武瑞君，楊 喆，桑曉冬，李治非，魏 巍，敖 翼，范 玲

（中國生物技術(shù)發(fā)展中心，北京 100039）

1993年，在羊駝外周血中發(fā)現(xiàn)了一種天然缺失輕鏈的抗體，該抗體只包含1個(gè)重鏈可變區(qū)（vari?able domain of heavy chain of heavy-chain，VHH）和2個(gè)常規(guī)的重鏈恒定區(qū)CH2和CH3區(qū)［1］?？寺∑淇勺儏^(qū)可得到只由VHH構(gòu)成的單域抗體（single-domain antibody），稱為VHH抗體，即納米抗體。納米抗體是目前已知最小的天然功能性抗原特異性結(jié)合片段，依賴3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（comple?mentarity determining regions，CDR）即 CDR1，CDR2和CDR3與抗原決定簇發(fā)生相互作用［2］。納米抗體的發(fā)現(xiàn)突破了傳統(tǒng)抗體因分子質(zhì)量過大（約150 ku）導(dǎo)致的免疫原性強(qiáng)、組織穿透力差、結(jié)構(gòu)改造較難等瓶頸，在具有與傳統(tǒng)抗體相當(dāng)?shù)目乖H和力的同時(shí)具有多種優(yōu)點(diǎn)：①分子質(zhì)量小，只有約15 ku，在體內(nèi)具有較強(qiáng)的組織穿透性；②作為單域結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定性強(qiáng)，且易進(jìn)行雙特異性或多特異性抗體的重組改造；③CDR3較長，結(jié)合抗原的方式更加靈活，可以結(jié)合抗原的隱藏表位；④納米抗體和人源抗體可變區(qū)的氨基酸序列相似度很高，免疫原性較小，易于進(jìn)行人源化改造和臨床應(yīng)用。2021年1月11日，德國《法蘭克福匯報(bào)》網(wǎng)站刊載題為《邁向新境界——量子計(jì)算機(jī)、納米抗體、新邏輯：2021年將帶來哪些技術(shù)突破？》的報(bào)道［3］，隨著新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）疫情的暴發(fā)，納米抗體相關(guān)研究越來越引人關(guān)注。

CiteSpace文獻(xiàn)可視化分析工具可通過對某一主題或研究領(lǐng)域內(nèi)的大量文獻(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行共現(xiàn)和共被引分析等，篩選出該領(lǐng)域的關(guān)鍵研究成果，呈現(xiàn)研究領(lǐng)域的發(fā)展趨勢和研究熱點(diǎn)。此方法能夠提供傳統(tǒng)文獻(xiàn)綜述以及系統(tǒng)綜述所不具備的視角，目前已在國內(nèi)外眾多領(lǐng)域有所應(yīng)用［4］。本文旨在應(yīng)用文獻(xiàn)可視化分析方法，呈現(xiàn)納米抗體領(lǐng)域的發(fā)展趨勢和熱點(diǎn)主題，為納米抗體的深入研究提供參考。

1 數(shù)據(jù)來源和檢索策略

文獻(xiàn)資源來源于Web of Science檢索平臺（Thomson Reuters，美國）的Web of Science核心合集。在上述數(shù)據(jù)庫中以關(guān)鍵詞（“nanobody”O(jiān)R“single domain antibody”O(jiān)R“VHH antibody”）進(jìn)行主題檢索，檢索時(shí)間范圍為2005.01.01—2021.06.30。對納入的文獻(xiàn)類型限定為論著類文獻(xiàn)和綜述類文獻(xiàn)，并排除非英語文獻(xiàn)的相關(guān)研究。

