左 斌，夏曉楓，車 彪，何精選，唐家國

腰椎間盤突出是由多種因素產(chǎn)生的復(fù)雜脊柱疾病[1]，主要原因?yàn)樽甸g盤退變。腰椎間盤組織再生能力有限，而髓核細(xì)胞(NPCs)是腰椎間盤組織的唯一構(gòu)成細(xì)胞，NPCs退變可直接使椎間盤組織中細(xì)胞數(shù)量減少[2]。椎間盤退變的機(jī)制涉及NPCs凋亡和炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生，褪黑素不僅能促進(jìn)NPCs的增殖[3]，還能抵抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的NPCs凋亡[4]。沉默信息調(diào)節(jié)因子(SIRT)可以降低氧化應(yīng)激水平和炎癥程度[5]，還可通過叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O1(FOXO1)途徑調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的大鼠NPCs衰退[6]。但是褪黑素調(diào)控SIRT1/FOXO1通路對椎間盤NPCs退變的影響，目前報(bào)道較少。本研究通過使用過氧化氫處理椎間盤NPCs以誘導(dǎo)氧化性損傷，模擬體外NPCs退變，并干擾SIRT1后使用褪黑素處理，旨在從SIRT1/FOXO1通路探討褪黑素對椎間盤NPCs退變的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1人椎間盤髓核組織：本研究所用髓核組織源于長江航運(yùn)總醫(yī)院骨外科腰椎間盤突出癥患者12例，年齡45～67歲，平均52歲，保守治療無效。所有患者均已自愿簽訂知情同意書，本研究獲得醫(yī)院倫理委員會審批，倫理批準(zhǔn)編號：L20200058。

1.1.2主要試劑和儀器：褪黑素(原料藥，純度99%，西安金綠生物工程技術(shù)有限公司,批號：73-35-2)；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)購自北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司,批號：VN10053；siRNA NC(RNA干擾陰性對照)和siRNA SIRT1(RNA干擾SIRT1表達(dá)載體)均由上海生工生物科技有限公司合成(批號：K10059、K10061)；RNA抽提試劑盒(批號：P1063)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號：PD5017)、熒光定量PCR試劑盒(批號：SF4113L)、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(批號：C1065S)均購自上海碧云天生物科技有限公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α，批號：m1034517)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β，批號：m1062451)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；聚集蛋白聚糖(Aggrecan，批號：ab60133)、Ⅱ型膠原蛋白(collagen Ⅱ，批號：ab60472)、SIRT1(批號：ab60355)、FOXO1乙?；?acely-FOXO1，批號：ab60857)購自美國Abcam公司；FLUOstar Omega型全自動多功能酶標(biāo)儀購自德國BMG LABTECH公司；TL988型qRT-PCR儀購自西安天隆科技有限公司；Attune NxT型流式細(xì)胞儀購自北京昊諾斯科技有限公司。

1.2方法

1.2.1NPCs的分離與培養(yǎng)：將12例髓核組織用無菌眼科剪剪成約1 mm3的塊狀后混合，加入適量0.25%胰蛋白酶消化30 min后。置于0.2% Ⅱ型膠原酶中室溫消化4 h。使用200目濾網(wǎng)過濾并離心收集細(xì)胞，然后加入含15%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，放入37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞貼壁生長后，使用倒置顯微鏡觀察并鑒定細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞密度為80%～90%后，用0.25%胰蛋白酶消化傳代并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2CCK-8法檢測NPCs的細(xì)胞活性：收集NPCs，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升1×105個(gè)，每孔接種100 μl至96孔板中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁，空白孔加入100 μl培養(yǎng)液，其余各孔依次加入終濃度為0、100、200、300、400 μmol/L過氧化氫或終濃度為0、0.01、0.1、1 μmol/L褪黑素的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入濃度為10%的CCK-8溶液，培養(yǎng)2 h后，于酶標(biāo)儀上檢測各孔在450 nm波長下的OD值。每組各設(shè)6個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞增殖率(%)=(實(shí)驗(yàn)孔OD450 nm-空白孔OD450 nm)/(對照孔OD450 nm-空白孔OD450 nm)×100%。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組：調(diào)整NPCs濃度為每毫升1×106個(gè)，接種于6孔板，使用Lipfectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒分別將siRNA NC和siRNA SIRT1轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后，使用200 μmol/L過氧化氫處理以誘導(dǎo)氧化性損傷，細(xì)胞分為過氧化氫組(僅使用200 μmol/L過氧化氫處理)、褪黑素+過氧化氫組(200 μmol/L過氧化氫、1 μmol/L褪黑素處理)、褪黑素+siRNA NC組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA NC后使用200 μmol/L過氧化氫、1 μmol/L褪黑素處理)、褪黑素+siRNA SIRT1組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA SIRT1后使用200 μmol/L過氧化氫、1 μmol/L褪黑素處理)，另取不使用過氧化氫處理的非轉(zhuǎn)染NPCs作為對照組。各組細(xì)胞處理24 h后，檢測各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.4SIRT1 mRNA表達(dá)水平檢測：RNA抽提試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA，以cDNA為模板，按照qRT-PCR試劑盒說明書配置PCR反應(yīng)體系：2×SYBR mix 10 μl，水8 μl，上下游引物各0.5 μl，10×cDNA模板1 μl。反應(yīng)條件設(shè)定為：95 ℃預(yù)變性5 min、95 ℃變性15 s、60 ℃退火50 s、72 ℃延伸10 min，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，根據(jù)2-ΔΔCt計(jì)算SIRT1 mRNA表達(dá)水平。SIRT1、GAPDH引物均由上海生工生物科技有限公司合成。

