江小艷，林旭埜

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動物科技學(xué)院，廣東廣州 510000；2.海泰達(dá)生物科技（廣州）有限公司，廣東廣州 510000）

鴿新城疫（Newcastle Disease），俗稱鴿瘟，病原屬于副黏病毒科、副黏病毒亞科、禽副黏病毒屬的禽Ⅰ型副黏病毒（APMV-Ⅰ），RNA 病毒，病毒基因組排列順序為3'-NP-P-M-F-HN-L-5'，依次編碼核衣殼蛋白、磷蛋白、基質(zhì)蛋白、融合蛋白、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白和大蛋白[1]。PPMV-Ⅰ有血凝活性，中強(qiáng)毒株在體外細(xì)胞培養(yǎng)中可在體外成纖維細(xì)胞（CEF）中增殖，通過膜融合而感染宿主細(xì)胞，出現(xiàn)明顯的細(xì)胞融合、聚集、死亡脫落等細(xì)胞病變（CPE）[2]。本研究對廣東省清遠(yuǎn)市某鴿場里疑似發(fā)生鴿瘟的病鴿，采集腦、肝臟、胰臟組織，進(jìn)行病原分離和鑒定，分析其F、HN 基因的分子特征和基因型，測定各代血凝價及細(xì)胞半數(shù)感染量，為今后鴿新城疫分子流行病學(xué)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料

廣東省清遠(yuǎn)市某鴿養(yǎng)殖場發(fā)病的美王鴿，具有嚴(yán)重的神經(jīng)癥狀，不停扭頸，瀉痢，糞便稀薄呈黃綠色。

1.2 主要試劑

Primer Star 酶，pMD19-T質(zhì)粒（Takara）；0.25%胰蛋白酶消化液（北京索萊寶科技有限公司）；新生牛血清（內(nèi)蒙古金源康生物工程有限公司）；MEM 干粉（Gibco）；柱式病毒RNA 提取試劑盒（Magen）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（艾科瑞）。

1.3 主要儀器

二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（Panasonic）；倒置顯微鏡（廣州粵顯光學(xué)儀器）；PCR 儀器（Biometra）；全自動凝膠成像分析系統(tǒng)（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技）；全自動家用型孵化器（德州市維謙孵化設(shè)備制造廠）：離心機(jī)（湖南可成儀器設(shè)備有限公司）。

1.4 實驗動物

SPF 種蛋（大華農(nóng)禽蛋有限公司）。

1.5 實驗病料

廣東省清遠(yuǎn)市某鴿養(yǎng)殖場發(fā)病的美王鴿，具有嚴(yán)重的神經(jīng)癥狀，不停扭頸，瀉痢，糞便稀薄呈黃綠色。

1.6 實驗方法

1.6.1 病鴿組織處理

將無菌采集的不同組織放于-20℃環(huán)境，反復(fù)凍融3 次后與滅菌PBS 溶液1:5 研磨，8000g 離心5min，0.22μm 濾器過濾上層清澈液體到滅菌離心管中，存放于-20℃環(huán)境。

1.6.2 病毒分離培養(yǎng)和血凝（HA）實驗

將分離的鴿的不同組織的處理液接種雞胚，0.2ml/個。棄去24h 內(nèi)死亡的胚，每日觀察4 次。收集尿囊液做HA 實驗，觀察死胚有無癥狀。根據(jù)文獻(xiàn)[3]，對收集的各代尿囊液用PBS 緩沖液在V 型96 孔板中進(jìn)行2 倍連續(xù)倍比稀釋，用1%紅細(xì)胞懸液進(jìn)行血凝試驗，測定血凝價。

1.6.3 病毒測序和分析

參考GeneBank 中已公布的鴿副黏病毒和雞新城疫病毒F、HN 基因，分別設(shè)計引物。對有血凝現(xiàn)象的尿囊液，用柱狀病毒RNA 提取試劑盒提取RNA，擴(kuò)增的F、HN 基因連接pMD19-T 載體，轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)，挑取疑似陽性的單菌落，送測。測序結(jié)果與GeneBank 中已發(fā)表的鴿副黏病毒、新城疫F 基因的核苷酸序列進(jìn)行同源性分析，并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.7 1 ～10 代TCID50 測定

1.7.1 制備CEF

去除胚腦、喙、翅膀、爪、內(nèi)臟后，用滅菌PBS 溶液清洗3 次，剪成1 mm3大小碎塊，用PBS清洗碎組織直至上清清澈無血液殘留，加入10 ml 0.25%胰蛋白酶，37℃水浴消化組織塊約15 min，每3 min 用腕部輕輕轉(zhuǎn)動并觀察，直至組織塊呈現(xiàn)通透、周圍毛絨絨的狀態(tài)，棄去胰酶液，加入2 ml 含有10% 血清的1×MEM 細(xì)胞營養(yǎng)液終止消化，棄去，補(bǔ)加15 ml 細(xì)胞營養(yǎng)液，輕輕吹散組織，靜置30 s，吸取上層細(xì)胞懸液，8 層滅菌紗布過濾，再次補(bǔ)加15 ml 細(xì)胞營養(yǎng)液，吹散、過濾，反復(fù)吹散、過濾4 次后，臺盼藍(lán)染色1 min，計數(shù)，制成終濃度為每毫升濾液中含活細(xì)胞1×106個，24 h 內(nèi)接種病毒。

