程志芬 ，楊 磊，郭留云

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔科 鄭州 450052 2)濟源市人民醫(yī)院口腔科 河南濟源 454650

慢性牙周炎是常見的口腔疾病之一，嚴重者可導(dǎo)致牙齒松動脫落，影響咀嚼，降低人們的生活質(zhì)量[1]。我們前期研究[2]發(fā)現(xiàn)，Hedgehog(Hh)信號通路的配體Shh、IL-6在牙周炎齦溝液中均高表達，提示Hh信號通路可能參與調(diào)節(jié)牙周炎癥反應(yīng)。TNF-α作為炎癥因子[3]，其與Hh信號通路是否有關(guān)尚未明確。本研究對牙周炎患者的牙齦組織中Shh、TNF-α和IL-6的表達水平進行了檢測，分析其與菌斑指數(shù)(plaque index,PLI)、牙齦出血指數(shù)(gingival bleeding index,BI)、牙周袋深度(periodontal probing depth,PD)、臨床附著喪失(clinical attachment loss,CAL)之間的相關(guān)性，探討其可能在慢性牙周炎發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器兔抗人Shh、TNF-α、IL-6抗體(美國Abcam公司)；HRP標記的山羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限責(zé)任公司)；免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 病例選擇選取從2018年5月至2019年7月于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔科就診的符合納入標準的慢性牙周炎患者共60例(男33，女27)，按牙周炎嚴重程度[2]分為輕、中、重3組，每組各20例。另選取行牙冠延長術(shù)的牙周健康者20例為健康對照(男10女10)。納入標準：①近3個月內(nèi)無抗生素及類固醇類藥物服用史，無牙周基礎(chǔ)治療史。②無全身系統(tǒng)性疾病如高血壓、糖尿病等。③無個人吸煙史。④無家族遺傳史。⑤女性患者未處于月經(jīng)、妊娠、哺乳期。⑥知情同意。

1.3 臨床指標的測定根據(jù)Quigley-Hein法檢查并記錄全口牙位的PLI，以0～5級計分；根據(jù)Mazza記分法檢查并記錄BI，以0～5級計分；采用Williams刻度的牙周探針探查PD到釉質(zhì)牙骨質(zhì)連接處的距離，計算CAL值[4]。

1.4 牙齦樣本的收集健康對照組和輕度慢性牙周炎組：行牙冠延長術(shù)切除的牙齦；中度慢性牙周炎組和重度慢性牙周炎組：行牙周翻瓣術(shù)切除的牙齦，或部分松動牙拔除后進行牙齦修整時切除的牙齦。切除的牙齦組織置40 g/L多聚甲醛中固定。

1.5 牙齦組織中Shh、TNF-α和IL-6蛋白的免疫組化檢測采用免疫組化SP法。牙齦組織常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚切片，脫蠟水化，EDTA緩沖液修復(fù)，按照試劑盒說明書進行Shh、TNF-α和IL-6蛋白的免疫組化SP染色。以細胞核和(或)細胞質(zhì)出現(xiàn)棕褐色或黃褐色顆粒為陽性表達，光學(xué)顯微鏡觀察。采用醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，隨機選取5個視野(×400)，測定光密度(OD)，求出平均值，代表目的蛋白的表達水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 22.0進行分析，各組基本資料、牙周臨床指標的比較采用χ2檢驗或單因素方差分析(組間兩兩比較采用LSD-t檢驗)。蛋白表達與牙周臨床指標的相關(guān)關(guān)系采用Pearson相關(guān)性分析。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 受試對象基本資料各組性別和年齡見表1。

表1 4組受試者性別和年齡比較

2.2 各組牙周臨床指標的比較結(jié)果見表2。

表2 4組PD、CAL、PLI、BI測定結(jié)果

2.3 各組牙齦組織中Shh、TNF-α和IL-6蛋白的表達各組牙齦組織上皮層及固有層Shh、TNF-α和IL-6蛋白均有陽性表達。健康對照組中以上蛋白表達量少且較弱。輕、中、重度慢性牙周炎組，Shh、TNF-α和IL-6蛋白表達水平逐漸增加(圖1、表3)。

A：健康對照組;B：輕度慢性牙周炎組;C：中度慢性牙周炎組;D：重度慢性牙周炎組

表3 各組牙齦組織中Shh、TNF-α、IL-6蛋白的表達

2.4 牙齦組織中Shh、TNF-α、IL-6表達水平與牙周臨床指標的相關(guān)性牙齦組織中Shh、TNF-α和IL-6的表達與牙周臨床指標PD、CAL、BI呈正相關(guān)(表4)。

