孫建平，劉雅輝，馬 佳，趙子婧，陸 垚，何宗均，呂晶晶

(1.河北省農(nóng)林科學(xué)院 濱海農(nóng)業(yè)研究所，河北唐山 063299；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所，石家莊 050051；3.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，天津 300000)

水稻秸稈含有大量有機(jī)質(zhì)及植物生長所必須的氮、磷、鉀及其他微量元素，是農(nóng)田養(yǎng)分循環(huán)利用的基礎(chǔ)[1-2]。冀東濱海地區(qū)水稻種植面積約為6.67萬hm2，秸稈產(chǎn)生量約為65萬～70萬t，由于缺乏秸稈高效利用技術(shù)，大多數(shù)被直接焚燒，不僅造成大量生物質(zhì)資源的浪費(fèi)和大氣污染，而且對土壤生態(tài)系統(tǒng)造成嚴(yán)重的破壞[3]。近年來，當(dāng)?shù)卣罅μ岢斩捴苯舆€田，但由于北方秋冬季節(jié)氣溫偏低且持續(xù)時(shí)間長，秸稈粉碎后在田間自然狀態(tài)下腐熟慢，不利于田間耕作和農(nóng)藝操作[4-6]，特別是自然狀態(tài)下腐熟時(shí)恰逢水稻緩秧分蘗期，土壤中大量CH4、N2O、CO2和有機(jī)酸產(chǎn)生，嚴(yán)重影響水稻秧苗根系的生長[7]，秸稈降解慢、不充分是制約該區(qū)域秸稈還田的關(guān)鍵因素，限制了北方水稻秸稈還田的大面積推廣應(yīng)用。

目前，添加腐熟劑是解決秸稈快速腐解的主要措施[8-9]。研究表明腐熟劑促進(jìn)秸稈分解[10]，減少溫室氣體排放[11]，有利于改良土壤理化性狀[12]和微生物群落活性與多樣性的提高[13-14]，增加產(chǎn)量[12]，并且還可以固定鉻[15]。但秸稈還田條件下腐熟劑與土壤質(zhì)地間響應(yīng)不同[16]，水稻田干濕交替，需要厭氧和好氧微生物群落的交替作用,市面上的大多數(shù)產(chǎn)品以好氧微生物居多，加上低溫環(huán)境下微生物難以生長，活性降低，田間效果不理想，因此，亟需尋求在低溫條件下可以啟動(dòng)的微生物產(chǎn)品，用于北方水稻秸稈直接還田。

低溫復(fù)合菌系因其可以實(shí)現(xiàn)腐解的快速啟動(dòng)，并產(chǎn)生大量有益微生物，引起了各類學(xué)者的廣泛關(guān)注，目前較多應(yīng)用于玉米秸稈及牛羊雞豬糞等多種廢棄資源的堆肥中[17-19]，而在北方水稻秸稈直接還田應(yīng)用中研究很少。農(nóng)田秸稈綜合利用課題組前期從冀東濱海稻區(qū)水稻秸稈還田土壤中通過低溫脅迫、富集篩選、拮抗試驗(yàn)、組合構(gòu)建了由白蟻菌、長柄木霉、芬萊氏鏈霉菌、葡萄球菌等組成的低溫復(fù)合菌系HT20，并初步應(yīng)用于冀東稻區(qū)水稻秸稈還田，實(shí)現(xiàn)了低溫環(huán)境下秸稈的快速腐解。為了更好地發(fā)揮其作用，本研究以低溫復(fù)合菌系HT20為研究對象，采用響應(yīng)曲面法(response surface method，RSM)，通過室內(nèi)培養(yǎng)和大田微區(qū)試驗(yàn)，研究HT20添加量、尿素添加量、溫度和含水率及其互作對秸稈腐解率的影響，預(yù)測HT20作用下秸稈的最佳腐解條件，并與市面常用的4種秸稈腐熟劑進(jìn)行比較，分析其對秸桿的腐解程度和土壤的肥力影響，闡釋其對水稻秸稈的腐解效果和適應(yīng)性，為低溫復(fù)合菌系HT20應(yīng)用水稻秸稈還田提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)與概況

