李國澤 陳藹儀 李 雪 趙 平 陸燕元 丁 勇

（1. 西南林業(yè)大學(xué)云南省高校林木生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650233；2. 西南林業(yè)大學(xué)西南地區(qū)林業(yè)生物質(zhì)資源高效利用國家林業(yè)與草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650233）

樟葉越桔（Vaccinium dunalianum）為杜鵑花科（Ericaceae）越桔屬常綠稀攀援灌木，又名飯米果（云南昆明），長尾越桔等，其國外主要分布于尼泊爾（東部）、錫金、不丹、印度（東北部）、緬甸（北部）至越南（北部），國內(nèi)主要分布于四川、貴州、云南（西北部經(jīng)滇中高原至滇南、滇東南）、西藏等地區(qū)[1-3]。樟葉越桔全株入藥，性味微苦，微溫，具有祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)、治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)疼等藥用功能[3]。云南滇中地區(qū)（武定縣、祿勸縣、巍山縣等）樟葉越桔野生資源豐富，楚雄彝族人民利用其幼嫩葉芽制成具有傳統(tǒng)特色的雀嘴茶，其茶湯清透明亮，香氣馥郁，滋味回甘悠長，是彝族民間常用的一種茶代用品[4]。

近年來，對(duì)樟葉越桔植物的研究主要集中在其營養(yǎng)成分[5-8]、主效成分[5-6,9-12]和重要性狀功能基因[13-20]等方面，研究發(fā)現(xiàn)樟葉越桔中不僅含有豐富的氨基酸、蛋白質(zhì)、粗纖維、黃酮類、Vc和多糖等多種營養(yǎng)物質(zhì)[5-8]，還富含熊果苷、綠原酸和6′-O-咖啡酰熊果苷（CA）[5-6,9-12]3種主效活性物質(zhì)。2008年，Zhao等[9]首次從樟葉越桔‘雀嘴茶’中分離得到9個(gè)咖啡酰熊果苷類衍生物以及相關(guān)酚苷類化合物共29種，其中熊果苷、綠原酸和CA為主要的3種化合物，而CA干質(zhì)量含量高達(dá)22%；Luo等[10]發(fā)現(xiàn)CA、綠原酸和熊果苷分別以干質(zhì)量31.76%、7.61%和2.81%的含量存在于云南野生樟葉越桔葉芽中。樟葉越桔不僅可作為皮膚美白活性劑原料熊果苷及其衍生物類物質(zhì)CA的天然來源植物[9-10]，其富含的主效活性物質(zhì)還具有預(yù)防心血管疾病[21-22]、降血脂、膽固醇和抗血栓[23]、抗菌、鎮(zhèn)咳、利尿和消炎等[24-26]多種藥用功效。因此開展樟葉越桔主效成分高效提取的相關(guān)研究則顯得愈發(fā)重要。前期李娜等[11]對(duì)樟葉越桔葉芽加工品雀嘴茶（購自云南省武定縣干燥成品）CA的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)提取次數(shù)、液料比、超聲時(shí)間和甲醇體積分?jǐn)?shù)等因素影響著CA含量的高效提取；譚亞婷等[12]研究了不同生長素類型及濃度影響樟葉越桔離體莖段和葉片的組培培養(yǎng)物中熊果苷和CA的含量差異，表明NAA或IBA可作為樟葉越桔組培苗離體葉片產(chǎn)生熊果苷和CA的誘導(dǎo)子，認(rèn)為樟葉越桔組培苗葉片是離體生產(chǎn)熊果苷和CA的潛在理想原料。但在樟葉越桔已知研究中，均未報(bào)道不同干燥方式對(duì)熊果苷、綠原酸和CA等主效成分含量的影響。不同干燥方式也會(huì)對(duì)植物產(chǎn)品物理特性及化學(xué)成分存在不同程度的影響[27-33]。關(guān)于樟葉越桔化合物成分提取相關(guān)研究中，為了節(jié)約時(shí)間對(duì)組織樣品的干燥方式通常采用熱風(fēng)干燥（HAD）。而通過研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于同一樟葉越桔組織樣品，相比HAD，采用自然風(fēng)干（NAD）干燥方式處理，可獲得更高的主效成分提取含量，現(xiàn)予以報(bào)道。為樟葉越桔主效成分的開發(fā)利用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)植物材料采自云南省楚雄州武定縣不同地點(diǎn)的野生樟葉越桔植物成熟葉片、幼嫩葉片和鮮新花芽，見圖1。成熟葉片為枝條頂端以下第2～4片中無蟲蛀、無斑點(diǎn)的隨機(jī)2片，幼嫩葉片新鮮、健康，花芽生長良好、大小勻稱，組織樣品裝入信封袋帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行干燥處理試驗(yàn)，供試樣品信息見表1。

