張朔，趙建，鄒墅，張穎，趙東山，劉曉杰，劉玥，翟東穎，孫宏亮

1.長(zhǎng)春生物制品研究所有限責(zé)任公司，吉林長(zhǎng)春130012；2.吉林省藥品檢驗(yàn)所，吉林長(zhǎng)春130033

森林腦炎是由森林腦炎病毒引起的一種以侵襲中樞神經(jīng)系統(tǒng)為主的急性病毒性傳染?。?］，該病目前尚無(wú)特異的治療方法，病死率3% ～30%［2-3］。接種疫苗是控制該病流行的最經(jīng)濟(jì)有效的措施［4］。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝制備森林腦炎滅活疫苗存在難以克服的缺陷，主要包括地鼠用量相對(duì)較大，不符合關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的減少、替代及循環(huán)使用原則（即3R 原則）；轉(zhuǎn)瓶使用數(shù)量多，具有人工勞動(dòng)強(qiáng)度大，自動(dòng)化程度低，效率相對(duì)較低，占用空間大，可控制性差，污染風(fēng)險(xiǎn)較高等缺點(diǎn)［5］。而細(xì)胞工廠用于大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)，可大量減少地鼠用量，具有空間培養(yǎng)面積大因而占地較小等優(yōu)點(diǎn)，可達(dá)到在有限空間內(nèi)提高產(chǎn)能、減少人工操作工作量、降低污染風(fēng)險(xiǎn)的目的，同時(shí)細(xì)胞工廠表面經(jīng)過(guò)特殊處理，可確保細(xì)胞黏附和生長(zhǎng)的最佳條件［6-7］。

本研究采用細(xì)胞工廠培養(yǎng)原代地鼠腎細(xì)胞收獲病毒液，經(jīng)超濾濃縮、滅活、純化后制備了森林腦炎滅活疫苗，建立連續(xù)培養(yǎng)多次收獲工藝，以提高疫苗產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)金黃地鼠，雌性，體重13 ~16 g，日齡12 ~ 14 d，由長(zhǎng)春生物制品研究所有限責(zé)任公司動(dòng)物室提供，動(dòng)物合格證號(hào)：201600014430。

1.2 病毒 工作種子森林腦炎病毒森“張”株，第10代，由長(zhǎng)春生物制品研究所有限責(zé)任公司疫苗三室保存并提供。

1.3 主要試劑及儀器 MEM 培養(yǎng)基（干粉）購(gòu)自美國(guó)Hycolone 公司；199 培養(yǎng)基（干粉）購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；牛血清白蛋白ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自無(wú)錫博生醫(yī)用生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；乳酸檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；葡萄糖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海榮盛生物藥業(yè)有限公司；新生牛血清購(gòu)自太原潤(rùn)生生物材料有限公司；細(xì)胞工廠購(gòu)自美國(guó)Corning公司，型號(hào) 10 ／ 40 層；Sepharose 4FF 凝膠過(guò)濾介質(zhì)購(gòu)自美國(guó)GE Healthcare 公司；截留相對(duì)分子質(zhì)量300 kD 的超濾膜包購(gòu)自美國(guó)Millipore 公司。

1.4 溶液配制 消化液：將0.5%胰蛋白酶用MEM按照終濃度為0.125%進(jìn)行稀釋，經(jīng)7.5% NaHCO3溶液調(diào) pH 至 7.8 ～ 8.2，同時(shí)按終濃度 100 IU ／ mL補(bǔ)加硫酸卡那霉素。細(xì)胞生長(zhǎng)液：在含0.2%乳白蛋白水解物、1%谷氨酰胺的MEM 液中，按終濃度6%加入新生牛血清，并用7.5% NaHCO3溶液調(diào)pH 至6.8 ～ 7.2，按終濃度 100 IU ／ mL 補(bǔ)加硫酸卡那霉素。病毒維持液：含1% ~ 2%新生牛血清的199 培養(yǎng)液，用 NaHCO3溶液調(diào) pH 至 7.4 ～ 7.8。