研究區(qū)域位于河北省唐山市曹妃甸區(qū)濱?，F(xiàn)代農(nóng)業(yè)綜合試驗(yàn)站(39°16′31″N，118°27′5.14″E)，距渤海約4.5 km，海拔2.5～4.3 m，該地區(qū)屬于東部季風(fēng)區(qū)暖溫帶半濕潤季節(jié)型近海大陸性氣候，具有光照充足，降水集中，雨熱同期，四季寒暖干濕分明等氣候特征[20]。2010—2019年月平均氣溫12.3 ℃，蒸發(fā)量平均為1 969 mm，冬季盛行偏西北風(fēng)，春、夏季盛行偏南和東南風(fēng)，秋季多偏西南風(fēng)。年降水量為635.9 mm，主要集中在7—8月份。

1.2 試驗(yàn)材料

盆栽試驗(yàn)的土壤來源于長期種植水稻的土壤，土壤類型為鹽漬型濱海粘壤土，0～20 cm耕層土壤理化性質(zhì)：電導(dǎo)率為602 μS·cm-3，pH為8.16，有機(jī)質(zhì)5.45 g·kg-1，速效磷24.35 mg·kg-1，速效鉀102.71 mg·kg-1，速效氮為30.56 mg·kg-1，體積質(zhì)量為1.45 g·cm-3。還田秸稈選用前茬水稻所產(chǎn)生的秸稈，水稻秸稈的養(yǎng)分含量：C/N 67，全氮為0.68%，全磷為 0.13%，全鉀為1.34%，選用河北省農(nóng)林科學(xué)院濱海農(nóng)業(yè)研究所自研水稻品種‘墾育979’。供試腐熟劑分別為低溫復(fù)合菌系HT20(自研)；農(nóng)富康(農(nóng)富康生物科技有限公司)；還田寶(北京百豐天下生物科技有限公司)；春雨(蘇州農(nóng)旺生物科技有限公司)；啟明(湖北啟明生物工程有限 公司)。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品采集

1.3.1 低溫復(fù)合菌系HT20高效腐解條件優(yōu)化 以溫度、含水量、HT20添加量、尿素添加量為試驗(yàn)因素，各因素設(shè)置3個(gè)試驗(yàn)水平，采用Design-expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken方法進(jìn)行設(shè)計(jì)(表1)，其中有5個(gè)重復(fù)中心點(diǎn)，共29個(gè)處理，各處理均設(shè)置5個(gè)重復(fù)。在已滅菌的250 mL錐形瓶中加入秸稈5.000 g，然后按照設(shè)計(jì)加入相應(yīng)量的HT20和尿素，采用無菌水調(diào)節(jié)含水率，封口膜封口，置于相應(yīng)溫度的恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。30 d后，取出錐形瓶測定秸稈腐解率。

表1 試驗(yàn)因素與試驗(yàn)水平

1.3.2 不同腐熟劑對水稻秸稈還田土壤和秸稈腐解效果 設(shè)置未施用腐熟劑秸稈直接還田為對照(CK)，施用低溫復(fù)合菌系HT20秸稈還田(低溫復(fù)合菌系)、施用農(nóng)富康秸稈直接還田(農(nóng)富康)、施用還田寶秸稈直接還田(還田寶)、施用春雨秸稈直接還田(春雨)、施用啟明秸稈直接還田(啟明)，共6個(gè)試驗(yàn)處理。建立大田微區(qū)，每個(gè)微區(qū)規(guī)格為600 cm×200 cm×60 cm，其中擺滿塑料桶(規(guī)格56 cm×58 cm)，桶四周及底部扎孔增加土壤的透氣與水分的流出，桶與桶之間的縫隙用土填滿，每個(gè)處理安排在一個(gè)微區(qū)中，3個(gè)微區(qū)為3次重復(fù)，防止微區(qū)之間相互污染，降低試驗(yàn)誤差。試驗(yàn)采用尼龍網(wǎng)袋填埋法，尼龍網(wǎng)袋規(guī)格為長×寬=50 cm×45 cm，孔徑為0.178 mm，以隔離土壤。供試稻草剪切至約5 cm放入尼龍網(wǎng)袋中，用尼龍線綁好袋口，水稻秸稈還田量按10 500 kg·hm-2算，每袋裝稻草262 g，于2019年11月23日施用腐熟劑處理每袋加入1 g與秸稈進(jìn)行混勻后埋入塑料桶中土下15～20 cm處，未施用腐熟劑直接埋入。于2020年5月中旬移栽水稻秧苗，插秧密度按照30 cm×16 cm，每穴5株。各處理全生育期田間管理與常規(guī)田間管理措施。