表1 供試植物樣品信息Table 1 Information of plant samples tested

圖1 試驗(yàn)植物材料樟葉越桔及不同組織部位Fig. 1 Experiment plant materials of V. dunalianum and its different tissues

1.2 試劑

標(biāo)準(zhǔn)品熊果苷（批號(hào)：T17S6B1）和綠原酸（批號(hào)：Y22M8K36544）均購自上海源葉生物科技有限公司，6′-O-咖啡酰熊果苷（CA）為課題組采用化學(xué)方法從樟葉越桔中提取分離，純度＞95%；色譜純甲醇為德國Merck公司產(chǎn)品；分析純甲醇、冰乙酸產(chǎn)自天津市大茂化學(xué)試劑廠；水為超純水。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1樣品干燥試驗(yàn)處理

將表1中各組織樣品隨機(jī)分為2份，每份10 g，一份用于HAD試驗(yàn)，另一份用于NAD試驗(yàn)。1）HAD試驗(yàn)處理：將樣品裝在鋁質(zhì)干燥盒中，置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海市試驗(yàn)儀器總廠LG100B型理化干燥箱）內(nèi)，45 ℃條件下連續(xù)干燥至恒質(zhì)量（葉和花芽組織分別約用34 h和42 h）。2）NAD試驗(yàn)處理：將樣品單層平鋪于白紙上，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)陰涼通風(fēng)處干燥至恒質(zhì)量（約20 d），室溫平均約25 ℃。樣品恒質(zhì)量方法為采用SOP型電子分析天平（德國Sartorius公司）稱量，使相鄰兩次稱量質(zhì)量之差在千分之五以內(nèi)。

1.3.2 樣品主效成分提取預(yù)處理

取干燥后的試驗(yàn)樣品粉碎過40目篩，密封于50 mL離心管后再置于黑色封口袋中。測定化合物含量前，將樣品置于干燥器中平衡過夜。

1.3.3 HPLC試樣制備

1）混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備。準(zhǔn)確稱取熊果苷、綠原酸和CA 3種標(biāo)準(zhǔn)品，先配制成起始質(zhì)量濃度為1.20 μg/μL熊果苷、3.00 μg/μL綠原酸和6.00 μg/μL CA的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，再依次等體積稀釋，至終質(zhì)量濃度為0.02 μg/μL熊果苷、0.05 μg/μL綠原酸以及0.09 μg/μL CA標(biāo)準(zhǔn)品溶液（表2）。

2）供試樣品溶液制備。精確稱取1.3.2預(yù)處理后的樣品0.10 g，3個(gè)重復(fù)。參照文獻(xiàn)[11]的方法，按液料比16∶1加入73%甲醇提取劑，LU10AT型超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司）超聲輔助提取19 min，CF16RXⅡ型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（日本HITACHI公司）離心沉淀（5 000 r/min離心2 min）后，取上清，沉淀再按液料比16∶1加73%甲醇（同法重復(fù)3次，共提取4次），各取提取液1 mL等體積混勻，過0.45 μm濾孔濾膜（一次性針頭式過濾器）后注入棕色色譜小瓶。

1.3.4 HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品參照文獻(xiàn)[34]進(jìn)行HPLC測定分析。色譜條件：色譜柱為F90104 CAPCELL PAK C18 MG（S-5）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A相為1%冰乙酸，B相為色譜純甲醇；梯度洗脫程序見表3；流速為1 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；檢測波長為280 nm，依次進(jìn)樣（美國Waters公司W(wǎng)aters 2695超高效液相色譜儀），以標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液濃度（μg/μL）為橫坐標(biāo)（X），對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸分析，計(jì)算回歸方程。

