周 潔，郭佳惠

(1.江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院，江蘇 南京 211153；2.南京林業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210037)

榔榆(UlmusparvifoliaJacq.)為榆科(Ulmaceae)榆屬的落葉喬木，別名蚊榔樹、脫皮榆、小葉榆等，是珍貴硬闊用材樹種，其樹高達(dá)25 m，胸徑可達(dá)1.2 m[1-2]。榔榆適應(yīng)性較強(qiáng)，喜光，喜溫暖濕潤(rùn)氣候，耐干旱瘠薄，對(duì)土壤的酸堿度要求較低，在不同土質(zhì)下均能正常生長(zhǎng)[3-5]，以氣候溫暖，土壤肥沃、排水良好的中性土壤為最適宜的生境。

榔榆為適合江蘇發(fā)展的鄉(xiāng)土優(yōu)質(zhì)珍貴用材樹種和我國(guó)雜木類盆景中嶺南派盆景的重要樹種之一[6]。作為榆科中抗榆樹荷蘭病重要的種質(zhì)資源，其也是礦區(qū)的重要綠化樹種[7]和鹽堿地生態(tài)修復(fù)樹種。目前榔榆的繁殖方法主要為扦插、播種、嫁接，育苗周期長(zhǎng)，不利于新品種的快速推廣和應(yīng)用。建立榔榆組織培養(yǎng)快繁技術(shù)體系對(duì)于榔榆新品種的快速推廣具有重要的意義。

近年來，在榔榆的抗性方面開展了抗旱[8-9]、干濕交替[10]、耐熱等研究。2005年，韋小麗在貴州喀斯特地貌區(qū)進(jìn)行青檀、樸樹、榔榆的水分脅迫試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)榔榆抗旱能力更強(qiáng)。吳曉宇[6]研究了榔榆的低溫脅迫生理變化，發(fā)現(xiàn)榔榆是通過體內(nèi)膜透性的改變以及滲透物質(zhì)積累來抵抗低溫造成的傷害。但在耐重金屬和耐鹽方面研究還較少。為此，本文利用組培養(yǎng)技術(shù)對(duì)榔榆進(jìn)行擴(kuò)大繁殖，對(duì)其移栽苗進(jìn)行了耐鹽和耐重金屬鎘的抗性試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取生長(zhǎng)健壯的榔榆優(yōu)良無性系，采用未木質(zhì)化或半木質(zhì)化的1年生帶芽莖段作為外植體，進(jìn)行脫毒、誘導(dǎo)叢生苗，進(jìn)而增殖培養(yǎng)，最后進(jìn)行壯苗生根培養(yǎng)。本試驗(yàn)包括芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基。培養(yǎng)室溫度為22—25 ℃，光照度2 000—3 000 lx，16 h/d光照培養(yǎng)。

1.2 外植體脫毒

從植株上剪取嫩梢及半木質(zhì)化莖段，用自來水沖洗10 min，再用洗衣粉溶液漂洗5—10 min，放入70%酒精中浸泡30 s,然后用2%和5%的次氯酸鈉溶液分別浸泡1—2，2—5，5—8，8—10 min，最后用無菌水沖洗5次。將沖洗后的芽置于無菌濾紙上，吸干表面水分，用剪刀剪去基部傷口部分,將莖段接種于已滅菌的初代培養(yǎng)基上。

1.3 試管苗的誘導(dǎo)、增殖和生根培養(yǎng)

切去莖段2端，將帶芽莖段接種于添加了不同質(zhì)量濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。待莖段長(zhǎng)出幼苗，將誘導(dǎo)得到的無菌苗進(jìn)行繼代、增殖和生根培養(yǎng)。培養(yǎng)基中含有不同質(zhì)量濃度的6-BA(0.05，0.20，0.50，1.00 mg/L)與IBA(0.025，0.005，0.002 mg/L)或NAA(0.01，0.05，0.10，0.50，1.00 mg/L)，TDZ(0.01，0.02，0.10 mg/L)組合的MS 和WP培養(yǎng)基中，所用誘導(dǎo)、增殖和生根培養(yǎng)基如表1，根據(jù)出苗和出芽狀態(tài)篩選培養(yǎng)基配方。蔗糖為30 g/L，瓊脂8 g/L，pH5.8。

