夏 禎， 趙興聰， 王學(xué)東

（華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237）

豹蛙酶(Ranpirnase），商品名Onconase（ONC)，是全球正在研究的多種藥物之一[1-2]，最早分離自北極豹蛙(Northern Leopard Frog，Rana pipiens)的卵母細(xì)胞和早期胚胎[3]，屬于核糖核酸酶A(RNase A)超家族成員，是已知的胰核糖核酸酶超家族成員中最小的單結(jié)構(gòu)域蛋白。它是由104 個(gè)氨基酸殘基組成的一個(gè)相對分子質(zhì)量為11835、等電點(diǎn)為9.7 的蛋白質(zhì)。豹蛙酶能特異性地降解tRNA 抑制蛋白質(zhì)的合成[4]，細(xì)胞毒性較強(qiáng), 可通過多種機(jī)制導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡[5]，在體內(nèi)外對多種腫瘤細(xì)胞均具有顯著的殺傷作用[6-7]。臨床上豹蛙酶作為抗腫瘤藥物用于治療惡性間皮瘤，也用于非小細(xì)胞肺癌和其他固體腫瘤的治療并處于臨床研究階段，有著很大的應(yīng)用前景[8]。為了提高重組蛋白的表達(dá)水平，有必要對培養(yǎng)基和表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化[9]。目前，對于發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化已有許多研究，其中代志凱等[10]對近年來常用的試驗(yàn)設(shè)計(jì)和優(yōu)化方法進(jìn)行了綜述。于子玲等[11]用Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和Box-Behnken響應(yīng)面分析方法優(yōu)化了輔酶Q10 產(chǎn)生菌的發(fā)酵培養(yǎng)基。朱新術(shù)等[12]對重組畢赤酵母表達(dá)木聚糖酶的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，木聚糖酶的酶活力和比酶活分別達(dá)到了原來的3.055 倍和3.889 倍。本文通過對含有豹蛙酶基因的重組大腸桿菌E. coliBL21 (DE3)-pET- 22b (+)-ONC 進(jìn)行培養(yǎng)、優(yōu)化誘導(dǎo)條件，并且利用Plackett-Burman (PB)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)考察多個(gè)因素對豹蛙酶表達(dá)的影響，從而確定出最優(yōu)的培養(yǎng)方案，以提高豹蛙酶的表達(dá)量[13]。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 重組菌E. coliBL21 (DE3)-pET- 22b (+)-ONC（豹蛙酶的NCBI 編號為P22069，基因序列為全基因合成。菌株為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存菌株）。

1.1.2 試劑 酵母粉（Yeast Extract）：安琪酵母股份有限公司；蛋白胨（Tryptone）：瑞軒生物制品公司；葡萄糖和培養(yǎng)基用無機(jī)鹽：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)：上海國藥生物技術(shù)有限公司。文中所用試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，葡萄糖1，NaCl 5，Na2HPO41，KH2PO42.65，MgSO42，pH 7.2；培養(yǎng)基115 ℃滅菌30 min。補(bǔ)料培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖640；蛋白胨78，酵母粉10.78；115 ℃ 滅菌30 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組菌的培養(yǎng)和蛋白表達(dá) 將重組菌E. coliBL21 (DE3)-pET-22b (+)-ONC 接入4 mL 的LB 培養(yǎng)基（含100 μg/mL 的氨芐青霉素）中，37 ℃搖床培養(yǎng)8 h 活化種子。將活化后的種子液按2.5%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基（含100 μg/mL 的氨芐青霉素）中，37 ℃、200 r/min 搖床培養(yǎng)一定時(shí)間后加入一定濃度的IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)8 ～10 h。

1.2.2 誘導(dǎo)條件優(yōu)化 應(yīng)用單因素實(shí)驗(yàn)考察誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)前培養(yǎng)時(shí)間對重組大腸桿菌表達(dá)豹蛙酶的影響[14]。