根據(jù)發(fā)文量增加速度，整個(gè)時(shí)間跨度可大致分為2個(gè)階段。第一階段為自1993年第1次發(fā)現(xiàn)納米抗體起，相關(guān)研究屬于起步階段，全球范圍內(nèi)年均發(fā)文量較少；第二階段從2006年至今，2006年相關(guān)發(fā)文量較2005年出現(xiàn)井噴式增加，之后逐年遞增，2020年發(fā)文量第1次超600篇，預(yù)計(jì)2021年發(fā)文量可達(dá)600篇以上。檢索獲得2005.01.01—2021.06.30關(guān)于納米抗體研究的文獻(xiàn)記錄共6357條，其中論著類文獻(xiàn)5725條、綜述類文獻(xiàn)632條；被引頻次總計(jì)159 940次，平均每篇文獻(xiàn)被引用25.16次。分析近16年發(fā)表的文獻(xiàn)，年發(fā)文量整體呈逐年遞增趨勢（圖1）。

圖1 納米抗體相關(guān)研究年度發(fā)文量.文獻(xiàn)檢索自Web of Science檢索平臺的Web of Science核心合集，檢索主題詞為“nanobody”或“single domain antibody”或“VHH antibody”，檢索時(shí)間范圍為2005.01.01—2021.06.30，檢索文獻(xiàn)類型為論著類和綜述類的英文文獻(xiàn).

2 數(shù)據(jù)分析

以純文本的格式導(dǎo)出檢索結(jié)果的全記錄與引用的參考文獻(xiàn)，然后導(dǎo)入CiteSpace 5.7.R5軟件。參數(shù)設(shè)置如下，時(shí)間分區(qū)（time slicing）為2005.01.01—2021.06.30；時(shí)間切片（year per slice）設(shè)為2年；選擇標(biāo)準(zhǔn)（selection criteria）選擇TOP N，設(shè)置為30，即從每個(gè)時(shí)間切片中選擇最常被引用或最常出現(xiàn)的30個(gè)條目；圖譜剪切方式（pruning）采用尋徑網(wǎng)絡(luò)（pathfinder）、切片網(wǎng)絡(luò)修剪（pruning sliced network）和整體網(wǎng)絡(luò)修剪（prun?ing the merged network）。

根據(jù)不同的目的設(shè)置不同的節(jié)點(diǎn)類型（node types）。通過國家或地區(qū)（country）、機(jī)構(gòu)（institu?tion）和作者（author）共現(xiàn)分析，可以提示不同國家、機(jī)構(gòu)和作者的合作關(guān)系。通過文獻(xiàn)（reference）共被引分析，計(jì)算文獻(xiàn)被引頻次和中介中心性（cen?trality）等參數(shù)，找到研究領(lǐng)域發(fā)展過程中的關(guān)鍵文獻(xiàn)。其中，中介中心性是指網(wǎng)絡(luò)中經(jīng)過某點(diǎn)并連接這2點(diǎn)的最短路徑占2點(diǎn)間最短路徑線總數(shù)之比，中介中心性高的節(jié)點(diǎn)可視為關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，提示研究領(lǐng)域知識結(jié)構(gòu)發(fā)展。通過突顯性時(shí)間分布，找到不同時(shí)間段突顯性高的文獻(xiàn)，提示研究領(lǐng)域的發(fā)展趨勢，預(yù)測潛在研究熱點(diǎn)。通過關(guān)鍵詞（keyword）共現(xiàn)分析，分析出現(xiàn)頻次較高的關(guān)鍵詞，并對關(guān)鍵詞進(jìn)行聚類分析，反映領(lǐng)域研究熱點(diǎn)和主要研究方向。其中，聚類結(jié)果以聚類模塊值（modularity，Q值）和聚類平均輪廓值（silhouette，S值）進(jìn)行評估，值越大表示網(wǎng)絡(luò)的聚類結(jié)果越好。一般Q>0.3表示聚類結(jié)構(gòu)顯著，S>0.5表示聚類合理，S>0.7表示聚類令人信服［5］。

