劉 娟，馬可忠，楊 峰，吳校林，卞 芳，龔 芳

0 引 言

心肌缺血再灌注損傷是多種心血管疾病的病理過程，如何減輕心肌缺血再灌注損傷一直是近年來的研究熱點，研究表明中醫(yī)藥可以減緩缺血再灌注導致的心肌損傷[1-3]。桑白皮是?？浦参颩orusalbaL.的干燥根皮，桑白皮多糖是其主要活性成分之一，具有抗氧化的作用[4]。研究報道桑白皮多糖能顯著升高小鼠血清中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，降低血清中丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量，改善小鼠體內(nèi)異常的過氧化狀態(tài)[5]。桑白皮聯(lián)合卡托普利通過抗氧化應激改善大鼠糖尿病腎病的腎功能[6]。然而桑白皮多糖對缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷的作用及機制尚不清楚。研究報道circDLGAP4可通過靶向miR-143調(diào)節(jié)B細胞白血病/淋巴瘤2(B cell lymphoma/leukemia-2，BCL2)改善心肌缺血再灌注損傷中的心肌細胞凋亡[7]。急性缺血性中風患者的血漿和小鼠中風模型中circDLGAP4水平顯著降低；circDLGAP4的過表達可改善缺血性卒中[8]。且生物學軟件預測發(fā)現(xiàn)circDLGAP4與miR-320有結(jié)合位點。研究報道m(xù)iR-320-3p具有保護大鼠心肌細胞免受缺血/再灌注損傷[9]。miR-320通過靶向A激酶相互作用蛋白1(A kinase-interacting protein 1，AKIP1)調(diào)節(jié)缺血再灌注損傷誘導的心肌細胞凋亡[10]。以上研究表明circDLGAP4和miR-320均可改善缺血再灌注損傷心肌細胞凋亡。然而circDLGAP4與miR-320的關(guān)系，及桑白皮多糖是否通過調(diào)控circDLGAP4和miR-320的表達影響心肌細胞損傷尚不清楚。本實驗旨在研究桑白皮多糖對缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷的作用及機制是否與circDLGAP4和miR-320有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料H9C2細胞購自上海雅吉生物公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Genmed公司；桑白皮多糖購自上海益本生物醫(yī)藥科技有限公司；細胞計數(shù)試劑盒8(CCK-8)試劑盒、凋亡檢測試劑盒購自日本同仁研究所；蛋白提取試劑盒購自武漢純度生物科技有限公司；MDA含量檢測試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)、SOD活性檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；SYBR Premix ExTaqTM試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海臻諾生物科技有限公司。

1.2細胞處理與分組H9C2細胞用DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞，將其置于無氧處理過的無血清DMEM培養(yǎng)液中，在37 ℃、95% N2、5% CO2條件下缺氧培養(yǎng)6 h，然后換成正常培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2條件下復氧6 h，作為缺氧/復氧(H/R)組。正常對照組：培養(yǎng)H9C2細胞在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)相同時間，不作任何處理。

分別用0.01、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 μg/mL桑白皮多糖處理H9C2細胞及缺氧/復氧誘導H9C2細胞，檢測細胞活性選曬事業(yè)濃度，而后選擇0.1、0.2、0.4 μg/mL的桑白皮多糖預處理H9C2細胞然后進行缺氧/復氧處理，作為H/R+桑白皮多糖低、中、高劑量組。

將pcDNA及3個pcDNA-circDLGAP4質(zhì)粒分轉(zhuǎn)染至H9C2細胞，RT-qPCR檢測circDLGAP4表達水平，選擇表達水平較高的用于后續(xù)轉(zhuǎn)染實驗。H/R+pcDNA組、H/R+pcDNA-circDLGAP4組：將pcDNA、pcDNA-circDLGAP4轉(zhuǎn)染至H9C2細胞后進行缺氧/復氧處理；H/R+桑白皮多糖高劑量+si-circDLGAP4組：將si-circDLGAP4轉(zhuǎn)染至H9C2細胞后用0.4 μg/mL桑白皮多糖處理，再進行缺氧/復氧處理。

1.3CCK-8檢測細胞活性各組細胞培養(yǎng)48 h，每孔加入10 μL CCK-8試劑，孵育2 h，酶標儀檢測450 nm處吸光度值(A值)。

1.4流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡收集各組培養(yǎng)48 h的細胞，用預冷的PBS漂洗2次，與500 μL的結(jié)合緩沖液混勻；先加入10 μL的Annexin V-FITC，再加入5 μL的PI，混勻后避光孵育10 min；上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白表達提取細胞總蛋白，取適量蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，用封閉液封閉膜1 h，將膜置于加入Bax、Bcl-2一抗(1∶1000)的雜交袋中4 ℃孵育過夜；洗膜后將其置于加入二抗(1∶2000)的雜交袋中37 ℃孵育2 h，顯影、成像，Quantity-One軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參計算蛋白相對表達水平。

