曲 苗 ,閆向民,李 娜,李紅波,張 楊 ,孫亞偉,姚 剛,張寶剛,王成成

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學學院,烏魯木齊 830000;2.新疆畜牧科學院 畜牧所,烏魯木齊 830000;3.伊犁創(chuàng)景犇牛牧業(yè)有限公司,新疆伊寧 835000)

據(jù)報道，引起繁育率降低的原因中，屢配不孕占53.06%[1]，并且造成牛淘汰的疾病中，屢配不孕占比達到20%～30%[2]。屢配不孕是指發(fā)情周期及發(fā)情期正常，臨床檢查沒有明顯癥狀，在連續(xù)3個發(fā)情周期配種3次及以上不受孕即為屢配不孕[3]，它雖不會危害母牛生命，且有時是暫時的，有的病牛經(jīng)適當治療后可受孕，但還會引起巨大的經(jīng)濟損失。在規(guī)?；B(yǎng)殖中，西門塔爾牛的營養(yǎng)、環(huán)境及飼養(yǎng)條件均處于同一水平，經(jīng)過臨床檢查沒有發(fā)現(xiàn)明顯疾病癥狀(如持久黃體、卵巢囊腫等)的西門塔爾牛出現(xiàn)屢配不孕。有關研究表明子宮內(nèi)膜炎[4]、卵巢囊腫[5]、持久黃體[6]、輸卵管疾病等疾病因素[7]，環(huán)境溫度高，潮濕引起牛熱應激[8]，牛舍中的飼養(yǎng)密度、通風換氣條件不當?shù)拳h(huán)境因素[9]，牛的營養(yǎng)不均衡導致能量不足的營養(yǎng)因素[10]，生殖激素濃度變化等都是引起牛屢配不孕的因素[11]。近年來對屢配不孕臨床癥狀的研究很多，但是在內(nèi)分泌方面的研究相對較少。本試驗研究的西門塔爾牛為同一批分娩后的3～5歲青年牛，經(jīng)臨床檢查沒有生殖疾病，在營養(yǎng)及環(huán)境等都相同的狀態(tài)下出現(xiàn)屢配不孕，猜測其生殖激素可能影響屢配不孕，即用ELISA法對生殖激素進行檢測，探究生殖激素對西門塔爾牛屢配不孕的影響，為之后降低養(yǎng)殖成本，增加經(jīng)濟效益，提高西門塔爾牛的繁育率提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及樣品

試驗動物為伊寧市某牛場隨機選取同一批產(chǎn)后第13天，生長環(huán)境一致、飼養(yǎng)管理條件相同的 3～5歲、臨床檢查無生殖疾病的青年西門塔爾牛，根據(jù)其配次分為健康組16頭(配種1次或2次受孕)，屢配不孕組(配種3次及以上不受孕)3頭，共計19頭。在產(chǎn)后進行同期發(fā)情處理，每次注射氯前列醇鈉注射液(PG)3 mL/頭(0.1 mg/mL)，注射3次。從產(chǎn)后13 d開始每隔一周在10:00采集血液5 mL，3 000 r/min離心10 min，吸取血清，液氮中保存，備用。

1.2 試驗儀器

立式壓力蒸汽滅菌器(LDZF-30KB上海申安醫(yī)療器械廠)、電熱恒溫鼓風干燥箱(GZX-9070MBE上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)、酶標儀(ST-360KHB公司)。

1.3 試驗試劑

PGE2、GnRH、LH、FSH、PROG和E2試劑盒均購自武漢基因美公司(批號2020.04)；氯前列醇鈉注射液(PG)，寧波第2激素廠產(chǎn)品，0.2 mg×10支。

1.4 試驗方法

使用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測健康組與屢配不孕組4個時期的雌激素(E2)、孕激素(PROG)、促卵泡生成素(FSH)、促黃體生成素(LH)、前列腺素(PGE2)、促性腺激素釋放激素(GnRH)濃度[12]。這4個時期分別為：產(chǎn)后恢復期(產(chǎn)后0～第40天)、第1發(fā)情期(產(chǎn)后第41 天～第62天)、第2發(fā)情期(產(chǎn)后第63天～第84天)和第3發(fā)情期(產(chǎn)后第85天～第106天)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 21.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，并進行多重比較，結果用“平均值±標準誤”表示，使用Excel對數(shù)據(jù)進行折線圖分析，觀察生殖激素濃度變化。