2.1 國家、機(jī)構(gòu)和作者可視化分析

用CiteSpace分析得到N（網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)數(shù)量）=57、E（連線數(shù)量）=57的國家或地區(qū)合作圖譜（圖2），得到N=192，E=179的機(jī)構(gòu)合作圖譜（圖3）。發(fā)文量排名前5的國家為美國、中國、德國、比利時(shí)和英國，中心性排名前5位的國家為英國、美國、中國、澳大利亞和新加坡（表1）。發(fā)文量排名前5位的機(jī)構(gòu)為比利時(shí)布魯塞爾大學(xué)、比利時(shí)弗蘭德生物技術(shù)研究院、荷蘭烏得勒支大學(xué)、比利時(shí)根特大學(xué)和中國科學(xué)院，中心性排名前5位的機(jī)構(gòu)為牛津大學(xué)、加利福尼亞大學(xué)戴維斯分校、紐約血液中心、比利時(shí)布魯塞爾大學(xué)和得克薩斯大學(xué)（表2）。

圖2 納米抗體相關(guān)研究國家或地區(qū)合作圖譜.數(shù)據(jù)來源見圖1.CiteSpace 5.7.R5軟件參數(shù)設(shè)置：時(shí)間分區(qū)為2005.01.01—2021.06.30，時(shí)間切片為2年，選擇標(biāo)準(zhǔn)為TOP N=30，圖譜剪切方式采用尋徑網(wǎng)絡(luò)、切片網(wǎng)絡(luò)修剪和整體網(wǎng)絡(luò)修剪，節(jié)點(diǎn)類型為國家或地區(qū).

圖3 納米抗體相關(guān)研究機(jī)構(gòu)合作圖譜.數(shù)據(jù)來源見圖1.CiteSpace 5.7.R5軟件參數(shù)設(shè)置見圖2，節(jié)點(diǎn)類型為機(jī)構(gòu).

表1 納米抗體相關(guān)研究發(fā)文量及中心性前5位的國家

表2 納米抗體相關(guān)研究發(fā)文量及中心性前5位的機(jī)構(gòu)

根據(jù)可視化分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，在全球范圍內(nèi)，納米抗體研究產(chǎn)出量呈逐年遞增趨勢，研究廣泛覆蓋美國、歐洲及亞洲在內(nèi)的各個(gè)地區(qū)，說明納米抗體相關(guān)研究越來越被重視，是近年來全球共同關(guān)注的重要熱點(diǎn)方向。在該領(lǐng)域占主要地位的是美國、中國、德國和比利時(shí)，這些國家發(fā)文量較多，且合作較為密切。綜合發(fā)文量和中心性分析得知，比利時(shí)布魯塞爾大學(xué)稱得上是該領(lǐng)域的權(quán)威機(jī)構(gòu)。我國關(guān)于抗體藥物的研究和開發(fā)雖然起步較晚，但在國家的引導(dǎo)和支持下，我國新藥研發(fā)與國外一些發(fā)達(dá)國家醫(yī)藥水平的差距越來越小。在納米抗體研究領(lǐng)域，我國發(fā)文量已排第2位，中國科學(xué)院是發(fā)文量排名前5位的機(jī)構(gòu)之一。但在與其他國家專家的合作、研究的系統(tǒng)性和引領(lǐng)性等方面，我國仍存在較大不足，需進(jìn)一步提高。

生成的作者合作圖譜（圖4，N=405，E=654）顯示納米抗體研究相關(guān)領(lǐng)域發(fā)文量較多且較有影響力的團(tuán)隊(duì)及具有潛在合作關(guān)系的作者信息，協(xié)助研究人員和不同研究小組建立合作關(guān)系。表3顯示納米抗體領(lǐng)域研究發(fā)文量排名前5位的作者，其中比利時(shí)布魯塞爾大學(xué)學(xué)者Serge MUYLDER?MANS 以發(fā)文量 132 篇［2，6］排名第1位，中心性也排名第1位，且擁有豐富的合作網(wǎng)絡(luò)，說明該專家為納米抗體領(lǐng)域的權(quán)威專家。該專家所在團(tuán)隊(duì)于1993年首次報(bào)道了納米抗體的相關(guān)特性，并長期致力于研究納米抗體的結(jié)構(gòu)、特征、應(yīng)用和開發(fā)工具等。此外，發(fā)文量排名前5位的作者中，有4位比利時(shí)學(xué)者［7-9］，1位美國學(xué)者［10］。圖4顯示作者合作圖譜，發(fā)文量排名前5位的作者均具有較好的合作網(wǎng)絡(luò)。另外全球范圍內(nèi)，也存在分別以Zhui TU和Sabrina OLIVEIRA等學(xué)者為核心的小范圍合作研究。

