于海濤 王群英 苗 青 董文珠

1.解放軍海軍第九七一醫(yī)院消化內(nèi)科，山東青島 266071；2.解放軍海軍第九七一醫(yī)院藥劑科，山東青島 266071

近年來，臨床上藥源性肝損傷病例日益增多，其中過量使用抗菌藥物是引起肝損傷的重要原因[1-2]。柳氮磺胺吡啶屬于磺胺類抗菌藥物，臨床常用于潰瘍性結(jié)腸炎的治療。但由于其具有一定的肝毒性，甚至?xí)鸩糠只颊甙l(fā)生肝衰竭[3]，導(dǎo)致柳氮磺胺吡啶的臨床應(yīng)用受到限制。但在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎等疾病的治療上，柳氮磺胺吡啶具有良好的效果，具有一定的臨床價值。因此，如何防止或減輕其造成的肝損害，仍是一個值得研究的重要課題[4-5]。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的進(jìn)步，臨床發(fā)現(xiàn)多種中藥都具有良好的保肝作用。然而保肝藥物通常具有一定的特異性，針對不同原因引起的肝損傷效果可能不同，這些保肝中藥對于柳氮磺胺吡啶所致肝損傷是否有效目前還缺乏具體的理論研究。云芝是一種常用中藥，研究顯示其具有保肝消炎、抗氧化等生物活性[6-8]，有報道認(rèn)為云芝多糖對酒精、對乙酰氨基酚、四氯化碳導(dǎo)致的肝損傷具有良好的保護(hù)效果[9-11]。五味子同樣是一種常見的具有保肝作用的中藥，已經(jīng)被臨床廣泛應(yīng)用。近期有研究發(fā)現(xiàn)，云芝五味子浸膏對于急性酒精性肝損傷具有明顯的保護(hù)作用[12]，因此本研究選取云芝五味子浸膏觀察其對柳氮磺胺吡啶引起的小鼠肝損傷的保護(hù)作用，期望找出針對此種肝損傷保護(hù)效果較好的中藥。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SPF 級ICR 小鼠，體重18～22 g，6 周齡，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK（湘）2016-0002，實驗動物合格證號：430727180 101883282。飼養(yǎng)室內(nèi)溫度控制為20～22℃，濕度40%～60%，8:00—20:00 為光照時間。

1.2 藥品和試劑

柳氮磺胺吡啶（S129986），購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；熊去氧膽酸（20180206），購自德國福克制藥；五味子、云芝購自中國人民解放軍海軍第九七一醫(yī)院，均符合2015 年版《中華人民共和國藥典》[13]的相關(guān)項下要求；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT）（20180704）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamicoxaloacetic transaminase，GOT）（20180704）和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）試劑盒（20180704），購自上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司。

1.3 儀器

GA-PSU 獨立送風(fēng)隔離籠具（蘇州市馮氏實驗動物設(shè)備有限公司）；90i 全自動顯微圖像分析系統(tǒng)（日本尼康公司）；AU400 全自動生化分析儀（日本奧林巴斯公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 藥液的制備 云芝五味子浸膏提取過程：將云芝600 g 和五味子120 g 清洗干凈，加入10 倍量蒸餾水，蒸煮3 h；再加入10 倍量蒸餾水，繼續(xù)蒸煮3 h，8 層紗布過濾，所得濾液即為所需藥物[12]。后續(xù)使用生理鹽水將其稀釋為所需濃度。柳氮磺胺吡啶和熊去氧膽酸均混懸于0.5%羧甲基纖維素鈉（sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na）溶液，使藥物濃度分別為0.100 g/ml和0.001 g/ml。

1.4.2 動物分組 適應(yīng)喂養(yǎng)1 周后，采用編號法對ICR小鼠進(jìn)行隨機(jī)編號，在電腦上從每6 只中隨機(jī)抽取1 只編入一組，共設(shè)6 組，每組10 只。分別為對照組，模型組，熊去氧膽酸組，云芝五味子浸膏低、中、高劑量組。

1.4.3 造模方法 除對照組外，其余各組均每日以柳氮磺胺吡啶溶液（1000 mg/kg，混懸于0.5%CMC-Na）灌胃給藥制備肝損傷模型；熊去氧膽酸組和云芝五味子浸膏低、中、高劑量組在柳氮磺胺吡啶給藥2 h 后，分別給予熊去氧膽酸（10 mg/kg）和云芝五味子浸膏溶液（50、100、300 mg/kg）灌胃；模型組與對照組給予等體積0.5% CMC-Na 溶液，給藥體積為均10 ml/kg，各組干預(yù)均持續(xù)14 d。第15 天所有小鼠空腹12 h 后處死。

1.5 指標(biāo)檢測

各組摘眼球取血后分離血清，采用全自動生化分析儀測定GPT、GOT 和ALP 活性。脫頸處死小鼠，迅速取出肝臟，稱重，固定于10%甲醛中。切出規(guī)則方形小塊（0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm），置于包埋盒內(nèi)。流水沖洗，脫水，透明，浸蠟，包埋。切3 μm 厚石蠟切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組肝組織病理變化，并拍照。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0 對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗，多組計量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 六組肝損傷血清學(xué)指標(biāo)比較

模型組GPT、GOT、ALP 水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。云芝五味子浸膏低、中、高劑量組GPT、GOT、ALP 均低于模型組，且云芝五味子浸膏中、高劑量組均低于云芝五味子浸膏低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見表1。

表1 六組肝損傷血清學(xué)指標(biāo)比較（U/L，）

表1 六組肝損傷血清學(xué)指標(biāo)比較（U/L，）

注：與對照組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05，bbP ＜0.01；與云芝五味子浸膏低劑量組比較，cP ＜0.05。GPT：谷丙轉(zhuǎn)氨酶；GOT：谷草轉(zhuǎn)氨酶；ALP：堿性磷酸酶