各處理于秧苗移栽后30 d、90 d和150 d時(shí)取5袋樣品，清理干凈尼龍網(wǎng)袋上的土粒，烘干，測定秸稈的殘留量，計(jì)算秸稈腐解率。土壤樣品在拔去水稻根后，自主根系位置自上而下(從表面至塑料桶底，約20～25 cm深)，用土鉆(鉆頭直徑為3.8 cm)，取下約500 g土壤樣品，帶回實(shí)驗(yàn)室，200 g新鮮的土樣用于測定微生物，300 g土樣在通風(fēng)處自然風(fēng)干，去根系雜質(zhì)，過篩，用于測定土壤的化學(xué)性質(zhì)。

1.4 測定方法

土壤微生物采用經(jīng)典的稀釋平板法[21]，其中細(xì)菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；真菌采用PDA培養(yǎng)基；放線菌采用改良高氏1號(hào)培養(yǎng)基、有機(jī)質(zhì)含量采用重鉻酸鉀外加熱法測定；速效磷采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測定；速效鉀采用原子吸收分光光度計(jì)法測定[22]。

秸稈腐解速率=(原始秸稈質(zhì)量-剩余秸稈質(zhì)量)/t

秸稈殘余率=剩余秸稈干質(zhì)量/原始秸稈干質(zhì)量×100%

為進(jìn)一步比較不同處理秸稈腐解動(dòng)態(tài)，本研究用修正后的Olson指數(shù)衰減模型來擬合[23]，其形式為：y=x/x0=e-kt

公式中，y為秸稈腐解殘余率(%)；x0、x分別為腐解開始時(shí)和腐解后t時(shí)的秸稈量(kg)；k為腐解速率常數(shù)，k越大，分解速度越快。

根據(jù)公式y(tǒng)=x/x0=e-kt中的k來計(jì)算秸稈分解50%(T50)和95%(T95)所需的時(shí)間(d)，計(jì)算公式為：T50=ln0.5/(-k)，T95=ln0.05/(-k)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及回歸方程方差分析，采用 Excel 2017進(jìn)行原始數(shù)據(jù)的整理與作圖；采用SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)比較不同處理間差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 回歸模型的建立

對影響秸稈腐解率的4個(gè)關(guān)鍵因素進(jìn)行試驗(yàn)，利用Design-Expert軟件中Box-Behnken 設(shè)計(jì)了29組試驗(yàn)(表2)，其中有5個(gè)重復(fù)中心點(diǎn)，結(jié)果顯示腐解率為7.69%～62.27%。對數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合獲得腐解率的二次多項(xiàng)式回歸模擬方程為：R=-25.872 35+0.479 81A+ 0.863 86B+16.344C-63.606 67D+ 0.015 573AB-0.085 333AC+17.766 67AD+0.06BC+1.422BD+5.5CD+0.000 752 593A2-0.006 432 27B2-17.000 67C2-1 696.066 67D2。式中，R為秸稈腐解率(%)，A為溫度(℃)，B為含水率(%)，C為尿素添加量(mg)，D為HT20添加量(g)。

表2 Box-Behnken 設(shè)計(jì)的不同試驗(yàn)處理及其響應(yīng)值

對秸稈腐解率的模擬方程求極值得知，當(dāng)溫度為5 ℃，含水率為80.76%，HT20添加量為 0.04 g，尿素添加量為0.6 mg時(shí)，秸稈的腐解率可達(dá)到22.6%；當(dāng)溫度為10.86 ℃，含水率為90%，HT20添加量為0.080 g，尿素添加量為 0.600 mg時(shí)，秸稈的腐解率可達(dá)到36.7%；當(dāng)溫度 20 ℃，含水率為88.59%，HT20添加量為 0.080 g，尿素添加量為0.300 mg時(shí)，秸稈的腐解率可達(dá)到64.09%。表明低溫復(fù)合菌系HT20在 5～20 ℃可以腐解秸稈。