圖4 納米抗體相關(guān)研究作者合作圖譜.數(shù)據(jù)來源見圖1.CiteSpace 5.7.R5軟件參數(shù)設(shè)置見圖2，節(jié)點(diǎn)類型為作者.

表3 納米抗體相關(guān)研究發(fā)文量以及中心性前5位的作者

2.2 關(guān)鍵文獻(xiàn)可視化分析

圖5為文獻(xiàn)共被引網(wǎng)絡(luò)圖譜（N=213，E=238），分別以被引頻次和中心性為參數(shù)，統(tǒng)計(jì)排名前5位的研究，共確定11篇關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)文獻(xiàn)（表4和表5），是納米抗體領(lǐng)域研究人員的重要參考。文獻(xiàn)突顯性分析結(jié)果顯示，共有25篇文獻(xiàn)突顯強(qiáng)度達(dá)到19以上，表6所示為突顯強(qiáng)度前10位的文獻(xiàn)，可能提示未來的研究熱點(diǎn)。其中，Muyldermans 等［15］于2013年在Annu Rev Biochem期刊發(fā)表的題為“Nanobodies：natural single-domain antibodies”的文章，被引頻次最高（達(dá)306次），突顯強(qiáng)度最高（高達(dá)105.23），是推動(dòng)納米抗體研究發(fā)展的重要文獻(xiàn)之一。該文獻(xiàn)對納米抗體進(jìn)行了系統(tǒng)綜述，認(rèn)為納米抗體從研發(fā)工具到治療藥物均具有廣泛的應(yīng)用前景。

表4 納米抗體相關(guān)研究被引頻次排名前5位的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)文獻(xiàn)

表5 納米抗體相關(guān)研究中心性排名前5位的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)文獻(xiàn)

表6 納米抗體相關(guān)研究突顯強(qiáng)度最高的前10位參考文獻(xiàn)

圖5 納米抗體相關(guān)研究文獻(xiàn)共被引網(wǎng)絡(luò)圖譜.數(shù)據(jù)來源見圖1.CiteSpace 5.7.R5軟件參數(shù)設(shè)置見圖2，節(jié)點(diǎn)類型為文獻(xiàn).

2.3 關(guān)鍵詞可視化分析

關(guān)鍵詞是對文章內(nèi)容的高度概括，是對文章主題的反映。出現(xiàn)頻次較高的關(guān)鍵詞通常能夠反映該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和主要研究方向。用CiteSpace構(gòu)建關(guān)鍵詞共現(xiàn)圖譜（圖6，N=63，E=65），按照出現(xiàn)頻次排序，得到單克隆抗體、納米抗體、抗體、表達(dá)、蛋白質(zhì)、片段、晶體結(jié)構(gòu)、噬菌體展示、診斷、腫瘤、治療和感染等關(guān)鍵詞。按照中心性排序，得到片段、重鏈抗體、腫瘤、親和力、血管生成、可變域、大腸桿菌、噬菌體展示、感染、免疫治療和中和抗體等關(guān)鍵詞。

圖6 納米抗體相關(guān)研究關(guān)鍵詞共現(xiàn)圖譜.數(shù)據(jù)來源見圖1.CiteSpace 5.7.R5軟件參數(shù)設(shè)置見圖2，節(jié)點(diǎn)類型為關(guān)鍵詞.

