葛 哲 ，盧思萍 ，付仕忠 ，王春紅 ，李少瑩 ，劉 翺

（1）中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九二〇醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科；2）中醫(yī)科；3）感染科；4）五華病區(qū)，云南 昆明，650032）

結(jié)核病（tuberculosis，TB）是一種由結(jié)核分枝桿菌感染引起的嚴(yán)重危害人類健康和生命的傳染病，是全球主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一[1]。目前在結(jié)核病的防治中，最大的難題依然是結(jié)核病的診斷問(wèn)題，尤其是涂陰肺結(jié)核和肺外結(jié)核的診斷[2]。

γ-干擾素釋放試驗(yàn)（interferon-gamma release assay，IGRA）因其檢測(cè)方便、診斷迅速、定量檢測(cè)的特點(diǎn)，已作為診斷結(jié)核分枝桿菌感染的輔助手段[3]，被WHO和美國(guó)疾病預(yù)防控制中心推薦[4-5]。但這種方法存在難以區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病和潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染的不足[6]。已有研究顯示在病原學(xué)證據(jù)不足時(shí)，IGRA聯(lián)合腫瘤標(biāo)志物CA-125可明顯提高活動(dòng)性肺結(jié)核的診斷準(zhǔn)確率[7]。聯(lián)合人類白細(xì)胞分化抗原G檢測(cè)可提高IGRA診斷肺結(jié)核的特異性[8]。

研究表明，T淋巴細(xì)胞亞群參與肺結(jié)核的發(fā)生、發(fā)展[9]，肺結(jié)核患者的細(xì)胞免疫功能低下是宿主誘發(fā)感染的結(jié)核菌的原因之一。肺結(jié)核患者存在以CD4（+）T淋巴細(xì)胞亞群明顯減少為特征的淋巴細(xì)胞免疫缺陷[10]，病變?cè)綇V泛，下降越嚴(yán)重[11]。尚未見(jiàn)IGRA聯(lián)合外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)的報(bào)道。T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)為肺結(jié)核患者臨床常規(guī)檢測(cè)，檢測(cè)方法較經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便，筆者擬通過(guò)IGRA聯(lián)合外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)，探討二者聯(lián)合是否可提高肺結(jié)核的診斷效率。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年3月至2019年6月在中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九二〇醫(yī)院感染科住院診斷為肺結(jié)核的所有連續(xù)患者58例，男性39例，女性19例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡≥18歲；（2）為初治痰涂陽(yáng)或肺穿刺病理診斷的肺結(jié)核患者和初治痰涂陰臨床診斷為肺結(jié)核患者[2]。其中痰涂陽(yáng)性患者共41例，痰涂陰性患者共17例。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）乙肝、丙肝病毒或HIV陽(yáng)性的患者；（2）復(fù)發(fā)性肺結(jié)核患者；（3）慢性阻塞性肺病、支氣管擴(kuò)張、支氣管哮喘、肺部感染、冠心病、高血壓、糖尿病、腦卒中等慢性疾病者；其他病毒性感染者；惡性腫瘤患者；肝腎功能異常者；妊娠期或哺乳期婦女；（4）3個(gè)月內(nèi)使用全身糖皮質(zhì)激素或其他免疫抑制劑治療。根據(jù)美國(guó)結(jié)核及呼吸協(xié)會(huì)的肺結(jié)核分類標(biāo)準(zhǔn)[12]，將肺結(jié)核分為：輕度肺結(jié)核（10例）、中度肺結(jié)核（6例）和重度肺結(jié)核（15例）。同時(shí)選擇作者單位中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九二〇醫(yī)院同期健康體檢的自愿者48例作為對(duì)照組。該研究獲得了中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九二〇醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有患者參與研究前均簽署了知情同意書(shū)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 試劑（1）全血γ-干擾素釋放試驗(yàn)試劑（主要試劑均來(lái)自北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司）：TB-IGRA酶標(biāo)板，TB-IGRA測(cè)試培養(yǎng)管（T），TB-IGRA本底對(duì)照培養(yǎng)管（N），TB-IGRA陽(yáng)性對(duì)照培養(yǎng)管（P），TB-IGRA校準(zhǔn)品（凍干粉），TB-IGRA酶標(biāo)試劑，TB-IGRA樣品稀釋液，TBIGRA校準(zhǔn)品稀釋液，濃縮洗滌液20X，顯色劑A液，顯色劑B液，終止液，自封袋，封板膜及生理鹽水等；（2）T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)試劑均由美國(guó)BD公司生產(chǎn)，包括CD3-PE、CD4-FITC、CD8-APC、CD16-FITC等。

1.2.2 主要設(shè)備303-O型臺(tái)式培養(yǎng)箱，TDZ4-WS臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)，DEM-3型自動(dòng)洗板機(jī)，KHB ST-360酶標(biāo)儀，EPICS XL流式細(xì)胞儀。