1.5 地鼠用量及接種病毒時(shí)間確定 分別取120（3對(duì)腎 ／ 層）、140（3.5 對(duì)腎 ／ 層）、160（4 對(duì)腎 ／ 層）、180（4.5 對(duì)腎 ／ 層）及 200 只（5 對(duì)腎 ／ 層）地鼠，無(wú)菌取腎，于2 ～8 ℃消化18 ～20 h；各組分別接種4個(gè)10 層細(xì)胞工廠，生長(zhǎng)液200 mL ／層，（37 ± 1）℃靜置培養(yǎng)；分別于接種后24、48、68 及72 h 觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，并按下式計(jì)算細(xì)胞覆蓋率，確定最適地鼠數(shù)量及接種病毒時(shí)間［8］。每個(gè)10 層細(xì)胞工廠為1 批。

1.6 病毒收獲時(shí)間及次數(shù)確定

1.6.1 細(xì)胞工廠實(shí)驗(yàn)組（工廠01 ~ 05） 取160 只地鼠為 1 個(gè)解剖組，共 5 組，無(wú)菌取腎，于 2 ～ 8 ℃消化18 ～20 h；各組均接種1 個(gè)40 層細(xì)胞工廠，（37 ± 1）℃靜置培養(yǎng)68 ～72 h；待細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層后，按 0.5 MOI 感染森林腦炎病毒，（33 ± 1）℃靜置培養(yǎng)96 h；進(jìn)行第1 次收獲，收獲后補(bǔ)加維持液，（33 ± 1）℃靜置培養(yǎng) 48 h；進(jìn)行第 2 次收獲，如此反復(fù)進(jìn)行10 次收獲，至細(xì)胞明顯脫落后停止收獲［9-10］。取樣檢測(cè)上清液病毒毒力、葡萄糖含量、乳酸含量。病毒毒力檢測(cè)按照《中國(guó)藥典》三部（2015 版）各論森林腦炎滅活疫苗2.2.3.2 中方法進(jìn)行；葡萄糖、乳酸含量檢測(cè)按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.6.2 10 L 轉(zhuǎn)瓶對(duì)照組（轉(zhuǎn)瓶01） 取100 只地鼠，無(wú)菌取腎，于 2 ～ 8 ℃消化 18 ～ 20 h；接種 5 個(gè) 10 L轉(zhuǎn)瓶，加入細(xì)胞生長(zhǎng)液 2 L ／ 瓶，（37 ± 0.5）℃培養(yǎng)68 ～72 h；待細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層后，按0.5 MOI 感染森林腦炎病毒，加入病毒維持液 2 L ／ 瓶，（33 ±1）℃培養(yǎng)96 h；進(jìn)行第1 次收獲，補(bǔ)加病毒維持液2 L ／ 瓶，（33 ± 1）℃培養(yǎng) 48 h［9-10］，進(jìn)行第 2 次收獲，共收獲4 次，至細(xì)胞明顯脫落后停止收獲。取樣，檢測(cè)上清液病毒毒力、葡萄糖含量、乳酸含量，方法同1.6.1 項(xiàng)。

1.7 編碼主要保護(hù)性抗原核酸的遺傳穩(wěn)定性檢測(cè) 將細(xì)胞工廠實(shí)驗(yàn)組第10 次收獲的病毒液作為毒種重新按照0.5 MOI 感染已經(jīng)長(zhǎng)成致密單層的原代地鼠腎細(xì)胞，（33 ± 1）℃恒溫室培養(yǎng)96 h 后收獲上清液，即第11 代，如此反復(fù)傳至第20 代。對(duì)第11~20代收獲后的病毒液抽提RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板，利用3 對(duì)引物（見(jiàn)表1，由庫(kù)美生物科技有限公司合成）。PCR 擴(kuò)增E 蛋白片段。反應(yīng)條件為：50 ℃ 30 min；94 ℃ 2 min，94 ℃30 s，60 ℃ 30 s，共 30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 1 min；4 ℃保存。將擴(kuò)增后的主要保護(hù)性抗原E 蛋白送庫(kù)美生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，分析各代次編碼主要保護(hù)性抗原的核酸變異情況。