用CiteSpace對關(guān)鍵詞進(jìn)行聚類，采用對數(shù)似然率算法，通過提取文獻(xiàn)的關(guān)鍵詞進(jìn)行聚類命名，最終形成了8個(gè)聚類（圖7）。本次聚類S=0.9341，Q=0.7799，聚類結(jié)果較好。按每個(gè)聚類S值由高到低進(jìn)行排序，分別為#3納米抗體、#6單克隆抗體、#2免疫治療、#7晶體結(jié)構(gòu)、#4抗體、#5噬菌體展示、#1域和#0診斷，其中#3納米抗體、#6單克隆抗體和#2免疫治療3個(gè)聚類的S值均為1。

圖7 納米抗體相關(guān)研究關(guān)鍵詞聚類圖譜.數(shù)據(jù)來源見圖1.CiteSpace 5.7.R5軟件參數(shù)設(shè)置見圖2，節(jié)點(diǎn)類型為關(guān)鍵詞，并對關(guān)鍵詞進(jìn)行聚類分析.

3 納米抗體熱點(diǎn)研究領(lǐng)域分析

通過對上述可視化分析結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行認(rèn)真分析和深入挖掘，發(fā)現(xiàn)納米抗體在感染性疾病、腫瘤類疾病和免疫類疾病的預(yù)防、診斷和治療中的應(yīng)用，是當(dāng)前主要的研究熱點(diǎn)。

3.1 疾病預(yù)防

目前納米抗體在疾病預(yù)防領(lǐng)域的研究主要是針對傳染類疾病。納米抗體可通過與致病微生物的關(guān)鍵蛋白結(jié)合，控制傳染源或切斷傳播途徑，以達(dá)到預(yù)防疾病的目的。彎曲桿菌感染是人類最常見的食源性感染之一，Vanmarsenille等［31］以彎曲桿菌屬為研究靶點(diǎn)，開展納米抗體研發(fā)工作。研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了6個(gè)具有廣泛特異性的納米抗體，通過識別空腸彎曲桿菌和大腸彎曲桿菌外膜蛋白，導(dǎo)致彎曲桿菌屬細(xì)胞凝集，抑制彎曲桿菌屬在雞腸道內(nèi)的定植，阻斷細(xì)菌傳播，達(dá)到預(yù)防彎曲桿菌屬感染的目的。Amcheslavsky等［32］以具有較大異質(zhì)性的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌為靶標(biāo)，篩選了對11種主要致病性產(chǎn)腸毒素大腸桿菌具有體外交叉保護(hù)效力的納米抗體，經(jīng)胃給藥，在小鼠模型中顯示出顯著減少細(xì)菌定植的作用。

許多病原體和外部有害物質(zhì)通過胃腸道黏膜進(jìn)入人體，研發(fā)靶向黏膜表面受體的疫苗被認(rèn)為是一種能有效誘導(dǎo)黏膜免疫反應(yīng)的方法。但是口服亞單位疫苗在腸道上皮細(xì)胞存在吸收差、轉(zhuǎn)運(yùn)效率低和免疫反應(yīng)弱等問題。研究表明，克服上述障礙的一種策略是利用疫苗抗原遞送載體，將氨肽酶N（aminopeptidase N，APN）特異性靶向藥物與疫苗抗原結(jié)合，激發(fā)腸道黏膜免疫反應(yīng)，其中APN是位于小腸細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞上的受體。Bakshi等［33］使用豬APN免疫美洲駝并篩選出表達(dá)pAPN的細(xì)胞系，通過該細(xì)胞篩選系統(tǒng)，篩選到28個(gè)抗豬APN的納米抗體，通過與常規(guī)抗體的Fc結(jié)構(gòu)域融合，形成二價(jià)融合蛋白（VHH-MG）。利用仔豬腸道結(jié)扎環(huán)實(shí)驗(yàn)和口服免疫實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在生理?xiàng)l件下，3L94-MG和2L65-MG顯示出在小腸上皮細(xì)胞內(nèi)的有效吞噬作用，經(jīng)口服給藥可引發(fā)全身和黏膜抗體反應(yīng)。下一步，可將臨床相關(guān)抗原與上述豬APN特異性納米抗體結(jié)合，以評估其作為疫苗抗原呈遞載體、口服觸發(fā)腸道上皮保護(hù)性免疫反應(yīng)的可能性。