1.6試劑盒檢測細胞MDA含量、SOD活性和培養(yǎng)液中LDH活性收集各組細胞，按MDA、SOD試劑盒說明檢測MDA含量、SOD活性；收集細胞培養(yǎng)上清液，按LDH試劑盒說明書操作檢測LDH活性。

1.7RT-qPCR檢測circDLGAP4和miR-320的表達水平提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照試劑盒說明進行PCR，以GAPDH和U6為內(nèi)參，用2-△△Ct法計算相對表達量。circDLGAP4上游引物序列：5'-ACGGCTACTGGTTCCTAAAGC-3'，下游引物序列：5'--GGGGTCTTCTTATACGCCACT-3'；GAPDH上游引物序列：5'-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3'，下游引物序列：5'-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3'；miR-320上游引物序列：5'-ACACTCCAGCTGGGAAAAGCTGGGTTGAGA-3'，下游引物序列：5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'；U6上游引物序列：5'-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3'，下游引物序列：5'-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。

1.8雙熒光素酶報告實驗構(gòu)建circDLGAP4的野生型和突變型熒光素酶載體wt-circDLGAP4和mut-circDLGAP4，將wt-circDLGAP4和mut-circDLGAP4分別與miR-NC或miR-320共轉(zhuǎn)染至H9C2細胞中，按照試劑盒說明檢測熒光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.1 桑白皮多糖對缺氧/復氧誘導的H9C2凋亡的影響與正常對照組相比，H/R組H9C2細胞活性降低，凋亡率升高，Bax表達水平升高，Bcl-2表達水平降低(P<0.05)；與H/R組相比，H/R+桑白皮多糖低、中、高劑量組H9C2細胞活性升高，凋亡率降低，Bax表達水平降低，Bcl-2表達水平升高，呈劑量依賴性(P<0.05)，見圖1、圖2，表1。

a：正常對照組；b：H/R組；c：H/R+桑白皮多糖低劑量組；d：H/R+桑白皮多糖中劑量組；e：H/R+桑白皮多糖高劑量組

表1 桑白皮多糖對H/R誘導的H9C2細胞活性和凋亡的影響

2.2桑白皮多糖對缺氧/復氧誘導的H9C2氧化應激的影響與正常對照組相比，H/R組H9C2細胞中MDA含量及LDH活性升高，SOD活性降低(P<0.05)；與H/R組相比，H/R+桑白皮多糖低、中、高劑量組H9C2細胞中MDA含量及LDH活性降低，SOD活性升高，呈劑量依賴性(P<0.05)，見表2。

表2 桑白皮多糖對H/R誘導的H9C2氧化應激的影響

2.3桑白皮多糖對缺氧/復氧誘導的H9C2中circDLGAP4和miR-320表達的影響與正常對照組相比，H/R組H9C2細胞中circDLGAP4表達水平降低，miR-320表達水平升高(P<0.05)；與H/R組相比，H/R+桑白皮多糖低、中、高劑量組H9C2細胞中circDLGAP4表達水平升高，miR-320表達水平降低，呈劑量依賴性(P<0.05)。見表3。

表3 circDLGAP4和miR-320表達的檢測

2.4過表達circDLGAP4對缺氧/復氧誘導的H9C2凋亡氧化應激的影響與pcDNA組相比，pcDNA-circDLGAP4 1、2、3組circDLGAP4表達水平升高，表明轉(zhuǎn)染成功，見圖3。與H/R+pcDNA組相比，H/R+pcDNA-circDLGAP4組circDLGAP4表達水平升高，miR-320表達水平降低，MDA含量、LDH活性降低，SOD活性升高；H9C2細胞活性升高，H9C2細胞凋亡率及Bax表達水平降低，而Bcl-2表達水平升高(P<0.05)，見圖4、圖5，表4。

表4 過表達circDLGAP4對H/R誘導的H9C2細胞活性、凋亡及氧化應激的影響

2.5抑制circDLGAP4對桑白皮多糖作用的缺氧/復氧誘導的H9C2凋亡氧化應激的影響與H/R+桑白皮多糖高劑量組相比，H/R+桑白皮多糖高劑量+si-circDLGAP4組circDLGAP4表達水平降低，miR-320表達水平升高，H9C2細胞中MDA含量、LDH活性升高，SOD活性降低，H9C2細胞活性降低，H9C2細胞凋亡率及Bax表達水平升高，而Bcl-2表達水平降低(P<0.05)。見圖6、圖7，表5。