2.2 回歸模型的方差分析和方程回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)

為了檢驗(yàn)方程的有效性，對腐解率的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析(表3)，模型的P值小于 0.000 1，模型極顯著。模型方程失擬項(xiàng)P值為 0.286 3，差異不顯著。說明秸稈腐解率與溫度、含水率、尿素添加量、HT20添加量之間具有高度的相關(guān)性(R2=0.955 1)，校正相關(guān)系數(shù)AdjR2為 0.910 1，說明腐解率的模擬模型與實(shí)際情況高度吻合。

從回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)(表3)可以看出，4因素的顯著性概率為溫度≈含水率

表3 回歸模型的方差分析和回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

2.3 響應(yīng)曲面結(jié)果分析

由溫度、含水率、HT20添加量和尿素添加量4因素交互作用對秸稈腐解率影響的三維空間響應(yīng)曲面圖(圖1)可以形象地看出最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用。從溫度和含水率交互作用影響秸稈腐解率的曲面圖可知(圖1-A)，當(dāng)HT20添加量為0.050 g，尿素添加量為0.500 mg，若含水率固定時(shí)，腐解率隨溫度升高而增加，若溫度固定時(shí)，腐解率隨含水率增加而增加，變化幅度大。通過顏色可以看出溫度與含水率交互作用對秸稈腐解率影響顯著。

溫度和HT20添加量交互作用影響秸稈腐解率的曲面圖可知(圖1-B)，當(dāng)含水率65%，尿素添加量0.500 mg時(shí)，若HT20添加量固定時(shí)，腐解率隨溫度升高呈增大的趨勢，且變化幅度明顯；若溫度固定時(shí)，腐解率隨HT20添加量的增加呈先增加后降低的趨勢，并出現(xiàn)了拐點(diǎn)。通過顏色可以看出溫度與HT20添加量交互作用對秸稈腐解率影響顯著。

HT20添加量和尿素添加量交互作用影響秸稈腐解率的曲面圖可知(圖1-C)，當(dāng)溫度 12.5 ℃，含水率65%，若HT20添加量固定時(shí)，腐解率隨尿素添加量呈先增加后降低的趨勢，變化比較緩慢，若尿素添加量固定時(shí)，腐解率隨HT20添加量呈先增加后降低的趨勢，變化比較緩慢，并出現(xiàn)了拐點(diǎn)。HT20添加量和尿素添加量交互作用對秸稈腐解率影響不顯著。

HT20添加量和含水率交互作用影響秸稈腐解率的曲面圖可知(圖1-D)，當(dāng)溫度12.5 ℃，尿素添加量為0.500 mg，若含水率固定時(shí)，腐解率隨HT20添加量呈先增加后降低的趨勢，并出現(xiàn)了拐點(diǎn)；若HT20添加量固定時(shí)，腐解率隨含水率的增加而增加，變化幅度較明顯。HT20添加量與含水率交互作用對秸稈腐解率影響不顯著。

2.4 HT20對冀東稻區(qū)還田秸稈腐解效果的影響

由圖2-A可知，秸稈腐解速率隨時(shí)間的變化呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。與不添加腐熟劑(CK)和常用腐熟劑相比，在秧苗移栽30 d，低溫復(fù)合菌系HT20增加秸稈的腐解速率28.31%～81.46%；在秧苗移栽90 d，低溫復(fù)合菌系HT20增加秸稈的腐解速率20.10%～35.11%；在秧苗移栽150 d，低溫復(fù)合菌系HT20增加秸稈的腐解速率31.68%～53.61%。由圖2-B可知，與不添加腐熟劑(CK)和常用腐熟劑相比，秸稈分解50%所需時(shí)間提前17.62～42.44 d，秸稈分解95%所需時(shí)間提前50.12～183.41 d，表明HT 20可以加快冀東稻區(qū)還田秸稈的腐解速度。