表1 參試培養(yǎng)基生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配方

1.4 煉苗及移栽

用于抗性試驗(yàn)的組織培養(yǎng)幼苗移栽在光照培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行，溫度保持在22—25 ℃，光照強(qiáng)度為20 000 lx，光照周期為16 h/8 h。選用1 L的塑料罐，裝入泥炭土，將帶根的整株組織培養(yǎng)苗移栽到塑料罐中，用噴壺噴施罐子四周有水珠但不滴水，用保鮮膜進(jìn)行封口，7 d后將保鮮膜周邊和中間扎洞，待植株新長(zhǎng)出2—3片新的嫩葉后揭開一半保鮮膜，14—21 d后完全揭開，2—3 d用噴壺噴水保濕，防止強(qiáng)光照導(dǎo)致嫩葉失水。煉苗28 d后，將組織培養(yǎng)苗移栽至溫室大棚，進(jìn)行容器育苗。容器選用直徑為12 cm的黑色塑料袋，基質(zhì)配方為泥炭∶蛭石∶珍珠巖=7∶2∶1(容積比)，每7 d澆水1次，澆水溶肥1次，水溶肥為1 000倍的花多多1號(hào)。

1.5 移栽苗抗性試驗(yàn)

將移栽到育苗袋中的組織培養(yǎng)苗進(jìn)行鹽脅迫和鎘脅迫試驗(yàn)，鹽脅迫采用100 mM的NaCl溶液，鎘脅迫采用20 mg/kg的CdCl2溶液(pH 5.5),試驗(yàn)處理苗各15株，3組重復(fù)，脅迫處理21 d，取葉樣各0.5 g，放4 ℃冰箱備用，測(cè)取各生理指標(biāo)。

1.6 生理指標(biāo)的測(cè)定

取出葉片，按照組織質(zhì)量(g)∶提取液體積(mL)為1∶(5—10)的比例(本試驗(yàn)稱取組織約0.1 g，加入提取液1 mL)，進(jìn)行冰浴勻漿。4 ℃下以8 000 g離心10 min，取上清液，置冰上待測(cè)。各指標(biāo)采用試劑盒法測(cè)定(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)：超氧化物歧化酶SOD(貨號(hào)SOD-2-Y)、過氧化物酶POD(貨號(hào)POD-2-Y)、過氧化氫酶CAT(貨號(hào)CAT-2-Y)、丙二醛MDA(貨號(hào)MDA-2-Y)。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體的滅菌試驗(yàn)

榔榆優(yōu)良無性系莖段外植體用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的次氯酸鈉溶液進(jìn)行滅菌處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)新萌出的綠色嫩梢在2% NaClO溶液中滅菌2—5 min效果最好，可以獲得無菌莖段。NaClO質(zhì)量分?jǐn)?shù)高，嫩梢會(huì)產(chǎn)生毒害，發(fā)黑死亡；處理時(shí)間超過5 min新梢莖段褐化，葉片發(fā)黑。半木質(zhì)化的莖段在5%的NaClO溶液5—8 min效果較好，時(shí)間延長(zhǎng)后容易產(chǎn)生毒害，莖段褐化，不利于萌出新芽(如圖1)。

圖1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaClO溶液對(duì)莖段滅菌試驗(yàn)

2.2 外植體的誘導(dǎo)培養(yǎng)

剪取長(zhǎng)約3—5 cm的無菌莖段接種到配制的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)嫩芽(見圖2)，可以看出S2，S3，S7，S8，S9均能誘導(dǎo)出嫩芽。S2誘導(dǎo)的幼苗生長(zhǎng)速度較快，20 d能進(jìn)行繼代培養(yǎng);S3則長(zhǎng)出較多愈傷組織，S7的苗生長(zhǎng)較慢，長(zhǎng)勢(shì)弱，沒有顯著的高生長(zhǎng);S8誘導(dǎo)的苗較??；其余培養(yǎng)基均未誘導(dǎo)出健康的幼苗。認(rèn)為榔榆較適誘導(dǎo)培養(yǎng)基為S2：MS+1.00 mg/L 6-BA + 0.002 mg/L IBA，蔗糖30 g/L，pH 5.8。

圖2 誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選

2.3 試管苗的增殖培養(yǎng)