1.2.3 Plackett-Burman 法 優(yōu) 化 重 組 菌 表 達(dá) 豹 蛙 酶 發(fā)酵培養(yǎng)基 Plackett-Burman 法是一種兩水平部分析因設(shè)計(jì)，可以利用少量的實(shí)驗(yàn)篩選多個(gè)變量。并通過統(tǒng)計(jì)分析篩選出眾多因素中對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著影響的因素，也可以不斷縮小因素的最優(yōu)值范圍，達(dá)到同時(shí)粗略優(yōu)化考察因素的作用[15]。

1.2.4 重組菌蛋白表達(dá)水平的確定 取發(fā)酵液50 mL于4 ℃、10 000 r/min 條件下離心20 min 收集菌體。棄去上清，沉淀中加入適量緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl ，1 mmol/L EDTA，pH 8.0）重懸菌體，4 ℃下超聲破壁，然后于4 ℃、10 000 r/min 條件下離心40 min收集沉淀和上清，分別進(jìn)行SDS-PAGE 分析，通過凝膠掃描成像儀分析電泳結(jié)果，得到目的蛋白占總蛋白的比例，即蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 誘導(dǎo)溫度對蛋白表達(dá)的影響 合適的誘導(dǎo)溫度既能保證微生物的正常生長，又能使外源基因得到正確的（可溶性）表達(dá)。將重組大腸桿菌置于37 ℃搖床下培養(yǎng)4 h，加入終濃度0.2 mmol/L 的IPTG，隨后分別置于25～37 ℃不同溫度的搖床中培養(yǎng)10 h，取樣測定各溫度下的菌濃，并按照蛋白表達(dá)量測定的方法考察重組大腸桿菌表達(dá)豹蛙酶的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)降低誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度并不能提高可溶性表達(dá)量，蛋白主要以包涵體形式存在，而且降低溫度不利于重組菌的生長以及豹蛙酶表達(dá)。如圖1 所示，在誘導(dǎo)溫度37 ℃時(shí)，重組菌表達(dá)豹蛙酶的表達(dá)水平更高，達(dá)到8.3%，菌體密度也較高，OD600達(dá)到了4.80，所以設(shè)定大腸桿菌一般性的最適培養(yǎng)溫度37 ℃用于重組菌的后續(xù)實(shí)驗(yàn)中。

圖1 誘導(dǎo)溫度對重組菌生長以及表達(dá)豹蛙酶的影響Fig. 1 Effect of induction temperature on the growth and expression of ranpirnase of recombinant E. coli

2.1.2 誘導(dǎo)劑濃度對蛋白表達(dá)的影響 增加誘導(dǎo)劑IPTG 濃度可以提高誘導(dǎo)強(qiáng)度，提升蛋白表達(dá)水平，但同時(shí)對微生物細(xì)胞具有一定的毒性[16]，因此，誘導(dǎo)劑合適的添加濃度對重組蛋白表達(dá)非常重要。將重組大腸桿菌在37 ℃搖床培養(yǎng)4 h，然后分別向搖瓶中添加終濃度范圍為0.1～1.2 mmol/L 的IPTG，并且于37 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng)10 h，分別取樣測定其菌濃和豹蛙酶的表達(dá)水平，結(jié)果如圖2 所示。隨著誘導(dǎo)劑濃度的升高，豹蛙酶的表達(dá)水平總體上表現(xiàn)為先增后減的趨勢，而菌體生長總體上則呈現(xiàn)逐步增加的抑制效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)IPTG 終濃度在0.9 mmol/L 時(shí)表達(dá)水平最高，可達(dá)到11.6%。但是在此條件下的細(xì)胞生長水平則比較差；而在IPTG 終濃度0.2 mmol/L的條件下細(xì)胞有一個(gè)適中的表達(dá)水平，同時(shí)該終濃度對細(xì)胞生長無明顯抑制；從重組菌的生長情況、表達(dá)情況與成本方面綜合考慮，最終選擇0.2 mmol/L為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中IPTG 的終濃度。

圖2 誘導(dǎo)濃度對重組菌生長以及表達(dá)豹蛙酶的影響Fig. 2 Effect of induction concentration on the growth and expression of ranpirnase of recombinant E. coli

