陳 恒，劉迎春，劉育秀，田仁美，周新穎，于利偉，謝彥周，高 欣

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

在植物體內(nèi)，羥基化氨基酸可用來(lái)治療抑郁癥、糖尿病、癌癥等疾病[1-5]。目前主要有三種途徑獲?。簭暮辛u基化氨基酸的物種中提取、化學(xué)合成和生物催化法。其中，提取和化學(xué)合成過(guò)程繁瑣、效率低下[6]。與之相比，生物催化法不僅高效快速，而且具有高對(duì)映選擇性，因此，發(fā)掘和利用高效穩(wěn)定的羥基化酶尤為重要[4]。

Clavaminate Synthase-Like(CSL)家族是一類非血紅素鐵和α-酮戊二酸依賴的氧化還原酶家族，可催化氨基酸羥基化[7]。該家族的VioC、MppO和AsoN酶在抗生素紫霉素、甘露霉素、達(dá)托霉素的合成中，可催化L-精氨酸、L-天冬酰胺的羥基化[8-10]。CSL家族酶類在輔因子Fe2+、α-酮戊二酸和O2的共同作用下，經(jīng)過(guò)復(fù)雜的特異位點(diǎn)配位鍵結(jié)合、代換和釋放過(guò)程，可將氨基酸底物羥基化并釋放出CO2和琥鉑酸[7]。Bastard等[7]研究發(fā)現(xiàn)，CSL酶具有高度的區(qū)域和立體結(jié)構(gòu)選擇性，以及嚴(yán)格的底物特異性。

CSL家族相關(guān)基因的研究大多局限于微生物中，在模式植物擬南芥中也僅有初步研究。Bitto等[11]通過(guò)研究擬南芥At3g21360基因編碼蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，證實(shí)該蛋白屬于CSL家族，這是植物中首個(gè)被研究報(bào)道的CSL基因。異源六倍體小麥由于基因組龐大、基因拷貝數(shù)多等問(wèn)題，基因克隆和功能解析研究工作在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)受到制約[12-13]。近幾年來(lái)，基因組測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展、小麥全基因組參考序列的發(fā)布以及基因組重測(cè)序項(xiàng)目的推進(jìn)，促進(jìn)了小麥重要功能基因的克隆和重要性狀的分子機(jī)制研究等工作[14]。羥基化氨基酸早已被人們認(rèn)識(shí)和使用，但是小麥CSL基因的發(fā)掘以及該基因表達(dá)特性和生物學(xué)功能的研究還未見報(bào)道。因此，本研究以中國(guó)春為材料，以擬南芥基因At3g21360(GenBank Accession：NC_003074.8)序列為探針，比對(duì)小麥全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)TaCSL1基因進(jìn)行同源克隆，利用生物信息學(xué)分析該基因及其編碼蛋白序列，采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析該基因的時(shí)空表達(dá)模式，以期明確該基因的基本結(jié)構(gòu)和表達(dá)特征，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用小麥材料為中國(guó)春，于2018-2019年種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院作物標(biāo)本區(qū)試驗(yàn)地(108°4′E，34°16′N)，株距5 cm，行距25 cm，行長(zhǎng)1 m，正常肥水管理。在小麥幼苗期取葉片，用于提取DNA。在小麥苗期、拔節(jié)期、孕穗期、抽穗期以及開花后9 d和25 d，分別取小麥根、葉片、節(jié)間、旗葉鞘、穗下莖、幼穗、穎殼、雌蕊、雄蕊、籽粒等組織樣品，液氮速凍后，保存于 -80 ℃冰箱，用于提取RNA。

1.2 DNA、RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

采用CTAB法[15]提取小麥葉片全基因組DNA，并用核酸蛋白分析儀(Nano Drop 2000)檢測(cè)DNA濃度，根據(jù)所測(cè)濃度稀釋至100 ng·μL-1作為工作液，-20 ℃保存。使用RNA提取試劑盒Tissue RNA Isolation Kit(諾唯贊，南京)提取小麥不同生長(zhǎng)發(fā)育階段和不同組織部位的總RNA，-80 ℃保存。使用反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒Hiscrip@Q Select RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(諾唯贊，南京)合成cDNA第一鏈，-20 ℃保存。