此外，納米抗體也有望成為預(yù)防SARS-CoV-2感染的重要手段。Pymm等［34］利用SARS-CoV-2刺突蛋白受體結(jié)合域免疫羊駝，篩選出對SARSCoV-2具有高親和力、結(jié)合位點(diǎn)不同的納米抗體。將納米抗體與Fc融合構(gòu)成納米抗體-Fc融合體，其中4種納米抗體-Fc融合體在體外細(xì)胞模型中可以在0.1 nmol·L-1濃度下有效中和野生型SARS-CoV-2原始株和N501Y、D614G突變株。在感染N501Y和D614G SARS-CoV-2突變株的小鼠模型中，使用納米抗體-Fc單一融合體或混合療法進(jìn)行預(yù)防性給藥，與不給藥組相比，給藥組小鼠體內(nèi)SARSCoV-2載量降低至萬分之一。

3.2 疾病診斷

由于與抗原結(jié)合的強(qiáng)特異性、高親和力和優(yōu)良的組織穿透性，納米抗體在疾病診斷領(lǐng)域也有較多應(yīng)用。納米抗體技術(shù)最初多被采用酶聯(lián)免疫吸附法、雙抗夾心法等進(jìn)行體外檢測。使用較為廣泛的是雙抗夾心法，此方法包含2種能與抗原不同表位結(jié)合的納米抗體，組成“納米抗體1-抗原-納米抗體2”的“三明治”結(jié)構(gòu)。納米抗體1一般固定于載體上用于捕獲待測抗原，納米抗體2用于抗原濃度的間接檢測［35］。Zhu等［36］研發(fā)的靶向甲型H5N1流感病毒的納米抗體線性檢測范圍50～1000 μg·L-1，檢測限為14.1 μg·L-1，優(yōu)于目前Binax公司商用流感病毒診斷試劑。Wang等［37］首次從免疫后的雙峰駝中篩選出與載脂蛋白A1不同表位結(jié)合的納米抗體Nb11和Nb19。將Nb11作為捕獲抗體并固定在金納米粒子修飾的絲網(wǎng)印刷碳電極上，負(fù)載納米羥基磷灰石的銀納米顆粒用作信號標(biāo)簽標(biāo)記二抗Nb19。該方法對載脂蛋白A1的檢測范圍為0.0001～50 μg·L-1，檢測限為0.02 ng·L-1。

隨著現(xiàn)代技術(shù)的不斷發(fā)現(xiàn)和更新，以納米抗體為基礎(chǔ)的靶向示蹤成為分子成像等在體無創(chuàng)傷診斷領(lǐng)域的重要研究方向，納米抗體可用作靶向示蹤分子進(jìn)行病灶組織特異的放射免疫顯像或靶向超聲造影。表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）作為一種跨膜蛋白，在乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌和卵巢癌等多種腫瘤組織中過表達(dá)，開發(fā)靶向EGFR的納米抗體作為顯像劑載體，用于乳腺癌等腫瘤的診斷是重要研究方向之一。Huang等［38］研發(fā)了靶向EGFR的納米抗體8B6，熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)分析顯示，8B6納米抗體僅識別過表達(dá)EGFR的細(xì)胞。通過C端組氨酸尾將8B6用同位素Tc-99m標(biāo)記，組成Tc-99m-8B6納米抗體示蹤劑，在小鼠體內(nèi)使用單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描對EGFR過表達(dá)腫瘤進(jìn)行體內(nèi)放射免疫檢測。結(jié)果顯示，Tc-99m-8B6能明顯區(qū)分體內(nèi)EGFR高、中度表達(dá)的腫瘤，且在體內(nèi)血液清除速度相對較快，半衰期為1.5 h，主要通過腎清除。

