù)前（入院時(shí)）、手術(shù)后3 d、手術(shù)后7 d、化療第一周期前（即術(shù)后第3～4周）、化療后1周、化療后3周空腹采集3～4 mL EDTA抗凝全血，用于檢測(cè)外周血T淋巴細(xì)胞亞群（CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+）及NK細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)。

1.3 檢測(cè)方法及試劑

外周血T淋巴細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞百分比應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。采用美國(guó)BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀和配套的淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)試劑盒（Multi TEST IMK Kit）由專業(yè)檢驗(yàn)人員嚴(yán)格按照操作流程檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，食管癌組術(shù)前與正常對(duì)照組之間的比較采用t檢驗(yàn)分析；不同時(shí)間點(diǎn)T淋巴細(xì)胞亞群變化情況采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，進(jìn)一步多重比較采用LSD法，結(jié)果以Mean ±SD表示。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管癌組手術(shù)前與正常對(duì)照組T淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞水平比較

食管癌組患者術(shù)前CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、NK細(xì)胞水平顯著低于正常對(duì)照組（P＜ 0.05），而CD8+的水平高于正常對(duì)照組，見表2。

表2 食管癌組術(shù)前與對(duì)照組T細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞水平的比較（）Tab.2 The proportions of lymphocytes subsets and the levels of NK cells in healthy controls and in patients with esophageal cancer before surgery（）

表2 食管癌組術(shù)前與對(duì)照組T細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞水平的比較（）Tab.2 The proportions of lymphocytes subsets and the levels of NK cells in healthy controls and in patients with esophageal cancer before surgery（）

2.2 食管癌組術(shù)后T淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞水平變化情況

術(shù)后第3天、第7天患者外周血T淋巴細(xì)胞各亞群及NK細(xì)胞水平均較術(shù)前明顯下降（P＜0.05），且在術(shù)后第3天為最低值，隨后逐漸升高，直至化療第1周期前（即術(shù)后第3～4周）恢復(fù)至接近術(shù)前水平。CD4+/CD8+在患者手術(shù)前后直至化療第1周期前均無(wú)明顯變化，見表3、圖1。

圖1 食管癌組術(shù)前、術(shù)后T細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞水平變化趨勢(shì)圖Fig.1 The trend of T lymphocyte subsets and the levels of NK cells before and after surgery

表3 食管癌組術(shù)前、術(shù)后T細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞水平的變化（）Tab.3 The proportions of lymphocytes subsets and the levels of NK cells before and after surgery（）

表3 食管癌組術(shù)前、術(shù)后T細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞水平的變化（）Tab.3 The proportions of lymphocytes subsets and the levels of NK cells before and after surgery（）

與手術(shù)前比較，*P ＜ 0.05。

2.3 食管癌組化療后T淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞水平變化情況

與化療前相比，食管癌組患者化療后1周CD3+、CD4+及CD4+/CD8+升高，而CD8+比例下降，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）?；熀?周各T淋巴細(xì)胞亞群比例與化療前基本相同?；熐昂驨K細(xì)胞水平雖表現(xiàn)出與CD3+、CD4+類似的變化趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），見表4、圖2。

表4 食管癌組化療前后T細(xì)胞亞群水平的變化（）Tab.4 The proportions of T lymphocyte subsets and NK cells in patients with esophageal cancer before and after chemotherapy（）

表4 食管癌組化療前后T細(xì)胞亞群水平的變化（）Tab.4 The proportions of T lymphocyte subsets and NK cells in patients with esophageal cancer before and after chemotherapy（）

與化療前比較，#P ＜ 0.05。

圖2 食管癌組化療前后T細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞水平變化趨勢(shì)圖Fig.2 The trend of T lymphocyte subsets and the levels of NK cells before and after chemotherapy

3 討論

大量研究表明在抗腫瘤的免疫反應(yīng)中以細(xì)胞免疫為主，T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞在其中具有重要作用。當(dāng)T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量、功能發(fā)生改變，CD4+、CD8+平衡被打破，機(jī)體免疫系統(tǒng)紊亂，識(shí)別和殺傷惡性細(xì)胞的能力降低，這可能是導(dǎo)致癌癥發(fā)生的免疫機(jī)制之一。在本研究中，治療前食管癌組外周血CD3+、CD4+、CD4+/ CD8+、NK細(xì)胞顯著低于對(duì)照組，說(shuō)明食管癌患者的免疫功能受到抑制，清除腫瘤細(xì)胞的能力已較正常人群減弱。在其他研究者的實(shí)驗(yàn)中[7-8]還發(fā)現(xiàn)：腫瘤分期越晚，免疫功能受到抑制的程度也越嚴(yán)重，這使得監(jiān)測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞的數(shù)量，具有協(xié)助判斷腫瘤分期、評(píng)估治療效果的指導(dǎo)意義。