1.3 研究方法

1.3.1 全血γ-干擾素釋放試驗(yàn)檢測(cè)受試者于入院第2天清晨空腹下抽取靜脈血5 mL于肝素抗凝管真空中，按照說(shuō)明書(shū)分別進(jìn)行抗原刺激及ELISA法血漿IFN-γ濃度測(cè)定。檢測(cè)結(jié)果根據(jù)說(shuō)明書(shū)分為“陽(yáng)性”、“陰性”和“不確定”。

1.3.2 T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)受試者入院第2天空腹時(shí)采集靜脈血4 mL 于乙二胺四乙酸抗凝管和枸櫞酸鈉促凝管中。采用流式細(xì)胞儀抗體雙標(biāo)法對(duì)抗凝管中的CD4（+）T、CD8（+）T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)率進(jìn)行測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

研究數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，2組計(jì)量資料的比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料的比較采用卡方檢驗(yàn)，理論頻數(shù)小于1時(shí)使用Fisher確切概率法。采用受試者工作特征曲線分析（ROC曲線）評(píng)價(jià)不同診斷試驗(yàn)（指標(biāo)）對(duì)肺結(jié)核的診斷價(jià)值和診斷效能。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)水準(zhǔn)取0.05。

2 結(jié)果

2.1 受試者基本情況

本研究共納入肺結(jié)核患者58例，健康對(duì)照者48例，見(jiàn)表1。肺結(jié)核組與對(duì)照組性別分布、年齡情況差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。在痰涂陽(yáng)性肺結(jié)核組和痰涂陰性肺結(jié)核組中，輕、中、重不同嚴(yán)重程度肺結(jié)核病例數(shù)總體差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。肺結(jié)核組與對(duì)照組比較，肺結(jié)核組IGRA試驗(yàn)陽(yáng)性例數(shù)明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。T細(xì)胞表達(dá)率經(jīng)t檢驗(yàn)，2組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。

表1 受試者基線資料 [ /n（%）]Tab.1 Baseline characteristics of subjects [ /n（%）]

表1 受試者基線資料 [ /n（%）]Tab.1 Baseline characteristics of subjects [ /n（%）]

*P ＜ 0.05。

2.2 IGRA檢查結(jié)果

2.2.1 不同組別IGRA檢查結(jié)果比較痰涂陽(yáng)性肺結(jié)核組和痰涂陰性肺結(jié)核組分別與對(duì)照組比較，IGRA陽(yáng)性例數(shù)均高于對(duì)照組（P＜ 0.05），見(jiàn)表2。

表2 肺結(jié)核組和對(duì)照組IGRA結(jié)果 n（%）Tab.2 Results of IGRA in TB group and control group n（%）

2.2.2 IGRA檢測(cè)肺結(jié)核的靈敏度和特異度58例肺結(jié)核患者中，IGRA檢查診斷肺結(jié)核的靈敏度為86.2%（50/ 58），漏診率為13.8%（8/ 58）；48例健康對(duì)照者中，IGRA檢查的特異度為95.8%（46/ 48），誤診率為4.2%（2/ 48），見(jiàn)表3。

2.2.3 IGRA聯(lián)合T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)肺結(jié)核的靈敏度和特異度IGRA檢查聯(lián)合T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)診斷肺結(jié)核的靈敏度為96.6%（56/58），漏診率為3.4%（2/58）；IGRA檢查聯(lián)合T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)的特異度為91.7%（44/48），誤診率為8.3%（4/48），見(jiàn)表4。

表4 聯(lián)合試驗(yàn)檢測(cè)肺結(jié)核的四格表（n）Tab.4 The 2 × 2 table of IGRA combined with T lymphocyte subset detection of pulmonary tuberculosis（n）

IGRA 與聯(lián)合試驗(yàn)靈敏度經(jīng)卡方檢驗(yàn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Fisher確切概率法，P=0.017），聯(lián)合試驗(yàn)的靈敏度96.6%高于IGRA方法的86.2%。兩種方法的特異度經(jīng)卡方檢驗(yàn)，差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Fisher確切概率法，P=0.005），聯(lián)合試驗(yàn)的特異度91.7%略低于IGRA試驗(yàn)的95.8%。

2.2.4 IGRA及IGRA聯(lián)合T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)診斷涂陽(yáng)和涂陰肺結(jié)核的ROC曲線單獨(dú)IGRA曲線下面積AUC=0.816（P=0.001），IGRA聯(lián)合T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)曲線下面積AUC=0.911（P=0.000），見(jiàn)圖1。IGRA實(shí)驗(yàn)聯(lián)合T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)對(duì)涂陽(yáng)或涂陰肺結(jié)核的診斷價(jià)值較高，而單一IGRA實(shí)驗(yàn)診斷價(jià)值中等。

圖1 IGRA及IGRA聯(lián)合T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)診斷肺結(jié)核的ROC曲線Fig.1 The ROC curve of IGRA and IGRA combined with T lymphocyte subset detection in diagnosis of pulmonary tuberculosis