2.2 各組肝臟病理組織學(xué)結(jié)果

對照組肝臟病理切片顯示：該組肝細(xì)胞以中央靜脈為中心，肝細(xì)胞呈放射狀向周圍擴(kuò)散，排列有規(guī)律，肝細(xì)胞飽滿、清晰可見；模型組肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞破裂、壞死，肝小葉失去正常結(jié)構(gòu)，肝索排列紊亂；熊去氧膽酸組部分肝細(xì)胞出現(xiàn)腫脹，但肝小葉結(jié)構(gòu)尚完整，未見明顯的炎細(xì)胞浸潤，較模型組明顯好轉(zhuǎn)；云芝五味子浸膏各組肝細(xì)胞壞死及肝小葉結(jié)構(gòu)較模型組明顯好轉(zhuǎn)，其中云芝五味子浸膏中、高劑量組較低劑量組好轉(zhuǎn)。見圖1。

圖1 各組病理切片（蘇木精-伊紅染色，200×）

3 討論

柳氮磺胺吡啶在臨床上常用于治療潰瘍性結(jié)腸炎、強(qiáng)直性脊柱炎等，雖然效果顯著，但長期使用可致患者肝臟損害甚至急性肝壞死[14-17]。因此，為了更好地發(fā)揮柳氮磺吡啶的臨床治療作用，需要找到能防止或降低其引起肝損傷的藥物。本研究以柳氮磺胺吡啶誘導(dǎo)小鼠肝損傷為模型，旨在尋找針對柳氮磺胺吡啶所致肝損傷的保肝中藥。本研究通過將柳氮磺胺吡啶對小鼠進(jìn)行灌胃處理，檢測到小鼠血清學(xué)肝功指標(biāo)GPT、GOT 和ALP 水平較對照組顯著升高，證實肝損傷模型建立成功[18]。既往研究表明，柳氮磺胺吡啶引起的肝損傷以急性肝細(xì)胞損傷為主，可以引起GPT、GOT 和ALP 的升高[15]，同時也有報道認(rèn)為柳氮磺吡啶引起的肝損傷可以導(dǎo)致瘀膽型肝炎[19]。因此，本研究采用熊去氧膽酸作為陽性對照藥。熊去氧膽酸屬于傳統(tǒng)的保肝藥物，可以促進(jìn)膽汁酸的分泌，保護(hù)肝細(xì)胞的細(xì)胞膜，從而發(fā)揮保肝作用[20]。

云芝是多孔菌科真菌彩絨革蓋菌的干燥子實體，是一種常用中藥[13]。既往研究顯示，云芝具有保肝、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛等多種療效。報道認(rèn)為云芝多糖對于對乙酰氨基酚導(dǎo)致的肝損傷具有良好的保護(hù)作用[10,21]。王康樂等[9]研究發(fā)現(xiàn)，云芝多糖對酒精性肝損傷具有保護(hù)作用，其能有效降低酒精性肝損傷小鼠模型血清中轉(zhuǎn)氨酶及血脂的水平，起到較好的保肝作用。五味子為木蘭科植物五味子或華中五味子的干燥成熟果實，有研究表明，五味子提取物可改善化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)致的肝損傷，能明顯降低肝損傷而導(dǎo)致的轉(zhuǎn)氨酶升高，促進(jìn)膽汁的正常分泌[22]。人體中具有四氯化碳毒性的代謝產(chǎn)物可以通過脂質(zhì)過氧化造成急性肝損傷，五味子的醇提物可抵抗這一作用[23]。五味子對對乙酰氨基酚造成的肝損傷也有較好的療效[24]。馮耀培等[12]將云芝與五味子配伍嘗試研究其對急性酒精性肝損傷的保護(hù)，研究發(fā)現(xiàn)云芝五味子浸膏能夠顯著降低酒精性肝損傷小鼠中血清GPT、GOT 的水平，改善小鼠肝細(xì)胞的變性、壞死。本研究發(fā)現(xiàn)云芝五味子浸膏不僅能夠降低柳氮磺吡啶所致肝損傷小鼠血清中GPT、GOT、ALP 的水平，同樣能夠改善小鼠肝細(xì)胞的排列分布，減輕炎癥細(xì)胞浸潤和肝細(xì)胞壞死。本研究結(jié)果顯示，云芝五味子浸膏能夠有效保護(hù)柳氮磺吡啶引起的肝細(xì)胞損傷。在不同劑量組中，中、高劑量組在降低血清肝功標(biāo)志物和改善肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)方面較低劑量組有顯著改善，但中、高劑量組之間沒有明顯變化，提示云芝五味子浸膏的保肝作用隨著劑量的增加呈現(xiàn)一定的劑量相關(guān)性，但并不是劑量越高越好，仍需要尋找一個最佳的量效值。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)云芝和五味子配伍后針對柳氮磺吡啶所致肝損傷具有較好的保護(hù)作用，為云芝和五味子的配伍使用提供了一定的理論支持。既往研究認(rèn)為五味子發(fā)揮保肝作用主要與Nrf2 信號通路、p53/p21 信號通路、核因子κB 信號通路及絲裂原活化蛋白激酶信號通路有關(guān)[25]，云芝的保肝機(jī)制可能是抑制肝臟氧化應(yīng)激，改善機(jī)體相關(guān)酶類及細(xì)胞因子相關(guān)[11]。云芝和五味子配伍后是否仍通過這些途徑發(fā)揮保肝作用仍需要進(jìn)一步的深入研究，同時云芝和五味子浸膏的臨床使用也需要更多的研究提供支持。