表1 PCR 擴(kuò)增用引物Tab.1 Primers for PCR

1.8 原液制備及檢定 分別將3 批40 層細(xì)胞工廠（批號(hào)：工廠 01 ~ 03）和1 批 10 L 轉(zhuǎn)瓶（批號(hào)：轉(zhuǎn)瓶01）收獲的病毒液用相同方法制備疫苗原液［9，11］：合并檢定合格的同一細(xì)胞批生產(chǎn)的單次病毒收獲液，經(jīng)連續(xù)流離心去細(xì)胞碎片（轉(zhuǎn)速：700 ～1 000×g，流速：1 500 ～ 2 500 mL ／ min），上清液加入終溶度為 500 μg ／ mL 的甲醛 2 ~ 8 ℃滅活 21 d。用截留相對(duì)分子質(zhì)量300 kD 膜包超濾濃縮40 ～60 倍后，采用柱色譜法進(jìn)行純化，色譜介質(zhì)為Sepharose 4FF凝膠柱，每次上樣量為柱床體積的5% ～7%，洗脫液為 0.01 mol ／ L PBS，線性流速為 20 ～ 30 cm ／ h，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。收集第1 峰的洗脫液即為純化后的病毒液，經(jīng)除菌過(guò)濾后，即為疫苗原液。按照《中國(guó)藥典》三部（2015 版）進(jìn)行抗原含量、蛋白質(zhì)含量、地鼠腎細(xì)胞蛋白質(zhì)殘留量、牛血清白蛋白殘余量檢測(cè)?？乖坎坏陀? ∶232，蛋白質(zhì)含量不高于80 μg ／ mL，地鼠腎細(xì)胞蛋白質(zhì)殘留量不高于12 μg ／ mL，牛血清蛋白殘留量不高于 50 ng ／ mL。

2 結(jié) 果

2.1 最適地鼠用量及接種病毒時(shí)間 結(jié)果表明，接種相同對(duì)地鼠腎時(shí)，4 批細(xì)胞工廠之間細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)一致，培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)越致密。在相同培養(yǎng)時(shí)間時(shí)，接種地鼠腎對(duì)數(shù)與細(xì)胞生長(zhǎng)狀況不呈線性相關(guān)。培養(yǎng)24 和48 h 時(shí)，細(xì)胞均不能長(zhǎng)成致密單層，至72 h 左右時(shí)，每個(gè)消化批使用140 ~ 200 對(duì)地鼠腎（3.5 ～ 5 對(duì)腎 ／ 層）時(shí)，細(xì)胞均可長(zhǎng)成致密單層。見(jiàn)圖1。綜合考慮細(xì)胞生長(zhǎng)情況及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物利用率后，確定每個(gè)消化批使用140 ~ 180 對(duì)地鼠腎（3.5 ～ 4.5 對(duì)腎 ／ 層），培養(yǎng)時(shí)間為 68 ～ 72 h。

圖1 細(xì)胞工廠不同接種數(shù)量細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)Fig.1 Growth of cells at various inoculation amounts in cell factory

2.2 病毒收獲時(shí)間及次數(shù) 細(xì)胞工廠實(shí)驗(yàn)組收獲10 次后，細(xì)胞出現(xiàn)脫落，停止收獲，第10 次毒力低于《中國(guó)藥典》三部（2015 版）標(biāo)準(zhǔn)（即病毒滴度不低于 7.0 lgLD50／ mL），但前 5 次收獲的病毒液葡萄糖及乳酸含量變化較穩(wěn)定；10 L 轉(zhuǎn)瓶對(duì)照組收獲4 次后，細(xì)胞出現(xiàn)明顯脫落，停止收獲。見(jiàn)圖2 和圖3。

圖2 不同培養(yǎng)方式制備的森林腦炎病毒收獲液的病毒滴度Fig.2 Titers of harvested TBE virus cultured by different methods

圖3 不同培養(yǎng)方式制備的森林腦炎病毒收獲液液中葡萄糖（A）及乳酸（B）含量Fig.3 Glucose（A）and lactic acid（B）contents in harvested TBE virus cultured by different methods