3 討論

本研究通過(guò)全血γ-干擾素釋放試驗(yàn)（IGRA）聯(lián)合T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)，驗(yàn)證其在肺結(jié)核診斷中的作用。IGRA已廣泛在臨床中得到應(yīng)用，既往不同研究顯示，IGRA對(duì)活動(dòng)性結(jié)核的敏感性在83%～100%之間[3,13-14]，本研究單獨(dú)IGRA的敏感性為86.2%，與既往研究基本一致。

本研究中納入研究的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的男女比例、年齡均無(wú)明顯差異。肺結(jié)核患者共計(jì)58例，痰涂陽(yáng)性及痰涂陰性肺結(jié)核患者病情嚴(yán)重程度分布均衡。58例肺結(jié)核患者中，50例IGRA結(jié)果陽(yáng)性，8例結(jié)果陰性；48例健康受試者中，2例IGRA結(jié)果陽(yáng)性，46例IGRA結(jié)果陰性。IGRA可以很好區(qū)分肺結(jié)核患者及健康對(duì)照。但仍有2例誤診，筆者進(jìn)一步追蹤患者病史發(fā)現(xiàn)其既往有結(jié)核接觸史，據(jù)此推測(cè)，如果患者既往有結(jié)核接觸史或者有活動(dòng)性結(jié)核，即使病情已經(jīng)痊愈，其T細(xì)胞仍有免疫記憶，造成IGRA出現(xiàn)假陽(yáng)性。而本研究中有5例患者漏診，主要由于該類患者的病情較嚴(yán)重，出現(xiàn)嚴(yán)重的免疫抑制狀態(tài)，受結(jié)核桿菌感染后的T細(xì)胞不能產(chǎn)生足夠γ干擾素，故不能獲得有效的統(tǒng)計(jì)量而出現(xiàn)假陰性。

結(jié)核感染后的機(jī)體內(nèi)的免疫功能主要以T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫為主，根據(jù)其分子不同特征可分CD4（+）T細(xì)胞和CD8（+）T細(xì)胞，根據(jù)這兩種細(xì)胞亞群在機(jī)體免疫中數(shù)量多少的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)結(jié)核病的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸起著重要影響。研究證實(shí)，肺結(jié)核患者外周血的CD4+T細(xì)胞數(shù)較正常人明顯減低[15]，同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn) CD4（+）/CD8（+）比值可作為疾病嚴(yán)重的一個(gè)重要指標(biāo)，其比值下降明顯，表示疾病較重，該比值上升，表示疾病恢復(fù)[16]。本研究中，肺結(jié)核患者在治療前CD3（+）、CD4（+）T細(xì)胞及CD4（+）/CD8（+）與正常組比較明顯下降，CD8（+）T細(xì)胞較正常組升高。因此聯(lián)合外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)可以進(jìn)一步判斷肺結(jié)核患者的病情。

如果IGRA陽(yáng)性，患者臨床上需考慮活動(dòng)性肺結(jié)核、陳舊性肺結(jié)核、潛伏性結(jié)核桿菌感染。通過(guò)外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)，如果出現(xiàn)CD4（+）細(xì)胞下降，CD4（+）/CD8（+）比值以及CD特別Th1細(xì)胞明顯下降，提示患者可能已經(jīng)為活動(dòng)性肺結(jié)核或者即將轉(zhuǎn)變?yōu)榛顒?dòng)性肺結(jié)核，進(jìn)而可以指導(dǎo)臨床肺結(jié)核診斷和治療。本研究通過(guò)IGRA檢測(cè)聯(lián)合T淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定，發(fā)現(xiàn)對(duì)肺結(jié)核診斷的靈敏度為96.6%（56/ 58），特異度為91.7%（44/ 48），漏診率為3.4%（2/ 58），誤診率為8.3%（4/48）。靈敏度及特異度均達(dá)到90以上，漏診率也較單獨(dú)IGRA檢測(cè)（13.8%）明顯下降。IGRA實(shí)驗(yàn)聯(lián)合T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)ROC曲線下面積為0.911，進(jìn)一步證實(shí)IGRA聯(lián)合T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)與單獨(dú)IGRA檢測(cè)比較，可提高診斷的靈敏度，減少漏診率，診斷價(jià)值明顯提高。

此外，在本研究中2例健康對(duì)照出現(xiàn)IGRA假陽(yáng)性，考慮與其陳舊性肺結(jié)核T細(xì)胞仍有免疫記憶有關(guān)，通過(guò)T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)，其結(jié)果正常，可排除活動(dòng)性肺結(jié)核診斷。本研究還存在一些不足：（1）本研究的樣本量較小，IGRA檢測(cè)聯(lián)合T淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定時(shí)，漏診率增加，考慮與樣本量較小有關(guān)，但聯(lián)合檢測(cè)時(shí)靈敏度由86.2%上升至96.6%具有臨床意義，特異度雖有下降，但仍高于90%，后期可增加樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果；（2）研究為單中心研究，還需擴(kuò)大研究范圍，排除人群間差異。

綜上，本研究提出的IGRA檢查聯(lián)合T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)診斷肺結(jié)核具有較高靈敏度和特異性，可以明顯減少漏診率，具有較高診斷價(jià)值，值得臨床推廣，是對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核診斷的有效補(bǔ)充。