1.3 TaCSL1基因全長(zhǎng)與基因編碼區(qū)的克隆

以擬南芥At3g21360基因的cDNA序列為探針?biāo)阉鱁nsembl Plants小麥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Tools/Blast?db=core)，得到位于小麥A、B、D三個(gè)亞基因組上的三個(gè)部分同源基因：TraesCS3A02G108700、TraesCS3B02G127700和TraesCS3D02G110500。這三個(gè)基因長(zhǎng)度分別為2 310、2 437和2 472 bp，均包含一個(gè)長(zhǎng)度為 1 005 bp的編碼區(qū)。比對(duì)這三個(gè)同源基因的序列，使用Primer Premier 5在這三條序列的兩端差異部分分別設(shè)計(jì)用于克隆基因全長(zhǎng)和基因編碼區(qū)的引物(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

使用La Taq DNA聚合酶試劑盒(TaKaRa，日本)擴(kuò)增基因全長(zhǎng)和和基因編碼區(qū)。PCR擴(kuò)增體系為50 μL，包含100 ng·μL-1的模板1 μL(擴(kuò)增基因全長(zhǎng)模板為全基因組DNA，擴(kuò)增基因編碼區(qū)模板為cDNA)，10×Buffer 5 μL，200 μmol·L-1的dNTPs 8 μL，5 U·μL-1的La Taq DNA聚合酶1 μL，10 μmol·L-1的上、下游引物各1 μL，ddH2O補(bǔ)齊至50 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，擴(kuò)增基因全長(zhǎng)72 ℃延伸3 min、擴(kuò)增基因編碼區(qū)72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。

使用1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，使用DNA凝膠回收試劑盒(TaKaRa，日本)純化目的基因。將目的基因連接到pMD18-T載體(TaKaRa，日本)上，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(諾唯贊，南京)。過(guò)夜培養(yǎng)后挑取單菌落，使用2×Taq Master Mix DNA聚合酶(諾唯贊，南京)對(duì)陽(yáng)性單克隆進(jìn)行PCR鑒定，由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，每個(gè)基因測(cè)序三個(gè)陽(yáng)性單克隆。使用DNAstar Megalign 5.01進(jìn)行基因編碼區(qū)序列比對(duì)。

1.4 TaCSL1基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

以TaCSL1-3A蛋白序列為探針，在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索不同物種的同源蛋白，使用DNAstar Megalign 5.01進(jìn)行TaCSL1-3A、TaCSL1-3B、TaCSL1-3D和擬南芥At3g21360(XP_002883301.1)蛋白序列的多重比對(duì)。使用MEGA 7.0構(gòu)建基于neighbor-joining的系統(tǒng)發(fā)育樹。運(yùn)用在線工具ExPASy-ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)和InterPro Scan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/)分別預(yù)測(cè)TaCSL1基因編碼蛋白的理化性質(zhì)和保守結(jié)構(gòu)域。

1.5 TaCSL1基因的表達(dá)特性分析

使用Primer Premier 5在TaCSL1-3A、TaCSL1-3B和TaCSL1-3D基因編碼區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)特異性引物(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。使用2×RealStar Green Power Mixture試劑盒(GenStar BioSolution，北京)和StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(ABI，美國(guó))進(jìn)行三個(gè)部分同源基因的表達(dá)量分析。qRT-PCR擴(kuò)增體系為20 μL，包含20 ng·μL-1的cDNA模板1 μL，10 μmol·L-1的上、下游引物各0.5 μL，2×RealStar Green Power Mixture 10 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，ddH2O補(bǔ)齊至20 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min； 95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。目的基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算采用2-△△Ct法[16]，用Excel 2010分析數(shù)據(jù)并作圖。

表1 本研究所用的引物

2 結(jié)果與分析

2.1 TaCSL1基因的克隆與序列分析結(jié)果

以中國(guó)春全基因組DNA為模板，用三對(duì)引物TaCSL1-3A-gF/R、TaCSL1-3B-gF/R和TaCSL1-3D-gF/R分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到全基因組目的產(chǎn)物(圖1A)；以中國(guó)春總cDNA第一鏈為模板，用三對(duì)引物TaCSL1-3A-cF/R、TaCSL1-3B-cF/R和TaCSL1-3D-cF/R分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到編碼區(qū)單一產(chǎn)物(圖1B)。命名該基因?yàn)門aCSL1，來(lái)自A、B、D三個(gè)亞基因組的部分同源基因分別命名為TaCSL1-3A、TaCSL1-3B和TaCSL1-3D。經(jīng)測(cè)序與序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)TaCSL1-3A、TaCSL1-3B、TaCSL1-3D與TraesCS3A02G108700、TraesCS3B02G127700、TraesCS3D02G110500的編碼區(qū)序列一致。三個(gè)部分同源基因均包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，3個(gè)外顯子長(zhǎng)度分別為392 bp、250 bp和363 bp，但內(nèi)含子長(zhǎng)度不同。TaCSL1-3A基因的2個(gè)內(nèi)含子長(zhǎng)度分別為338 bp和683 bp；TaCSL1-3B基因的2個(gè)內(nèi)含子長(zhǎng)度分別為252 bp和788 bp；TaCSL1-3D基因的2個(gè)內(nèi)含子長(zhǎng)度分別為314 bp和812 bp。編碼區(qū)序列比對(duì)結(jié)果表明，三個(gè)部分同源基因之間存在43個(gè)單核苷酸突變位點(diǎn)，其中有義突變11個(gè)，沉默突變32個(gè)(圖2)。TaCSL1-3A和TaCSL1-3B基因的核酸序列相似性為95.7%，TaCSL1-3A和TaCSL1-3D基因的核酸序列相似性為96.3%，TaCSL1-3B和TaCSL1-3D基因的核酸序列相似性為96.4%。TaCSL1-3A和TaCSL1-3B蛋白序列相似性為97.3%，TaCSL1-3A和TaCSL1-3D蛋白序列相似性為97.6%，TaCSL1-3B和TaCSL1-3D蛋白序列相似性為97.9%，說(shuō)明該基因在小麥進(jìn)化過(guò)程中十分保守。