測(cè)序結(jié)果表明，除第11、12 及13 次收獲液的1 260位出現(xiàn)突變，第15、19 及20 次收獲液的608 位出現(xiàn)突變外，其他各代次收獲液均無(wú)突變。其中，編碼主要保護(hù)區(qū)第1 260 位的突變導(dǎo)致堿基由A 突變?yōu)镃，但由于密碼子簡(jiǎn)并性，這種改變并未使其編碼的氨基酸發(fā)生改變，均為編碼Leu。編碼主要保護(hù)區(qū)第608位的突變導(dǎo)致堿基由A 突變?yōu)镃，編碼的氨基酸也由終止密碼子突變?yōu)镃ys，但均未改變蛋白的性質(zhì)。

結(jié)合收獲液病毒毒力變化情況、葡萄糖含量變化情況、乳酸含量變化情況、編碼主要保護(hù)性抗原的核酸變異情況，細(xì)胞工廠實(shí)驗(yàn)組可進(jìn)行3 ～5 次病毒收獲。

2.3 原液檢定結(jié)果 原液中抗原含量、蛋白質(zhì)含量、地鼠腎細(xì)胞蛋白質(zhì)殘留量、牛血清白蛋白殘余量均符合《中國(guó)藥典》三部（2015 版）規(guī)定，見(jiàn)表2。根據(jù)前期使用地鼠數(shù)量摸索，采用細(xì)胞工廠工藝每批地鼠投產(chǎn)量可減少40%，仍能夠確保病毒收獲液及原液生產(chǎn)體積不變。

表2 兩種工藝制備疫苗原液檢定結(jié)果Tab.2 Control tests on bulks of vaccine prepared by two processes

3 討 論

本文結(jié)合轉(zhuǎn)瓶工藝使用40 層細(xì)胞工廠培養(yǎng)原代地鼠腎細(xì)胞和森林腦炎病毒，確定了細(xì)胞工廠制備森林腦炎滅活疫苗（地鼠腎細(xì)胞）的工藝參數(shù)：細(xì)胞工廠最適細(xì)胞接種量為3 ~ 4 對(duì)地鼠腎 ／ 層；感染病毒96 h 后第1 次收獲，之后每48 h 收獲1 次，可連續(xù)收獲3 ~ 5 次。

將森林腦炎病毒液加入終溶度為500 μg ／ mL的甲醛2 ~ 8 ℃滅活21 d，通過(guò)截留相對(duì)分子質(zhì)量300 kD 的膜包進(jìn)行超濾濃縮后，經(jīng)Sepharose 4FF柱層析純化后得到疫苗原液，其抗原含量、牛血清白蛋白殘留量、地鼠腎細(xì)胞蛋白殘留量均符合《中國(guó)藥典》三部（2015 版）要求［11］。

楊睿［12］在《賈第蟲GeRF1 識(shí)別終止密碼子性質(zhì)分析》一文中指出，Paramecium、Tetrahymena 和Stylonychia 將通用終止密碼子UAA 和UAG 翻譯為谷氨酸酰胺，將UGA 識(shí)別為終止密碼。Euplotes 中UAA 和UAG 作為終止密碼子，而通用終止密碼子UGA 翻譯成半胱氨酸。由此推測(cè)第608 位由于堿基突變?cè)斐山K止密碼子突變成了半胱氨酸密碼子，該突變并未改變蛋白的性質(zhì)，突變前終止密碼子和突變后半胱氨酸密碼子表達(dá)的氨基酸均為半胱氨酸。因此，從遺傳穩(wěn)定性方面，采用細(xì)胞工廠培養(yǎng)方式連續(xù)收獲10 代病毒液對(duì)E 蛋白無(wú)影響。對(duì)多次收獲的病毒液進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示，連續(xù)多次收獲并未改變森林腦炎病毒包膜蛋白E 的活性，表明森林腦炎病毒傳代后遺傳穩(wěn)定性良好。

利用細(xì)胞工廠培養(yǎng)原代地鼠腎細(xì)胞制備森林腦炎滅活疫苗，條件易于控制，能大量節(jié)約地鼠用量和勞動(dòng)成本，有效減少污染幾率，獲得較高的細(xì)胞密度并收獲高毒力的病毒液，可替代轉(zhuǎn)瓶大規(guī)模生產(chǎn)森林腦炎滅活疫苗［13-15］。