1.2.5流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率：收集各組細(xì)胞，1200 r/min，離心5 min，棄上清，用PBS洗滌2次后，加入400 μl結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，再加入5 μl Annexin V染液，輕輕混勻后置于2～8 ℃避光條件下孵育15 min；然后加入10 μl PI輕輕混勻，于2～8 ℃避光下繼續(xù)孵育5 min后，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.2.6ELISA檢測TNF-α、IL-1β含量：收集各組細(xì)胞上清液，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測，每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)。

1.2.7蛋白免疫印跡法檢測退化相關(guān)指標(biāo)Aggrecan、collagen Ⅱ以及SIRT1、FOXO1蛋白表達(dá)水平：收集各組細(xì)胞，使用蛋白提取試劑盒提取總蛋白，應(yīng)用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量檢測。然后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)PVDF膜、5%脫脂奶粉封閉1 h、1∶1000濃度稀釋后的Aggrecan、collagen Ⅱ、SIRT1、FOXO1、acely-FOXO1和GAPDH一抗4 ℃過夜孵育、含辣根過氧化物酶綴合的二抗室溫孵育2 h。用ECL顯色試劑盒顯色，凝膠成像分析系統(tǒng)拍照。以GAPDH為內(nèi)參，分析各組蛋白表達(dá)水平，每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1原代退變椎間盤NPCs形態(tài) 人原代退變椎間盤NPCs多呈類圓形、多角形或梭形。見圖1。

圖1 人原代退變椎間盤NPCs形態(tài)(×40)NPCs為髓核細(xì)胞

2.2褪黑素對過氧化氫處理NPCs增殖率的影響 200、300、400 μmol/L過氧化氫均可顯著抑制NPCs增殖(P<0.05)。后續(xù)將使用200 μmol/L過氧化氫處理以誘導(dǎo)氧化性損傷。使用0、0.01、0.1、1 μmol/L褪黑素處理損傷NPCs后發(fā)現(xiàn)，1 μmol/L褪黑素能顯著提高200 μmol/L過氧化氫處理的NPCs增殖率(P<0.05)。見圖2。

圖2 不同濃度褪黑素對過氧化氫處理的NPCs增殖率的影響NPCs為髓核細(xì)胞；與過氧化氫0 μmol/L時(shí)比較，aP<0.05；與過氧化氫濃度為200 μmol/L、褪黑素0 μmol/L時(shí)比較，bP<0.05

2.3褪黑素對過氧化氫處理NPCs中SIRT1 mRNA表達(dá)水平的影響 5組STRTI mRNA表達(dá)水平分別為：對照組1.00±0.00、過氧化氫組0.52±0.06、褪黑素組0.83±0.09、褪黑素+siRNA NC組0.87±0.10、褪黑素+siRNA SIRT1組0.46±0.05。與對照組比較，過氧化氫組NPCs中SIRT1 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)；與過氧化氫組比較，褪黑素組和褪黑素+siRNA NC組NPCs中SIRT1 mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)；與褪黑素組和褪黑素+siRNA NC組相比，褪黑素+siRNA SIRT1組NPCs中SIRT1 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)。

2.4褪黑素對過氧化氫處理NPCs上清液中TNF-α和IL-1β含量的影響 與對照組比較，過氧化氫組NPCs上清液中TNF-α和IL-1β含量升高(P<0.05)；與過氧化氫組比較，褪黑素組和褪黑素+siRNA NC組NPCs上清液中TNF-α和IL-1β含量降低(P<0.05)；與褪黑素組和褪黑素+siRNA NC組比較，褪黑素+siRNA SIRT1組NPCs上清液中TNF-α和IL-1β含量升高(P<0.05)。見表1。