在國(guó)內(nèi)外的大多數(shù)報(bào)道中[9-13]，手術(shù)對(duì)機(jī)體免疫狀態(tài)的影響多是抑制性的，其原因包括術(shù)中失血、麻醉鎮(zhèn)痛、手術(shù)創(chuàng)傷等等，其機(jī)制包括手術(shù)應(yīng)激、T淋巴細(xì)胞壞死、免疫炎性反應(yīng)等。在本研究中，雖然觀察到術(shù)后CD3+、CD4+、CD8+、NK細(xì)胞水平的顯著下降，但手術(shù)前后CD4+/CD8+卻沒有明顯變化，這說(shuō)明食管癌手術(shù)后外周血淋巴細(xì)胞總數(shù)量的下降可能才是導(dǎo)致機(jī)體免疫功能降低的主要原因。另外，在本研究中，T淋巴細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞水平在術(shù)后3 d開始恢復(fù)，3～4周才恢復(fù)至接近術(shù)前水平，與其他研究者在肺癌、乳腺癌患者中的研究相比，食管癌患者術(shù)后免疫功能的恢復(fù)時(shí)間較長(zhǎng)（肺癌患者平均7 d，乳腺癌患者平均5 d）[13-14]，推測(cè)原因可能是食管癌手術(shù)時(shí)間長(zhǎng)，創(chuàng)傷較大，術(shù)后長(zhǎng)時(shí)間禁食所導(dǎo)致機(jī)體免疫功能恢復(fù)緩慢，所以盡量縮短術(shù)后禁食時(shí)間、加用免疫調(diào)節(jié)劑或許能夠促進(jìn)術(shù)后免疫功能的恢復(fù)。

在食管癌的綜合治療中，化療一直是重要的組成部分。雖然化療能夠殺傷大量腫瘤細(xì)胞、減少腫瘤負(fù)荷，但同時(shí)也能夠破壞機(jī)體免疫系統(tǒng)、骨髓等造血系統(tǒng)，抑制DC等免疫細(xì)胞的產(chǎn)生。這使得化療與免疫治療在聯(lián)合使用時(shí)，其使用先后順序、同步或序貫產(chǎn)生了爭(zhēng)議。本研究觀察到患者化療后短時(shí)間內(nèi)CD3+、CD4+比例及CD4+/CD8+升高，而CD8+比例下降，說(shuō)明免疫狀態(tài)有所改善，這可能是由于化療殺傷腫瘤細(xì)胞后，緩解了由腫瘤細(xì)胞直接誘導(dǎo)的免疫抑制。在化療后3周各T淋巴細(xì)胞亞群比例已恢復(fù)至接近化療前水平，這可能支持化療與T細(xì)胞依賴性免疫治療在同步或序貫方案中有效結(jié)合的想法。

綜上所述，食管癌患者的免疫功能在治療前后及治療后的不同時(shí)間段均會(huì)發(fā)生改變，但由于檢測(cè)方法的區(qū)別、人種的差異、腫瘤類型的不同，導(dǎo)致國(guó)內(nèi)外報(bào)道中T淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞變化趨勢(shì)的不一致，甚至得出相反的結(jié)果，因此針對(duì)患者個(gè)體進(jìn)行T淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞的連續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)顯得尤為重要，相較單次檢測(cè)不僅能夠更加準(zhǔn)確地反映患者所處的免疫狀態(tài)，還為后續(xù)免疫治療提供依據(jù)。

本研究不足之處：（1）血液中的CD4+、CD8+還包含有其他更小的亞群，各個(gè)亞群的功能及特征均不相同，僅上述抗原還不足以準(zhǔn)確描述手術(shù)及化療對(duì)淋巴細(xì)胞亞群的影響；（2）在39例患者中，10例接受了額外的放射治療，可能導(dǎo)致T細(xì)胞亞群數(shù)量的改變，故僅選取了化療一周期后數(shù)據(jù)，使得本研究結(jié)果不能完全反映長(zhǎng)期化療后的情況。但在Krijgsman等[15]的研究中，實(shí)體瘤患者在進(jìn)行4～6個(gè)周期的化療后，與治療前相比，B細(xì)胞變化顯著，而T和NK細(xì)胞計(jì)數(shù)無(wú)明顯變化。這可能支持本研究?jī)H選擇化療一周期后數(shù)據(jù)的方案設(shè)計(jì)；（3）由于條件有限，未能進(jìn)行NK細(xì)胞活性測(cè)定，在Ogura[16]的研究中發(fā)現(xiàn)化療藥物對(duì)NK細(xì)胞的作用根據(jù)疾病類型和化學(xué)治療強(qiáng)度而變化，NK細(xì)胞的數(shù)量與活性并不一定同步增加或減少。這使得僅檢測(cè)NK細(xì)胞數(shù)量無(wú)法準(zhǔn)確反映NK細(xì)胞的免疫狀態(tài)。