1.7.2 接毒

將每代收集的病毒尿囊液用不含血清的1xMEM作10 倍系列稀釋，稀釋釋至10-1-10-9。棄去96 孔板內(nèi)細(xì)胞營養(yǎng)液，吸取100μl 病毒稀釋液到96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，空白對照加入100μl 細(xì)胞維持液（含有2%血清的1xMEM），每個病毒稀釋度做6 個重復(fù)，設(shè)置4 個空白對照，做好標(biāo)記，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，吸附1h 后，補(bǔ)加100μl 細(xì)胞維持液，放到細(xì)胞培養(yǎng)箱，每日早晚觀察并記錄細(xì)胞病變，按Reed-Muench 法計算1 ～10 代病毒細(xì)胞半數(shù)感染量。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀和解剖觀察

病鴿臨床表現(xiàn)為明顯的神經(jīng)癥狀，頭頸扭曲，拉綠色稀糞，剖檢器官可見明顯充血。

2.2 病毒分離培養(yǎng)和紅細(xì)胞凝集試驗

接種病毒死亡雞胚可見明顯全身充血，水腫，頭頸扭曲癥狀，對照組雞胚生長發(fā)育正常）。1 ～10代血凝實驗結(jié)果表明1 ～5 代毒血凝價較低、不穩(wěn)定（4 ～7log2），6 代以后血凝價穩(wěn)定在7 ～8log2。

2.3 目的基因的擴(kuò)增、同源性分析

2.3.1 F、HN 基因擴(kuò)增及進(jìn)化樹分析

F、HN 基因序列擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)電泳跑膠后，可見預(yù)期大小目的條帶。經(jīng)Lasergene 軟件分析顯示，F(xiàn) 基因開放閱讀框為1662 bp，F(xiàn) 蛋白的裂解位點氨基酸序列為：112R-R-Q-K-R-F117，HN 基因開放閱讀框為1716 bp。

2.3.2 同源性分析及遺傳進(jìn)化樹繪制

分離株與中國主要流行的雞源基因Ⅶ型NDV 毒株HA-9-06-Ch 及鴨源NDV10-006 株的F 基因核苷酸序列同源性為86.7%、70%，與疫苗株La Sota、Mukteswar 的同源性分別為83.9%、85.3%，而與鴿 源 的Qinghai/1344/2017、China/SDLC/2011、Sichuan/2045/2014 株同源性分別為99.2%、98.8%、98.5%。

分離株P(guān)PMV-GDQY與鴿源的Qinghai/1344/2017 株親緣關(guān)系最近，與鴿參考株China/SDLC/2011、Sichuan/2045/2014 在進(jìn)化樹上處于同一個分支，屬于基因Ⅵ型。

2.4 病毒組織TCID50 測定

圖1（A）所示為試驗孔，可看見明顯的細(xì)胞融合、圓縮、聚集、細(xì)胞死亡脫落等病變現(xiàn)象；圖1（B）所示為對照孔雞胚成纖維細(xì)胞生長情況，細(xì)胞貼壁生長，呈長梭形，規(guī)則排列。1 ～4 代TCID50分別為：10-6/0.1 ml、10-6.5/0.1 ml、10-7.5/0.1 ml、10-7.8/0.1 ml，5 ～10 代TCID50分別為：10-8.4/0.1 ml、10-8.2/0.1 ml、10-8.59/0.1 ml、10-8.23/0.1 ml、10-8.49/0.1 ml、10-8.4/0.1 ml。

圖1 細(xì)胞觀察

3 討論

臨床觀察病鴿具有明顯神經(jīng)癥狀、腹瀉，剖檢氣管嚴(yán)重充血。從病鴿體內(nèi)分離到的病毒在雞胚上生長良好，可以凝集雞紅細(xì)胞，F(xiàn)、HN 基因序列分析表明，F(xiàn) 蛋白裂解位點序列為112R-R-Q-KR-F117(112Arg-Arg-Gln-Lys-Arg-Phe117)，HN 基 因編碼571 個氨基酸，在不含胰酶的原代雞胚成纖維細(xì)胞上健康生長均符合強(qiáng)毒株基因特征。根據(jù)F 基因核苷酸序列遺傳距離分析，PPMV-GDQY 株與Qinghai/1344/2017 株親緣關(guān)系最近，與鴿參考株China/SDLC/2011、Sichuan/2045/2014 同屬于一個分支，同源性分別為99.2%、98.8%、98.5%，屬于基因Ⅵ型。分離株1 ～5 代血凝價較低、不穩(wěn)定，傳到6 代后，血凝價穩(wěn)定在7 ～8log2，雞胚死亡時間集中穩(wěn)定在60 ～72 h，表明分離株6 代以后的培養(yǎng)情況比較穩(wěn)定。1 ～4 代TCID50分別為：10-6/0.1 ml、10-6.5/0.1 ml、10-7.5/0.1 ml、10-7.8/0.1 ml，5 ～10 代TCID50分 別 為：10-8.4/0.1 ml、10-8.2/0.1 ml、10-8.59/0.1 ml、10-8.23/0.1 ml、10-8.49/0.1 ml、10-8.4/0.1 ml，表明分離的毒株TCID50較高且5 代以后的分布在10-8.2～10-8.59/0.1 ml。