表4 牙齦組織中Shh、TNF-α和IL-6表達水平與PD、CAL、PLI、BI的相關(guān)性 r(P)

3 討論

牙周炎是牙列缺損、缺失的主要病因之一。牙菌斑是始動因子，菌斑內(nèi)的細菌及其產(chǎn)物持續(xù)刺激牙齦，牙齦組織發(fā)生免疫炎癥反應(yīng)，無外界干預(yù)下可持續(xù)發(fā)展，導(dǎo)致牙齦組織破壞、牙槽骨吸收，最終導(dǎo)致牙齒脫落[5]。牙周炎除了引起牙齒周圍支持組織的破壞外，對心血管疾病、糖尿病等系統(tǒng)性疾病也存在潛在的影響[6]。因此，明確牙周炎發(fā)生發(fā)展機制，對牙周炎的診療和預(yù)防具有重要意義。

TNF-α可與牙齦上皮細胞表達的受體結(jié)合，誘導(dǎo)牙齦上皮細胞表達破骨細胞分化因子[7]；同時作為促炎因子，促進牙齦上皮細胞和成纖維細胞凋亡，可加重炎癥對組織的破壞程度[8-9]。有研究[10-12]發(fā)現(xiàn)在健康志愿者和牙周炎患者的齦溝液中均有TNF-α表達，但健康對照的表達較低，且齦溝液中TNF-α的表達與牙周臨床指標齦指數(shù)、BI、PD、CAL顯著相關(guān)。IL-6是一種四螺旋結(jié)構(gòu)的細胞因子，與TNF-α一樣，在牙周炎的免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。IL-6與其受體結(jié)合后再與牙齦成纖維細胞結(jié)合，刺激牙齦成纖維細胞表達基質(zhì)金屬蛋白酶1，引起細胞外基質(zhì)的破壞。同時，IL-6可通過刺激成骨細胞釋放破骨細胞分化因子RANKL，激活破骨細胞，造成骨組織破壞[13]。有研究[14]發(fā)現(xiàn)，牙周炎牙齦組織內(nèi)IL-6表達高于健康對照，同時IL-6在慢性牙周炎齦溝液中也高表達，且與牙周臨床指標PD、CAL、PI相關(guān)[15]。本研究結(jié)果顯示，TNF-α和IL-6在健康對照組中有微量表達，在慢性牙周炎組隨著炎癥程度增加表達增多。TNF-α和IL-6的表達與PD、CAL和BI均呈正相關(guān)，與PLI無相關(guān)性。以上結(jié)果提示TNF-α和IL-6參與慢性牙周炎的發(fā)展進程且具有重要的促進作用，隨著其表達量的增加，出血、附著喪失等牙周炎臨床癥狀加重。

Shh是Hh信號通路的配體之一，Hh信號通路參與胚胎發(fā)育、干細胞維持、組織修復(fù)再生以及腫瘤發(fā)生發(fā)展等過程[16-18]。Shh與細胞膜上的受體Ptch結(jié)合，激活Hh信號通路，調(diào)控靶基因的表達。有研究[19]顯示，Shh在小鼠急性胰腺炎組織中高表達，抑制Shh后胰腺組織的破壞加重，Shh可通過調(diào)節(jié)IL-10表達實現(xiàn)對急性胰腺炎的保護作用。Shh在慢性膽囊炎膽囊組織中的表達同樣增高，且隨著炎癥程度的增加表達增高[20]。研究[21]發(fā)現(xiàn)，抑制Shh信號通路，TNF-α和IL-6在佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨中的表達降低，減弱了骨組織的破壞和炎癥細胞的浸潤。本研究結(jié)果顯示，Shh在健康對照組中表達較低，在慢性牙周炎中高表達，且隨著炎癥程度的增加，Shh的表達也增高。同時Shh與牙周臨床指標PD、CAL、BI呈正相關(guān)。

總之，TNF-α和IL-6作為促炎因子在慢性牙周炎發(fā)展過程中的作用不容忽視，Shh參與的Hh信號通路可能參與牙周炎的發(fā)生發(fā)展過程，在慢性牙周炎炎癥因子的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮作用；Shh可能成為判斷慢性牙周炎發(fā)生發(fā)展的新指標。