2.5 HT20對水稻秸稈還田土壤的影響

通過對秧苗移栽30 d和150 d的土壤進(jìn)行速效磷、速效鉀、有機(jī)質(zhì)、細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量的測定(圖3)，采用雷達(dá)圖對多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行數(shù)值分析，面積越大的處理，就表示指標(biāo)值越好。結(jié)果顯示，低溫復(fù)合菌系HT20在5種腐熟劑中效果是較好的。與不添加腐熟劑(CK)和常用腐熟劑相比，低溫復(fù)合菌系HT20增加了速效磷5.44%～71.49%、速效鉀19.62%～56.23%、有機(jī)質(zhì) 6.86%～57.27%、細(xì)菌21.29%～76.14%、真菌 1.57%～64.49%、放線菌15.15%～76.14%，表明冀東稻區(qū)水稻秸稈還田配施低溫復(fù)合菌系HT20可以增加土壤的養(yǎng)分含量和微生物數(shù)量。

3 討論與結(jié)論

秸稈還田是當(dāng)今世界上普遍重視的一項(xiàng)培肥地力的增產(chǎn)措施，在杜絕秸稈焚燒所造成的大氣污染的同時(shí)還有增肥增產(chǎn)作用[24-26]。秸稈還田的效果和秸稈的腐爛速度有直接關(guān)系。秸稈腐爛越快對土地的效果越好，而秸稈腐爛的速度除了與自身?xiàng)l件有關(guān)以外，還與土壤質(zhì)地[27]、水熱條件[28]和外源氮[29]有很大關(guān)系。本研究通過響應(yīng)曲面法RSM分析得出溫度、含水率和低溫復(fù)合菌系HT20添加量是影響秸稈腐解率的關(guān)鍵因素，原因可能為溫度和含水率通過影響土壤中一些微生物群落的生長繁殖和生理機(jī)能，低溫復(fù)合菌系HT20通過直接增加微生物的種類和數(shù)量，影響秸稈分解速率。低溫復(fù)合菌系HT20添加量與溫度、含水率的交互作用對秸稈腐解率影響顯著，這與以往單一因素對秸稈腐解的研究不同，本研究可同時(shí)考慮影響因素單獨(dú)作用及交互作用對秸稈腐解率影響的顯著性。從響應(yīng)曲面圖(圖1)中，低溫復(fù)合菌系HT20添加量與溫度、含水率的交互作用對秸稈腐解率的影響過程中，隨著HT20添加量的增加，秸稈腐解率出現(xiàn)了拐點(diǎn)，說明HT20添加量與秸稈的腐解效果不是完全成正比，拐點(diǎn)即為最佳添加量。此外，HT20添加量與尿素添加量交互作用對秸稈腐解率影響不顯著。因此，在施用HT20時(shí)不需額外施用尿素，施用方法簡單，這與大多數(shù)腐熟劑不同。在我國的北方地區(qū)，冬季非常寒冷，微生物活性較低，秸稈2 a不能實(shí)現(xiàn)完全腐化，對于下年種植水稻十分不利。本研究從本地水稻秸稈還田土壤中篩選出可在5 ℃生長的纖維素分解菌株，通過低溫脅迫、富集篩選、拮抗試驗(yàn)、組合構(gòu)建了主要由白蟻菌、長柄木霉、芬萊氏鏈霉菌、葡萄球菌等組成的低溫復(fù)合菌系HT20，并應(yīng)用水稻秸稈還田研究中，與不添加腐熟劑(CK)和常用腐熟劑相比，低溫復(fù)合菌系HT20不僅提高秸稈的腐解速率，縮短腐解時(shí)間，同時(shí)還增加土壤的養(yǎng)分和微生物數(shù)量。利用Design-Expert軟件對秸稈腐解率的數(shù)學(xué)模型求極值得知HT20在5～10 ℃時(shí)候的腐解率可達(dá)22.6%～36.7%，說明低溫復(fù)合菌系HT20可以在低溫條件下氧化外源物質(zhì)，降低微生物的啟動(dòng)溫度，在水稻秧苗移栽前即可完成秸稈部分分解，釋放養(yǎng)分，減少對水稻根系生長的影響。依據(jù)該地區(qū)氣候條件可知，冀東稻區(qū)在11月左右水稻收獲后施用低溫復(fù)合菌系HT20直接還田，并進(jìn)行適量灌水處理，可以滿足秸稈腐解需要的溫度、水分和微生物，還可以消滅越冬害蟲，為解決冀東稻區(qū)冬季秸稈原位還田腐解困難問題提供技術(shù)支撐。