2.1.3 誘導(dǎo)前培養(yǎng)時(shí)間對蛋白表達(dá)的影響 因?yàn)镮PTG 對菌體生長和蛋白表達(dá)有雙重影響，所以誘導(dǎo)劑加入的時(shí)機(jī)是影響總的菌體蛋白表達(dá)的重要影響因素。將重組大腸桿菌置于37 ℃搖床下培養(yǎng)不同時(shí)間后分別加入終濃度為0.2 mmol/L 的IPTG 誘導(dǎo)劑，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)10 h，分別取樣測定各實(shí)驗(yàn)組的菌濃和豹蛙酶的表達(dá)水平，結(jié)果如圖3 所示。隨著誘導(dǎo)前培養(yǎng)時(shí)間的增加，重組菌表達(dá)豹蛙酶的表達(dá)水平總體上呈現(xiàn)先增后減的趨勢，而菌濃則總體上稍有上升。誘導(dǎo)前培養(yǎng)3 h，表達(dá)水平最高可達(dá)9.4%。這是因?yàn)樵?～3 h，重組菌進(jìn)入生長對數(shù)期，此時(shí)菌體活力較強(qiáng)，誘導(dǎo)對重組菌表達(dá)較好。所以選擇3 h 作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的誘導(dǎo)前培養(yǎng)時(shí)間。

圖3 誘導(dǎo)前培養(yǎng)時(shí)間對重組菌生長以及表達(dá)豹蛙酶的影響Fig. 3 Effect of culture time before induction on the growth and expression of ranpirnase of recombinant E. coli

2.2 Plackett-Burman 法優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基結(jié)果

在上述最適培養(yǎng)和誘導(dǎo)條件下，進(jìn)一步優(yōu)化重組大腸桿菌表達(dá)豹蛙酶的最優(yōu)培養(yǎng)基組成。實(shí)驗(yàn)采用Plackett-Burman 設(shè)計(jì)方法，篩選對重組大腸桿菌表達(dá)豹蛙酶(菌體總密度及豹蛙酶的表達(dá)量)影響最為顯著的發(fā)酵培養(yǎng)基成分因素[17]。采用葡萄糖、甘油、蛋 白 胨、酵 母 粉、Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、MgSO4、ZnSO4、CaCl2、(NH4)2SO4、MnSO4、FeCl3、CoCl2、CuSO4、Na2B4O7作為Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)的研究因素，考察了上述因素對菌體量和豹蛙酶表達(dá)水平的影響情況。經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)最終從上述因素中選取了12 個(gè)因素和2 個(gè)虛擬變量進(jìn)一步考察它們對重組菌表達(dá)豹蛙酶的影響(表1)，并得到結(jié)果(表2)進(jìn)行后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。

表1 Plackeet-Burman 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Levels of selected factors for Plackeet-Burman

表2 Plackeet-Burman 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of Plackeet-Burman

續(xù)表2

數(shù)據(jù)結(jié)果采用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Design-Expert 進(jìn)行回歸方程分析，得到各影響因素的效應(yīng)值(F值)以及顯著性(Prob>F值)（表3）。效應(yīng)值可用來反映各個(gè)考察因素對于整體的影響。效應(yīng)值越大則表示該因素對于整體的影響越大，而效應(yīng)值越接近零則表明該因素對于整體的影響越小。各因素的顯著性由Prob>F來決定。當(dāng)Prob>F的值小于0.05 時(shí)表示該因素的效果顯著(置信區(qū)間選擇95%)，當(dāng)Prob>F的值大于0.1 時(shí)則表示這個(gè)因素的效果不顯著。因此，當(dāng)通過Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)篩選影響因素時(shí)，既要考慮因素的效應(yīng)值也要考慮因素顯著性。

表3 Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)回歸分析結(jié)果Table 3 Regression analysis results of Plackett-Burman design