將初代培養(yǎng)誘導(dǎo)的嫩苗剪成3 cm左右的莖段放置在表1的培養(yǎng)基上，以期誘導(dǎo)榔榆的叢生芽(見圖3)。由圖3可以看出，在培養(yǎng)基1上生長(zhǎng)，3 d后側(cè)芽開始萌動(dòng)，7 d左右生成幼苗；在培養(yǎng)基2—5中均能產(chǎn)生叢芽。在培養(yǎng)基3，4中產(chǎn)生較多愈傷組織，芽淺綠，愈傷組織發(fā)黃成塊，容易褐化，在培養(yǎng)基5上增殖系數(shù)較高，能長(zhǎng)出芽8—10個(gè)，芽綠色健壯，認(rèn)為5號(hào)為適宜增殖培養(yǎng)基，配方為MS+0.50 mg/L 6-BA +0.10 mg/L NAA +0.01 mg/L TDZ。

圖3 叢芽增殖培養(yǎng)

2.4 試管苗的芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)

誘導(dǎo)叢芽后，芽經(jīng)過高生長(zhǎng)長(zhǎng)成植株(見圖4)。從圖4中可以看出，S1，S4和5號(hào)可以誘導(dǎo)芽的生長(zhǎng)，S5，S6芽粗壯，但是高沒有生長(zhǎng)。S1，S4為嫩苗生長(zhǎng)，5號(hào)為在增殖培養(yǎng)基上繼續(xù)生長(zhǎng)，可以省去換培養(yǎng)基的步驟，但是容易木質(zhì)化，幼嫩的芽容易褐化。所以可以選擇S4作為生長(zhǎng)培養(yǎng)基，配方為S4：MS+ 0.50 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA + 0.02 mg/L TDZ。

圖4 芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)

2.5 試管苗的生根培養(yǎng)

在瓶?jī)?nèi)生根形成完整植株，可以提高移栽成活率。在生根培養(yǎng)基表1的配方中，R1，R2培養(yǎng)基生長(zhǎng)的根較細(xì)，R3的生根速度最快，7—10 d就能生根，根較為健壯，且根系發(fā)達(dá)，R4生根粗壯，但是根部愈傷組織容易褐化，影響植株的生長(zhǎng)(見圖5)。所以R3：WPM+0.50 mg/L NAA 為最適生根培養(yǎng)基。

2.6 移栽苗的鹽脅迫和鎘脅迫試驗(yàn)

在鹽脅迫下，榔榆移栽苗的SOD活性升高，達(dá)938.21 U/g；CAT的活性有所降低，為112.59 nmol/(min·g)；POD活性降低最多，由未處理的5 548.58 U/g，降至為1 859.23 U/g；MDA含量升高，為80.50 nmol/g(見圖6)。在酸性的重金屬Cd脅迫21 d，榔榆移栽苗SOD活性降至650.93 U/g;CAT的活性升高至182.44 nmol/(min·g);POD活性降低最多，由未處理的5 548.58 U/g降至1 550.63 U/g；而MDA含量升高，為86.29 nmol/g(見圖6)。

圖6 榔榆耐鹽和耐鎘脅迫的生理變化

3 討論與結(jié)論

榆屬常見樹種組織培養(yǎng)工作在國(guó)內(nèi)外已經(jīng)取得了一些成果。Dorion，Bolyard，F(xiàn)enning等[11-13]利用美國(guó)榆嫩枝的形成層組織作為外植體，獲得了愈傷組織，但是沒有分化。Thakur等人獲得愈傷組織并進(jìn)行2次繼代培養(yǎng)，使其分化出叢生芽得到了植株[14]。國(guó)內(nèi)相繼建立了白榆[15]、黃榆[16]、家榆[17]、金葉榆[18]等組織培養(yǎng)體系，但是榔榆的組織培養(yǎng)還未見研究。本研究獲得了榔榆的誘導(dǎo)、增殖、伸長(zhǎng)和生根的培養(yǎng)基配方，建立了榔榆的工廠化育苗快繁體系。

本研究成功建立了珍貴彩色鄉(xiāng)土樹種榔榆優(yōu)良無性系的組織培養(yǎng)再生體系，探究了移栽苗對(duì)鹽脅迫和重金屬鎘脅迫的應(yīng)答反應(yīng)，說明榔榆組織培養(yǎng)移栽苗對(duì)于高鹽和重金屬鎘土壤具有一定的適應(yīng)性，為榔榆種苗繁育和推廣應(yīng)用提供了技術(shù)參考，對(duì)生態(tài)環(huán)境綠化和修復(fù)具有一定意義。