3.3 疾病治療

納米抗體在疾病治療領(lǐng)域的應(yīng)用主要集中在免疫疾病治療、感染性疾病治療和腫瘤治療等方面。

在免疫疾病治療方面，比利時(shí)生物制藥公司Ablynx開發(fā)的卡普賽珠單抗（caplacizumab）納米抗體藥物，通過靶向血管血友病因子（von Wille?brand factor，vWF），用于治療自身免疫性疾病：獲得性血栓性血小板減少性紫癜（acquired thrombotic thrombocytopenic purpura，aTTP）。該藥已分別于2018年9月和2019年2月獲得歐盟和美國批準(zhǔn)，是目前唯一獲批上市的納米抗體藥物。在卡普賽珠單抗上市前，aTTP無特異性療法，只能采用血漿置換或者免疫抑制來緩解，且存在治療后易發(fā)生治療耐受，停止血漿置換后病情迅速進(jìn)展等問題，死亡率高達(dá)10%～20%?？ㄆ召愔閱慰篂槭讉€(gè)針對aTTP的特異性療法，是1種二價(jià)的vWF抗體。在結(jié)構(gòu)上，該單抗包含259個(gè)氨基酸，通過3個(gè)丙氨酸（AAA）的連接子，連接2個(gè)抗vWF的納米抗體。該單抗在體內(nèi)通過直接結(jié)合vWF的A域蛋白，一是增加自身分子質(zhì)量，克服納米抗體本身半衰期短的缺陷，延長半衰期達(dá)10～30 h；二是防止vMF與血小板結(jié)合，阻止血小板性微血栓的形成，且在血中快速均勻分布，藥效穩(wěn)定［39］。研究人員也在積極研究針對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和銀屑病等自身免疫性疾病的納米抗體。Pan等［40］開發(fā)了1種靶向胰高血糖素樣肽1受體的雙特異性納米抗體埃維瑞單抗（everestmab）。在糖尿病模型大鼠中，單次注射該單抗可顯著降低大鼠血糖，并且在抑制大鼠體重減輕和糖化血紅蛋白降低及減輕葡萄糖耐受性、肝功能和胰腺胰島功能損害等方面具有一定療效。

在感染性疾病治療方面，相關(guān)研究主要集中在病毒感染、細(xì)菌感染和寄生蟲感染等領(lǐng)域。呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是引起嚴(yán)重下呼吸道感染的最常見原因，目前暫無有效的治療方法。ALX-0171是Ablynx公司研發(fā)的具有抗RSV作用的新型三價(jià)納米抗體，目前正處于臨床試驗(yàn)階段。2020年9月公布的Ⅱb期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，使用ALX-0171吸入治療RSV下呼吸道感染的住院兒童，顯示出良好的安全性和抗病毒活性。在該研究中共有175名兒童參與，中位年齡4.8個(gè)月，在癥狀出現(xiàn)后平均3.3 d開始接受藥物治療。研究發(fā)現(xiàn)，ALX-0171 3 mg·kg-1組（14.2 h）、6 mg·kg-1組（5.1 h）和9 mg·kg-1組（5.1 h）的病毒載量下降到量化限值以下的中位時(shí)間明顯少于安慰劑組（46.1 h）［41］。上海洛啟生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司利用自主創(chuàng)建的納米抗體核心技術(shù)平臺，開展SARSCoV-2納米抗體研發(fā)。從380多個(gè)分子中篩選出7個(gè)候選分子并進(jìn)行真病毒中和活性驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中候選分子LQ050真病毒中和活性最高，EC50約為3.7 nmol·L-1。同時(shí)，LQ050可有效阻斷多種冠狀病毒如SARS病毒和不同SARS-CoV-2突變體與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2的結(jié)合，具有一定的臨床開發(fā)價(jià)值［42］。