A：基因全長(zhǎng)電泳圖；B：基因編碼區(qū)電泳圖；M1：Maker DL5000；M2：Maker DL2000。箭頭所指為目的條帶。

黃色陰影表示三個(gè)部分同源基因 TaCSL1-3A(GenBank Accession: MW725303)、 TaCSL1-3B(GenBank Accession: MW755354)和 TaCSL1-3D(GenBank Accession: MW755355)之間存在的序列多態(tài)性。

2.2 TaCSL1基因編碼蛋白的生物學(xué)信息

對(duì)TaCSL1基因編碼蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，TaCSL1-3A、TaCSL1-3B和TaCSL1-3D蛋白氨基酸長(zhǎng)度均為334 aa，分子量為36 695.88～36 780.99，理論等電點(diǎn)為 5.48～ 5.59，說(shuō)明該蛋白屬于中性蛋白；帶負(fù)電荷的氨基酸殘基數(shù)均為46，帶正電荷的氨基酸殘基數(shù)為 39～40，總平均親水性為-0.237～-0.217，表明該蛋白為親水蛋白；穩(wěn)定性系數(shù)為48.33～50.17，表明該蛋白不穩(wěn)定。因其序列差異很小， 三個(gè)部分同源基因所編碼的蛋白理化性質(zhì)差異也很小。利用在線工具InterProScan預(yù)測(cè)TaCSL1-3A蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果(圖3)表明，該蛋白第10～331位氨基酸為典型的CSL家族保守結(jié)構(gòu)域，與該家族的其他蛋白具有相似的結(jié)構(gòu)特征。

圖3 TaCSL1-3A蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析

TaCSL1蛋白與擬南芥CSL蛋白的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明，TaCSL1-3A、TaCSL1-3B和TaCSL1-3D蛋白與擬南芥CSL蛋白的相似性分別為69.6%、69.6%和69.0%，蛋白序列C端較N端相對(duì)更保守(圖4)。小麥與其他物種CSL蛋白的進(jìn)化分析結(jié)果表明，CSL蛋白被分為兩大類，即單子葉類和雙子葉類。TaCSL1-3D蛋白與粗山羊草CSL蛋白進(jìn)化關(guān)系最近，TaCSL1-3A、TaCSL1-3B與TaCSL1-3D蛋白進(jìn)化關(guān)系也較近，三個(gè)蛋白在進(jìn)化樹上處于同一大分支上(圖5)。

XP_002883301.1為擬南芥CLS蛋白的GenBank登錄號(hào)。黃色陰影表示TaCSL1蛋白與擬南芥CSL同源蛋白的序列多態(tài)性。

圖5 小麥TaCSL1蛋白與其他物種CSL蛋白的進(jìn)化分析

2.3 TaCSL1基因的表達(dá)特性分析

在小麥的籽粒、穎殼、雌蕊、雄蕊、穗下莖、旗葉、倒二葉、旗葉鞘、節(jié)間、根等組織中均檢測(cè)到TaCSL1-3A、TaCSL1-3B、TaCSL1-3D基因的表達(dá)，除開花后第9 d的旗葉鞘中TaCSL1-B的表達(dá)量較高外，三個(gè)基因在各個(gè)時(shí)期葉中的相對(duì)表達(dá)量均高于其他組織。比較不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的葉/旗葉組織可知，該基因在幼苗期至孕穗期，相對(duì)表達(dá)量總體提高，抽穗期明顯降低，開花后再次提高，生育末期降低(表2)。