2 結果與分析

2.1 不同組別間4個時期生殖激素濃度比較

由表1可知，在4個時期中，屢配不孕組6種生殖激素濃度均低于健康組。與健康組相比，屢配不孕組在產(chǎn)后恢復期E2濃度低(P<0.05)；第1發(fā)情期的E2、FSH濃度低(P<0.05)；第2發(fā)情期的屢配不孕組FSH、GnRH濃度低(P< 0.05)；第3發(fā)情期屢配不孕組PROG、PGE2濃度低(P<0.05)。

表1 不同組別4個時期生殖激素濃度Table 1 Reproductive hormone concentrations in different groups and different periods

2.2 不同組別生殖激素濃度變化

2.2.1 E2濃度 由圖1可知，在產(chǎn)后恢復期的第16、27和41天屢配不孕組E2濃度顯著低于健康組(P<0.05)，產(chǎn)后第34天屢配不孕組E2濃度高于健康組(P>0.05)?？傮w來說，屢配不孕組的E2濃度低于健康組，產(chǎn)后恢復期中、第2發(fā)情期和第3發(fā)情期的E2濃度呈波浪式變化，在第1發(fā)情期，屢配不孕組與健康組E2濃度變化穩(wěn)定。

2.2.2 PROG濃度 由圖2可知，PROG與E2濃度變化趨勢相同。在4個時期中屢配不孕組PROG濃度始終低于健康組濃度，3個發(fā)情期的PROG濃度變化規(guī)律相對平穩(wěn)，在產(chǎn)后52 d時屢配不孕組PROG濃度與健康組差異顯著(P< 0.05)。

2.2.3 FSH濃度 由圖3可知，西門塔爾牛在產(chǎn)后恢復期、第1發(fā)情期和第2發(fā)情期中FSH濃度出現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢，在第2發(fā)情期末下降，之后上升并保持平穩(wěn)狀態(tài)。屢配不孕組FSH濃度低于健康組FSH濃度，在產(chǎn)后第41天與第58天時屢配不孕組FSH濃度低于健康組(P<0.05)。

2.2.4 LH濃度 由圖4可知，屢配不孕組LH濃度在產(chǎn)后第41天與第68天高于健康組，其他時間內(nèi)低于健康組LH濃度。在產(chǎn)后第58天時屢配不孕組LH濃度顯著低于健康組 (P<0.05)。產(chǎn)后第41天的屢配不孕組與健康組LH濃度最高。第2發(fā)情期與第3發(fā)情期屢配不孕組LH濃度呈波浪式變化，而健康組呈穩(wěn)定狀態(tài)。

2.2.5 PGE2濃度 由圖5可知，屢配不孕組PGE2濃度始終低于健康組，在產(chǎn)后第16天、第41天和第91天屢配不孕組PGE2濃度低于健康組(P<0.05)，產(chǎn)后第41天屢配不孕組PGE2濃度為137.61 pg/mL,健康組PGE2濃度為 289.97 pg/mL。