在腫瘤治療方面，納米抗體可用于直接針對靶標(biāo)的治療、用作新型藥物遞送載體、用于放射性核素與光動(dòng)力聯(lián)合的放射免疫療法或者修飾免疫效應(yīng)細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用等［43］。以靶向程序性細(xì)胞死亡蛋白1（programmed cell death protein-1，PD-1）及其配體（PD-1 ligand，PD-L1）的單抗為代表的免疫檢查點(diǎn)抑制劑，在腫瘤治療領(lǐng)域取得一定進(jìn)展。其中，先聲藥業(yè)聯(lián)合蘇州康寧杰瑞公司研發(fā)的PD-L1納米抗體恩弗利單抗（envafolimab，KN035）是全球首個(gè)進(jìn)入臨床開發(fā)的PD-L1納米抗體，目前在中國、美國和日本已針對多個(gè)腫瘤適應(yīng)證開展臨床試驗(yàn)，顯示出良好的抗腫瘤活性和安全性，并已獲美國食品藥品監(jiān)督管理局授予治療晚期膽道癌的孤兒藥資格。非臨床研究結(jié)果顯示，恩弗利單抗可有效誘導(dǎo)T細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌，在相似劑量下，其抗腫瘤活性強(qiáng)于已上市PD-L1單抗德瓦魯單抗（durvalumab）。Ⅰ和Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，恩弗利單抗對肺癌、肝癌、膽管癌、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性/錯(cuò)配修復(fù)功能缺陷晚期實(shí)體瘤在內(nèi)的多種晚期實(shí)體瘤患者，具有良好的抗腫瘤活性［44］。Liu等［45］將納米抗體定點(diǎn)修飾于鐵蛋白表面，獲得具有腫瘤靶向作用的納米抗體-鐵蛋白偶聯(lián)物。利用鐵蛋白空腔的負(fù)載功能，可以載入疏水性的光敏試劑，構(gòu)建特異性靶向腫瘤細(xì)胞的納米抗體-鐵蛋白光動(dòng)力治療平臺，為構(gòu)建納米抗體靶向藥物遞送系統(tǒng)提供了一種策略。

近年來，納米抗體藥物的研發(fā)備受關(guān)注，Ablynx公司將納米抗體藥物的開發(fā)推到了全新高度。自2007年，該公司研發(fā)的卡普賽珠單抗成為首個(gè)進(jìn)入臨床研究的納米抗體，迄今該公司已有超40項(xiàng)納米抗體藥物的在研項(xiàng)目［46］。為了解目前處于臨床研發(fā)階段的納米抗體，通過對ClinicalTrial.gov等數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)的檢索，匯總了部分處于不同臨床研究階段（不包括已公布終止臨床試驗(yàn)的）的納米抗體類藥物研究情況（表7）。

4 展望

自發(fā)現(xiàn)納米抗體以來，納米抗體以其結(jié)構(gòu)簡單、相對分子質(zhì)量小、具有與特異抗原親和力高、穩(wěn)定性強(qiáng)、易于重組改造、給藥途徑多元、使用方便、成本低等優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合噬菌體展示技術(shù)，已成為感染性疾病、腫瘤類疾病和免疫類疾病預(yù)防、診斷和治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。同時(shí)，通過對納米抗體進(jìn)行基因工程改造，將其制備成雙特異性、多特異性、融合型納米抗體，從而克服納米抗體本身半衰期短等不足，也是研究者們不斷努力的方向。我國關(guān)于抗體藥物的研究和開發(fā)起步較晚，目前我國抗體藥物創(chuàng)新及產(chǎn)業(yè)與國際先進(jìn)水平相比尚存在一定差距。同時(shí)，全球SARS-CoV-2疫情形勢依然嚴(yán)峻，重大新發(fā)突發(fā)傳染性疾病嚴(yán)重威脅人類健康，這對全球傳染性疾病防治也提出了更高要求。納米抗體以其獨(dú)特的優(yōu)勢，為傳染病防治提供了新的思路和突破口。因此，加強(qiáng)納米抗體相關(guān)基礎(chǔ)研究，推進(jìn)相關(guān)成果轉(zhuǎn)化為臨床產(chǎn)品，應(yīng)用于重大慢性疾病或傳染性疾病的診治，對于促進(jìn)抗體產(chǎn)業(yè)發(fā)展、完備國家醫(yī)藥儲備及維護(hù)人民生命健康具有重要意義。