表3 HPLC梯度洗脫程序Table 3 The gradient elution program used in HPLC

1.3.5樣品測定

將1.3.3制備好的供試樣品溶液，在上述色譜條件下分別進(jìn)樣，進(jìn)行熊果苷、綠原酸和CA 3種主效成分含量測定，記錄峰面積，代入線性回歸方程，計(jì)算3種主效成分在不同組織樣品中的含量。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，測定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；用SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素ANOVA方差分析（Duncan法和LSD法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度對(duì)應(yīng)的峰面積，獲得了熊果苷、綠原酸和CA的標(biāo)準(zhǔn)曲線（表4）。結(jié)果顯示3種化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2均大于0.999，呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系。

表4 標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸方程Table 4 Linear regression equation of standard

2.2 2種干燥方式對(duì)成熟葉片3種主效成分含量的影響

2種干燥方式處理后樟葉越桔成熟葉片組織4個(gè)樣品中3種主效成分含量見表5，顯示同一樣品中，CA、綠原酸和熊果苷在NAD處理下的含量均顯著高于HAD處理的，且差異均達(dá)到了極顯著水平（P＜0.01）。在4個(gè)成熟葉片樣品中，NAD處理的CA含量是HAD處理的4.50～19.46倍，其中ML-ZX樣品差異最高，ML-YQ樣品差異最低；NAD處理的綠原酸含量是HAD處理的4.04～9.49倍，其中ML-XC-02樣品差異最高，ML-YQ樣品差異最低；NAD處理的熊果苷含量是HAD處理的1.38～5.63倍，其中ML-XC-01樣品差異最高，ML-YQ樣品差異最低。表明NAD和HAD 2種不同干燥方式顯著影響樟葉越桔成熟葉片組織中3種主效成分的提取含量，NAD處理的高，HAD處理的低。

表5 2種干燥方式處理下樟葉越桔成熟葉片中3種主效成分含量（n=3）Table 5 Contents of 3 main effective ingredients in mature leaves of V. dunalianum after drying by 2 different methods (n=3)

NAD和HAD 2種不同干燥方式還影響著樟葉越桔成熟葉片組織中3種主效成分含量的高低順序規(guī)律。圖2顯示，NAD處理的所有成熟葉片樣品中3種主效成分含量均表現(xiàn)穩(wěn)定的高低規(guī)律，為CA＞綠原酸＞熊果苷。HAD處理下，樣品ML-XC-01和ML-YQ中3種主效成分含量高低規(guī)律表現(xiàn)出與NAD處理的一致，但在樣品ML-XC-02和ML-ZX中則表現(xiàn)為綠原酸＞CA＞熊果苷的高低順序；且同一采樣地新村村的2個(gè)樣品ML-XC-01（CA＞綠原酸＞熊果苷）和MLXC-02（綠原酸＞CA＞熊果苷）3種主效成分含量高低規(guī)律也不同。表明NAD比HAD處理獲得的樟葉越桔成熟葉片組織中3種主效成分含量的高低規(guī)律更穩(wěn)定。

圖2 樟葉越桔成熟葉片3種主效成分在不同干燥方式處理下和不同采樣地中的含量變化Fig. 2 Changes in the contents of 3 main effective ingredients in mature leaves of V. dunalianum under different drying methods and in different sampling sites