根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析可知，在實(shí)驗(yàn)選取的濃度范圍內(nèi)，Zn2+、Mn2+、Mg2+、NaCl、Ca2+、KH2PO4、蛋白胨對重組大腸桿菌表達(dá)豹蛙酶的總蛋白量有顯著影響。通過Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)確定了影響重組菌表達(dá)豹蛙酶的顯著因素以及影響因素最適的大致范圍，但由于因素之間關(guān)聯(lián)性不強(qiáng)，所以沒有再進(jìn)一步進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，而是綜合幾次Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定最優(yōu)培養(yǎng)基組成（g/L）為：蛋白胨10，酵母粉4，葡萄糖1，(NH4)2SO45，NaCl 15，Na2HPO41.6，KH2PO44 ，MgSO44 ，CaCl20.5 ，MnSO40.2，F(xiàn)e2(SO4)30.3，ZnSO40.3。

用上述優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果見圖4。采用凝膠掃描成像儀分析電泳結(jié)果，可知豹蛙酶表達(dá)水平由優(yōu)化前的9%提高到優(yōu)化后的36%，采用分光光度計(jì)測得OD600值由優(yōu)化前的4.80 提升到優(yōu)化后的5.47，可見蛋白表達(dá)水平和菌體生長情況都得到了改進(jìn)。

圖4 搖瓶水平上優(yōu)化前后重組菌表達(dá)豹蛙酶情況Fig. 4 Expression of ranpirnase in recombinant E. coli before and after optimization at shake flask level

2.3 發(fā)酵罐試驗(yàn)結(jié)果

為得到大量的重組豹蛙酶，并驗(yàn)證搖瓶水平所得重組菌表達(dá)條件的優(yōu)化結(jié)果，在7 L 發(fā)酵罐中進(jìn)行了發(fā)酵表達(dá)試驗(yàn)。使用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基和誘導(dǎo)條件，接種量為2%。接種后，根據(jù)實(shí)際的溶氧變化控制攪拌轉(zhuǎn)速、空氣通量使溶氧保持在20%以上，發(fā)酵過程中自動調(diào)節(jié)pH，使其保持在7.0[18]。前期菌體生長階段采用指數(shù)補(bǔ)料方式，補(bǔ)料速率根據(jù)菌體的生長狀況實(shí)時(shí)調(diào)整，待菌體濃度達(dá)到OD600=20 時(shí)，加入終濃度0.2 mmol/L 的IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)階段采用pH-stat 的控制方式[19-20]，再在37 ℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)9～10 h，收集發(fā)酵液，SDS-PAGE 電泳測定豹蛙酶的表達(dá)量，結(jié)果見圖5。觀察全細(xì)胞、細(xì)胞破碎后上清液、細(xì)胞破碎后沉淀電泳結(jié)果可知，豹蛙酶主要以包涵體形式存在，其中包涵體占95%以上。優(yōu)化后發(fā)酵罐中重組菌對豹蛙酶的表達(dá)水平可達(dá)到55%，搖瓶水平上的優(yōu)化得到了很好的驗(yàn)證。除表達(dá)水平外，重組菌在優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長更好，采用分批補(bǔ)料發(fā)酵能夠獲得更高的的菌濃，OD600提高到35，且菌體易于離心、不易自溶，更加穩(wěn)定。

圖5 發(fā)酵罐水平優(yōu)化后重組菌表達(dá)豹蛙酶情況Fig. 5 Expression of ranpirnase by recombinant E.coli after optimization of fermentor

3 結(jié) 論

通過單因素實(shí)驗(yàn)對豹蛙酶表達(dá)的誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑濃度以及誘導(dǎo)前培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果并考慮生產(chǎn)成本最終確定誘導(dǎo)溫度為37 ℃，誘導(dǎo)劑濃度為0.2 mmol/L，誘導(dǎo)前培養(yǎng)時(shí)間為3 h。通過Plackett-Burman 法優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基，在搖瓶水平上豹蛙酶表達(dá)量由優(yōu)化前的9%提高到優(yōu)化后的36%，OD600值由優(yōu)化前的4.80 提升到優(yōu)化后的5.47。以此為基礎(chǔ)，在7 L 發(fā)酵罐上采用分批補(bǔ)料方式進(jìn)行重組豹蛙酶發(fā)酵表達(dá)，表達(dá)水平可達(dá)到55%，OD600值可達(dá)到35。優(yōu)化結(jié)果對重組菌生產(chǎn)豹蛙酶的工業(yè)應(yīng)用有很好的借鑒作用。