表1 5組NPCs上清液中TNF-α和IL-1β含量比較

2.5褪黑素對過氧化氫處理的NPCs細(xì)胞凋亡的影響 5組細(xì)胞凋亡率分別為：對照組(3.87±0.39)%、過氧化氫組(34.35±3.52)%、褪黑素組(12.26±1.35)%、褪黑素+siRNA NC組(13.55±1.48)%、褪黑素+siRNA SIRT1組(25.64±3.63)%。與對照組比較，過氧化氫組NPCs凋亡率升高(P<0.05)；與過氧化氫組比較，褪黑素組和褪黑素+siRNA NC組NPCs凋亡率降低(P<0.05)；與褪黑素組和褪黑素+siRNA NC組比較，褪黑素+siRNA SIRT1組NPCs凋亡率升高(P<0.05)。

2.6褪黑素對過氧化氫處理的NPCs中Aggrecan、collagen Ⅱ、SIRT1和FOXO1蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較，過氧化氫組NPCs中Aggrecan、collagen Ⅱ、SIRT1蛋白表達(dá)水平降低，acely-FOXO1蛋白水平升高(P<0.05)。與過氧化氫組相比，褪黑素組和褪黑素+siRNA NC組NPCs中Aggrecan、collagen Ⅱ、SIRT1蛋白表達(dá)水平升高，acely-FOXO1蛋白水平降低(P<0.05)。與褪黑素組和褪黑素+siRNA NC組相比，褪黑素+siRNA SIRT1組NPCs中Aggrecan、collagen Ⅱ、SIRT1蛋白表達(dá)水平降低，acely-FOXO1蛋白水平升高(P<0.05)。見表2。

表2 5組NPCs中Aggrecan、collagen Ⅱ、SIRT1、acely-FOXO1蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

有研究報(bào)道，遺傳和環(huán)境因素均可引起椎間盤退變[7]，而NPCs是構(gòu)成椎間盤組織的唯一細(xì)胞，其功能的衰退是引起椎間盤退變的主要原因[8]。另外，過氧化氫可在體外處理NPCs以誘導(dǎo)氧化性損傷模擬椎間盤功能衰退[9]。本研究結(jié)果顯示，過氧化氫能顯著抑制NPCs增殖，且1 μmol/L褪黑素能顯著提高NPCs增殖率。因此后續(xù)分別使用200 μmol/L過氧化氫和1 μmol/L褪黑素處理椎間盤NPCs。

椎間盤退變發(fā)病機(jī)制包括細(xì)胞氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙和細(xì)胞凋亡，褪黑素可以消除氧自由基，調(diào)節(jié)線粒體的平衡和功能，防止細(xì)胞凋亡[10]。Guo等[11]研究發(fā)現(xiàn)褪黑素能有效預(yù)防骨關(guān)節(jié)炎。另外，Zhang等[12]研究發(fā)現(xiàn)褪黑素可減輕大鼠椎間盤退變和炎癥。褪黑素治療可改善人軟骨細(xì)胞的增殖，促進(jìn)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(Aggrecan和collagen Ⅱ)的表達(dá)[13]。另外，在退變椎間盤中SIRT1表達(dá)降低，SIRT1的激活可以抑制NPCs的凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖[14]。在椎間盤退變過程中Aggrecan和collagen Ⅱ蛋白表達(dá)水平顯著降低，導(dǎo)致椎間盤形態(tài)及結(jié)構(gòu)改變[15]。本研究結(jié)果顯示，褪黑素能顯著提高NPCs中SIRT1 mRNA及蛋白、Aggrecan、collagen Ⅱ蛋白表達(dá)水平，并使TNF-α和IL-1β含量、細(xì)胞凋亡率及acely-FOXO1蛋白水平顯著降低。Ge等[16]研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素能夠改善細(xì)胞存活和功能，從而保護(hù)椎間盤不發(fā)生退變。另外，褪黑素可抵抗脂多糖處理的大鼠海馬組織氧化應(yīng)激損傷、急性神經(jīng)炎癥和凋亡性神經(jīng)退行性變[17]。以上研究表明，褪黑素可調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白表達(dá)水平，降低炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，緩解椎間盤NPCs退變。本研究結(jié)果同時(shí)顯示，與褪黑素組和褪黑素+siRNA NC組相比，干擾SIRT1顯著提高細(xì)胞凋亡率，與Shen等[18]研究結(jié)果一致。另外，干擾SIRT1還能顯著降低SIRT1 mRNA及蛋白、Aggrecan、collagen Ⅱ蛋白表達(dá)水平，顯著提高TNF-α和IL-1β含量及acely-FOXO1蛋白水平，提示干擾SIRT1能夠逆轉(zhuǎn)褪黑素延緩椎間盤NPCs退變的作用。

綜上所述，褪黑素能夠通過上調(diào)SIRT1表達(dá)，抑制FOXO1乙酰化，減輕炎癥反應(yīng)，減少細(xì)胞凋亡，緩解椎間盤NPCs退變，而干擾SIRT1能逆轉(zhuǎn)褪黑素的保護(hù)作用。但是褪黑素對椎間盤NPCs退變的作用機(jī)制較為復(fù)雜，尚需深入研究。