NAD和HAD干燥方式下，同一主效成分在不同樣品中的含量也表現(xiàn)出不同的高低順序。由圖2可知，NAD處理下，CA含量高低順序?yàn)镸L-XC-01＞ML-ZX＞ML-YQ＞ML-XC-02，綠原酸含量高低順序?yàn)镸L-XC-01=ML-ZX＞ML-YQ＞ML-XC-02，熊果苷含量高低順序?yàn)镸L-XC-01＞ML-ZX＞ML-XC-02＞ML-YQ；而HAD處理下，CA和綠原酸含量高低順序均為ML-YQ＞MLXC-01＞ML-ZX＞ML-XC-02，熊果苷含量高低順序 為ML-YQ＞ML-XC-02＞ML-XC-01＞ML-ZX；除在ML-XC-01和ML-ZX樣品中，HAD處理下熊果苷含量和NAD處理下的綠原酸含量在0.05水平無顯著差異外，各主效成分含量在不同樣品中均表現(xiàn)出顯著差異（P＜0.05）。表明NAD和HAD 2種不同干燥方式也影響著各主效成分在不同采樣地樟葉越桔成熟葉片組織中含量的變化規(guī)律。

2.3 2種干燥方式對(duì)不同組織部位3種主效成分含量的影響

應(yīng)用NAD和HAD 2種干燥方式處理樟葉越桔幼嫩葉片和花芽，結(jié)果（表6）顯示在幼嫩葉片和花芽組織中，CA、綠原酸和熊果苷在NAD處理下的含量均顯著高于HAD處理的（P＜0.05），這與成熟葉片組織中的結(jié)果一致。在幼嫩葉片TL-HP樣品中，NAD處理的CA、綠原酸和熊果苷的含量分別是HAD處理的2.35、8.72、1.43倍；在花芽FB-ZX樣品中，NAD處理的CA、綠原酸和熊果苷的含量分別是HAD處理的22.88、10.63、1.18倍。同時(shí)，幼嫩葉片和花芽組織中CA和綠原酸含量在NAD和HAD處理間也達(dá)到了極顯著差異（P＜0.01）。表明NAD處理下樟葉越桔不同組織3種主效成分提取含量均顯著高于HAD。

表6 2種干燥方式處理下樟葉越桔不同組織部位3種主效成分含量（n=3）Table 6 Contents of 3 main effective ingredients in different tissues of V. dunalianum after drying by2 different methods (n=3)

樟葉越桔幼嫩葉片和花芽組織中3種主效成分含量的高低順序規(guī)律同樣受NAD和HAD 2種不同干燥方式的影響。NAD處理下，TL-HP和FB-ZX樣品中3種主效成分含量均表現(xiàn)為CA＞綠原酸＞熊果苷（圖3），這與在成熟葉片組織中呈現(xiàn)的高低規(guī)律性（圖2）相一致。HAD處理下，3種主效成分在TL-HP和FB-ZX樣品中卻表現(xiàn)出不同的含量高低順序，前者同NAD處理，后者為綠原酸＞CA＞熊果苷。表明不同干燥方式影響樟葉越桔3種主效成分含量高低順序，NAD處理下不同組織中均表現(xiàn)出CA＞綠原酸＞熊果苷的穩(wěn)定規(guī)律，穩(wěn)定性強(qiáng)于HAD處理。

圖3 樟葉越桔幼嫩葉片和花芽中3種主效成分含量受不同干燥方式處理的變化Fig. 3 Changes in the contents of 3 main effective ingredients in tender leaves and flower buds of V. dunalianum under different drying methods

3 結(jié)論與討論

干燥是植物加工過程中常見的方法，不同干燥方式會(huì)對(duì)植物產(chǎn)品物理特性及化學(xué)成分存在不同程度的影響[27-33]。NAD和HAD是被普遍應(yīng)用，且操作較簡便、易行的2種干燥方式。研究表明，相比HAD，NAD是保存甜藤（Paederia scandens）莖中黃酮成分[29]、橘（Citrus reticulata）皮中黃酮成分[30]和喜樹（Camptotheca acuminata）果中喜樹堿[31]等化學(xué)成分高含量的合理方法。本研究發(fā)現(xiàn)NAD在保存樟葉越桔葉和花芽等不同組織部位中CA、綠原酸和熊果苷3種主要化學(xué)成分含量方面顯著優(yōu)于HAD。同樣NAD法處理獲得的金銀花（忍冬）（Lonicera japonica）葉[35-36]、杜仲（Eucommia ulmoides）葉[37]和皮[38]、豬毛蒿（Artemfsfa scoparia）[39]和亳菊（Dendranthema morifolium）[40]等不同材料、不同組織中的綠原酸含量也均高于HAD。推測HAD中加熱溫度和時(shí)間會(huì)降低多種植物材料中活性成分含量。