表5 抑制circDLGAP4可逆轉(zhuǎn)桑白皮多糖對H/R誘導的H9C2細胞活性、凋亡及氧化應激的影響

2.6circDLGAP4靶向miR-320circDLGAP4和miR-320的互補序列，見圖8。wt-circDLGAP4與miR-320共轉(zhuǎn)染的細胞熒光素酶活性較與miR-NC共轉(zhuǎn)染的降低(P<0.05)，mut-circDLGAP4與miR-320共轉(zhuǎn)染的細胞熒光素酶活性無顯著變化，見表6。

1：pcDNA；2：pcDNA-circDLGAP4 1；3：pcDNA-circDLGAP4 2；4：pcDNA-circDLGAP4 3

a：H/R+pcDNA組；b：H/R+pcDNA-circDLGAP4組

1：H/R+pcDNA組；2：H/R+pcDNA-circDLGAP4組

a：H/R組；b：H/R+桑白皮多糖高劑量組；c：H/R+桑白皮多糖高劑量+si-circDLGAP4組

1：H/R組；2：H/R+桑白皮多糖高劑量組；3：H/R+桑白皮多糖高劑量+si-circDLGAP4組

圖8 circDLGAP4和miR-320的互補序列

表6 wt-circDLGAP4、mut-circDLGAP4與miR-320、miR-NC共轉(zhuǎn)染后的細胞熒光素酶活性

3 討 論

心肌細胞凋亡及氧化應激與缺血再灌注損傷密切相關(guān)，抑制心肌細胞凋亡及氧化應激是防治缺血再灌注損傷的重要途徑[11]。中藥多糖具有顯著抗氧化作用，可減少氧化應激損傷[12]。研究報道桑白皮多糖對小鼠實驗性肝損傷有明顯保護作用[13]。從桑白皮中提取的毛果多糖可通過抑制炎癥反應和減輕胰腺組織的氧化應激來改善胰腺功能[14]。本實驗用缺氧/復氧誘導心肌細胞模擬缺血再灌注，用不同劑量桑白皮多糖處理，結(jié)果顯示，H9C2細胞活性升高，凋亡率及Bax表達水平降低，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平升高；表明桑白皮多糖可抑制缺氧/復氧誘導心肌細胞凋亡；此外，MDA含量、LDH活性降低，而SOD活性升高；表明桑白皮多糖抑制缺氧/復氧誘導心肌細胞的氧化應激。

研究報道冠心病患者外周血白細胞以及單核巨噬細胞泡沫化進程中circDLGAP4的表達水平明顯降低[15]。circDLGAP4可以通過減少細胞凋亡及線粒體損傷，從而減弱MPP +對SH-SY5Y細胞的神經(jīng)毒性作用[16]。circDLGAP4通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導內(nèi)皮細胞的缺血/再灌注損傷[17]。以上研究表明circDLGAP4可參與調(diào)控細胞損傷過程。本實驗結(jié)果顯示，缺氧/復氧誘導的H9C2細胞中circDLGAP4表達水平降低。過表達circDLGAP4后，MDA含量、LDH活性降低，而SOD活性升高；此外，H9C2細胞活性升高，H9C2細胞的凋亡率降低；表明過表達circDLGAP4可抑制缺氧/復氧誘導心肌細胞凋亡和氧化應激。

研究報道m(xù)iR-320過表達可減弱胰島素對心肌缺血損傷的心臟保護作用[18]。下調(diào)miR-320對心肌缺血再灌注損傷具有保護作用[19]。本實驗結(jié)果顯示，缺氧/復氧誘導的H9C2細胞中miR-320表達水平升高，與前人研究結(jié)果相符。且本實驗發(fā)現(xiàn)circDLGAP4可靶向調(diào)控miR-320，提示circDLGAP4可能通過下調(diào)miR-320的表達進而影響心肌細胞損傷。此外，不同劑量桑白皮多糖處理可提高circDLGAP4表達水平，降低miR-320表達水平；說明桑白皮多糖可調(diào)控circDLGAP4和miR-320的表達；而同時抑制circDLGAP4表達和桑白皮多糖處理，MDA含量、LDH活性升高，SOD活性降低，H9C2細胞活性降低，H9C2細胞凋亡率升高；表明抑制circDLGAP4可逆轉(zhuǎn)桑白皮多糖對缺氧/復氧誘導的H9C2損傷的影響。提示桑白皮多糖可能通過調(diào)控circDLGAP4/miR-320的表達影響H9C2細胞損傷。

綜上所述，桑白皮多糖通過調(diào)控circDLGAP4/miR-320對缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷起保護作用。然而本實驗還存在一些不足之處，目前實驗僅在體外細胞中進行，其是否在體內(nèi)具有同樣效用還有待于進一步研究。