2.2.6 GnRH濃度 由圖6可知，屢配不孕組GnRH濃度始終低于健康組，在產(chǎn)后第68天GnRH濃度差異顯著(P<0.05)。西門塔爾牛GnRH濃度總體呈波浪式變化。兩組GnRH濃度變化趨勢與屢配不孕組FSH濃度變化趨勢相似。

3 討 論

3.1 不同組別E2和PROG濃度變化比較

生殖激素與繁殖有很大的聯(lián)系，各生殖激素在繁殖期間不可或缺。雌激素與孕激素具有協(xié)同作用，有研究表明給切除卵巢的奶牛先注射少量孕激素后再注射雌激素可以引起奶牛發(fā)情[13]。在同一發(fā)情周期中，雌激素上升時孕激素處于下降的狀態(tài)，因為雌激素的作用是引起發(fā)情，而孕激素的作用是維持妊娠，使孕激素在發(fā)情處于最低狀態(tài)的原因是發(fā)情周期末PGE2導致其濃度降低。本試驗將屢配不孕組和健康組各生殖激素進行比較，觀察生殖激素是否影響屢配不孕。在本試驗中，E2和PROG的變化規(guī)律相似，這與祝曉麗的結果相同，祝曉麗[14]在對母水牛不同生理時期生殖激素變化規(guī)律的初步研究中得出：不同種類的水牛在發(fā)情淡、旺季中,外周血清的E2和P4的含量都是以相似的周期進行規(guī)律性變化。王宏娟[15]的研究結果表明，孕酮可做早期妊娠診斷，西門塔爾牛在發(fā)情第21天測得孕酮濃度大于 2.5 ng/mL即為懷孕，但是本試驗由于沒有根據(jù)同一情期時間進行采樣，所以無法從激素濃度上確定是否懷孕。謝炳坤[16]的研究表明，在發(fā)情周期中黃牛孕酮水平變化情況與雌二醇變化情況相反，在雌二醇出現(xiàn)高值時，孕酮處于低水平。Henricks等[17]測得肉牛孕激素與雌激素兩者變化規(guī)律相反，與本試驗結果不同。本試驗結果表明，雌激素升高時，孕激素同樣也升高，結果不相同的原因可能是兩種牛品種不同，并且謝炳坤的采樣時間是一個周期，而本試驗的采樣時間間隔相對較長，導致兩者結果不同。屢配不孕組PROG濃度始終低于健康組PROG濃度，說明PROG濃度降低可能導致西門塔爾牛屢配不孕。孟令儒[18]研究表明，使用促黃體激素和孕酮對屢配不孕牛進行治療，結果顯示治療后的妊娠率升高，說明促黃體激素和孕激素對屢配不孕牛有影響。

3.2 不同組別FSH和LH濃度變化比較

FSH在繁殖方面有重要作用，它可刺激卵巢生長，促進卵泡顆粒細胞增長和發(fā)育[19]。FSH與LH具有協(xié)同作用[20-22]，王宏娟[15]發(fā)表的肉用母牛發(fā)情周期體內(nèi)生殖激素變化規(guī)律與早期妊娠診斷技術的研究中表明，檢測的3個品種中未孕牛的LH濃度高于健康牛，與本試驗結果一致。Colazo等[23]使用3種不同劑量的促性腺激素釋放激素對牛進行注射，并進行同期發(fā)情，發(fā)現(xiàn)PGF2處理后的牛血漿中LH明顯高于對照組，前者濃度是(8.8±1.1) ng/mL，對照組濃度是(5.1±1.3) ng/mL，說明PGF2影響LH濃度。

3.3 不同組別PGE2濃度變化比較

PGE2具有多種作用，在生殖方面，PGE2作用是溶解黃體[24]，Shemesh等[25]研究表明，LH對PGE2有影響，在LH刺激的第15天，育成母羊的子宮內(nèi)膜僅分泌PGE2，表明LH可能參與母羊早孕期黃體溶解的預防，說明LH濃度影響PGE2的濃度變化。圖4和圖5顯示出LH和PGE2兩種激素變化相似。有研究表明，PGE2濃度變化與LH濃度變化有關系[26-27]。本試驗中屢配不孕組PGE2濃度始終低于健康組PGE2濃度，猜測PGE2可能是引起西門塔爾牛屢配不孕的原因之一。

3.4 不同組別GnRH濃度變化比較

GnRH在生殖活動中起重要作用。GnRH由垂體分泌，調節(jié)FSH和LH濃度，LH對PGE2的分泌起正反饋作用[28]，由于PROG抑制GnRH合成與釋放，所以導致LH排卵前高峰受到抑制[29]，E2和PROG也會相互作用，有研究稱GnRH類似物與芳香酶活性有關，GnRH可以增加芳香酶活性，刺激E2生成及分泌；并且GnRH還參與卵泡細胞成熟及破裂相關基因的表達，其中包括PROG的受體[30]。本試驗中屢配不孕組GnRH濃度始終低于健康組GnRH濃度，猜測GnRH濃度不足可能導致西門塔爾牛屢配不孕。本試驗屢配不孕組與健康組各激素變化趨勢相似，究其原因可能是因為采樣時間間隔太長，使得激素的一些變化沒有及時獲取，導致兩組趨勢 相似。

4 結 論

生殖激素濃度不足可能會出現(xiàn)屢配不孕，激素濃度或可作為評價西門塔爾牛屢配不孕的參考，在配種前對牛生殖激素進行檢測，做出有效防治措施。