張群等[33]研究表明HAD中熱風(fēng)溫度（50、65、80 ℃）越高，藍(lán)莓（越桔）（Vaccinium vitisidaea）果干中總酚和花青素?fù)p失越多，HAD處理會(huì)使酚類物質(zhì)氧化、集合或分解，從而導(dǎo)致酚類物質(zhì)含量下降，而花青素在高溫環(huán)境下也極易分解。溫度同樣會(huì)影響熊果苷和綠原酸的穩(wěn)定性。熊果苷[41-42]在常溫下較穩(wěn)定，30～40 ℃溫度區(qū)間內(nèi)，熊果苷的活性可達(dá)最佳，溫度高于40 ℃，其水溶液極易分解產(chǎn)生對(duì)苯二酚。綠原酸的分子結(jié)構(gòu)中具鄰位酚羥基，易在多酚氧化酶的作用下氧化縮合成高分子有色物質(zhì)，在一定溫度范圍內(nèi)，隨干燥溫度的升高，多酚氧化酶活性增強(qiáng)，加速綠原酸的氧化與縮合，導(dǎo)致其含量不斷降低[35-37]；綠原酸還是多酚羥基酸性物質(zhì)，熱穩(wěn)定性差，也會(huì)受溫度的影響而分解損失[43-44]。本研究結(jié)果也表明45 ℃的HAD相比室溫的NAD會(huì)顯著降低樟葉越桔不同組織部位中的熊果苷和綠原酸的含量，另外CA含量也顯著下降且下降幅度大于綠原酸和熊果苷。推測CA作為熊果苷的衍生物，其穩(wěn)定性可能受溫度的影響更大，在長時(shí)間HAD（45 ℃）干燥過程中CA極不穩(wěn)定、易降解。建議在以樟葉越桔主成分開發(fā)利用為目的的生產(chǎn)過程中不宜在過高的溫度下進(jìn)行投料。

樟葉越桔葉芽和花芽是其3種主效成分分布較集中的部位[34]。本研究采用NAD處理的武定產(chǎn)野生樟葉越桔3種主效成分含量在不同組織部位中表現(xiàn)為花芽＞成熟葉片＞幼嫩葉片，這符合已知研究結(jié)果[34]。而相對(duì)于花芽和葉芽，樟葉越桔葉片資源充足、數(shù)量大。加大對(duì)樟葉越桔葉片的研究，一方面可以豐富3種主效成分提取的原材料，另一方面在一定程度上可減少對(duì)能產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)效益的花芽、葉芽野生資源的消耗。本研究對(duì)不同地點(diǎn)樟葉越桔野生資源調(diào)查和成熟葉片的研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)選的NAD處理的成熟葉片ML-XC-01樣品中3種主效成分含量約為已知報(bào)道含量[34]的2倍，尤其是CA干質(zhì)量高達(dá)13.61%（表5），提示這為今后樟葉越桔種質(zhì)資源質(zhì)量評(píng)價(jià)、高含量CA優(yōu)良單株資源選育及育種等工作提供了方法和途徑。

綜上所述，NAD和HAD 2種不同干燥方式影響著樟葉越桔不同組織中CA、綠原酸和熊果苷3種主效成分保存含量及含量高低順序規(guī)律，NAD處理的3種主效成分提取含量顯著高于HAD（45 ℃）的，樟葉越桔體內(nèi)3種主效成分含量高低順序在NAD處理下更穩(wěn)定，在不同組織中一致表現(xiàn)為CA＞綠原酸＞熊果苷的規(guī)律。建議在主效成分開發(fā)利用的研究中避免選用HAD對(duì)樟葉越桔樣品進(jìn)行干燥處理。本研究為后續(xù)開展樟葉越桔各組織部位其他干燥方式以及多種干燥方式聯(lián)合的研究提供一定的參考依據(jù)，相信隨著研究的深入，對(duì)于樟葉越桔不同組織部位干燥的方法將會(huì)得到進(jìn)一步的創(chuàng)新。