三個(gè)部分同源基因的相對(duì)表達(dá)量在部分組織中存在顯著差異?？偟膩?lái)說(shuō)，TaCSL1-3A相對(duì)表達(dá)量一直處于較低狀態(tài)，TaCSL1-3D的相對(duì)表達(dá)量在孕穗期之前較高，TaCSL1-3B的相對(duì)表達(dá)量在孕穗期之后較高(表2)。

表2 小麥 TaCSL1在不同發(fā)育時(shí)期的組織器官中的相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

本研究根據(jù)擬南芥CSL基因At3g21360序列，利用同源克隆的方法，首次在小麥中克隆了TaCSL1基因，并獲得了三個(gè)部分同源基因TaCSL1-3A、TaCSL1-3B、TaCSL1-3D的全長(zhǎng)序列和編碼區(qū)序列。與參考序列比對(duì)，TaCSL1-3A、TaCSL1-3B和TaCSL1-3D序列與參考序列一致。編碼區(qū)序列比對(duì)結(jié)果表明，三個(gè)部分同源基因之間存在43個(gè)單核苷酸突變位點(diǎn)，其中有義突變11個(gè)，沉默突變32個(gè)。說(shuō)明該基因在小麥進(jìn)化過(guò)程中十分保守。通過(guò)與擬南芥的同源基因進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)TaCSL1-3A蛋白序列與擬南芥At3g21360蛋白序列相似度為69.6%，說(shuō)明該蛋白序列在植物中相對(duì)保守[18]。根據(jù)進(jìn)化樹分析可知，小麥TaCSL1基因編碼的蛋白與其祖先粗山羊草進(jìn)化關(guān)系較近，其次是其他單子葉草本植物，而與雙子葉植物進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。這說(shuō)明該基因可能在單、雙子葉分化之前就已經(jīng)產(chǎn)生[19]。TaCSL1蛋白理化性質(zhì)分析表明，該蛋白屬于中性、親水、不穩(wěn)定蛋白，說(shuō)明該蛋白作為一種酶，參與酶促反應(yīng)之后容易分解[20]。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明，TaCSL1-3A、TaCSL1-3B、TaCSL1-3D在小麥各個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期和組織部位都有表達(dá)，說(shuō)明三個(gè)基因在小麥生長(zhǎng)過(guò)程中都發(fā)揮作用，三者的功能也可能存在冗余[21]。TaCSL1基因在小麥葉片組織中相對(duì)表達(dá)水平較高，表明該基因主要在小麥葉片中發(fā)揮功能。開花后第9 d旗葉鞘中TaCSL1-3B的表達(dá)量相對(duì)較高，原因可能是異常環(huán)境誘導(dǎo)的結(jié)果。TaCSL1-3D在小麥孕穗期之前相對(duì)表達(dá)量較高，而TaCSL1-3B在小麥孕穗期之后相對(duì)表達(dá)量較高，表明三者的功能存在分化。

Bastard等[7]研究表明，CSL家族酶類具有嚴(yán)格的底物特異性，而江 倩[22]研究表明，一種CSL酶可以催化氧化多種底物，并且除了催化產(chǎn)生羥基化產(chǎn)物外，還能產(chǎn)生?；a(chǎn)物。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果表明，TaCSL1基因在小麥全生育期和所有檢測(cè)組織部位中均有表達(dá)，說(shuō)明該基因是一個(gè)組成型表達(dá)基因[21]，可預(yù)測(cè)該基因參與植物體內(nèi)重要的生化過(guò)程。富含羥脯氨酸糖蛋白是細(xì)胞壁的構(gòu)成部分，脯氨酸羥基化酶基因是一種組成型表達(dá)基因[23]，TaCSL1基因是否是脯氨酸羥基化酶基因還有待進(jìn)一步考證。

植物保衛(wèi)素是植物受到生物或非生物因子侵襲時(shí)在體內(nèi)合成并積累的低分子量抗菌性物質(zhì)，其種類繁多、結(jié)構(gòu)各異、代謝途徑復(fù)雜[23]。(S)-4-羥基苯甘氨酸、(2S,3R)-3-羥基-亮氨酸和(2S,3R)-3-羥基-苯丙氨酸是植物保衛(wèi)素的構(gòu)成部分[24-25]，因而，推測(cè)羥基化氨基酸可能是未被分離出來(lái)的植保素或其構(gòu)成部分。后期可將該基因在小麥體內(nèi)進(jìn)行過(guò)表達(dá)或沉默，通過(guò)人工接種病菌，進(jìn)一步研究該基因是否與植物抗病過(guò)程相關(guān)。