劉志勇，任賀，陳沖，張京晶，張曉夢，石妍，石林玉，陳瀅，程鳳，賈莉，陳曼，范慶煒，張家榕，李萬婷，王萌春，任子林，劉雅誠，倪銘，孫宏鈺，嚴(yán)江偉

研究報告

基于有限突變模型和大規(guī)模數(shù)據(jù)的19個常染色體STR的實際突變率研究

劉志勇2，任賀3，陳沖4，張京晶5，張曉夢1，石妍4，石林玉1，陳瀅4，程鳳1，賈莉4，陳曼6，范慶煒7，張家榕1，李萬婷1，王萌春1，任子林8，劉雅誠4，倪銘8，孫宏鈺2，嚴(yán)江偉1

1.山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，太原 030001 2.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，廣州 510080 3.北京警察學(xué)院，北京 102202 4.北京通達(dá)首誠司法鑒定所，北京 100192 5.北京華彥科技有限公司司法鑒定所，北京 100192 6.南方醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，廣州 510515 7.川北醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，南充 637000 8.北京輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850

短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat, STR)已廣泛用于法醫(yī)學(xué)親子鑒定和個體識別中，但STR的突變可能會影響其結(jié)果的解釋。在大多數(shù)類似研究中，由于忽略“隱性”突變現(xiàn)象，STR的突變率被低估。鑒于此，為獲得更加準(zhǔn)確的STR實際突變率，本研究使用Slooten與Ricciardi提出的有限突變模型和大規(guī)模數(shù)據(jù)，對28,313例(78,739個體)中國北京漢族已確認(rèn)親生關(guān)系的親子鑒定案的20個常染色體STR基因座(和；由于有限突變模型中未包含的矯正參數(shù)，因此本文實際計算其余19個STR基因座的突變率)進行了調(diào)查。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有基因座均存在突變現(xiàn)象，總計發(fā)生1665個突變事件，包括1614個一步突變，34個兩步突變，8個三步突變和9個非整步突變?；蜃禺愋缘钠骄鶎嶋H突變率在三聯(lián)體中為0.00007700 ()～0.00459050 ()，在二聯(lián)體中為0.00000000 ()～0.00344850()。此外，本研究還分析了表面和實際突變率、三聯(lián)體和二聯(lián)體突變率、父源和母源的突變率之間的關(guān)系。研究表明，實際突變率多大于表面突變率，而且1*/2* (表面突變率)的比值通常也大于1/2 (實際突變率) (1*,1;2*,2分別是一步和兩步的突變率)，即更多的“隱性”突變被釋放出來。而且父源和母源的三聯(lián)體和二聯(lián)體的突變率也有存在差異。隨后，將這些突變率數(shù)據(jù)與已發(fā)表的中國其他漢族人口的相關(guān)研究進行比較，展現(xiàn)出了STR突變率的時間與區(qū)域差異。由于樣本量大，本研究中還報告了一些少見的突變事件，例如同卵雙胞胎突變和“假四步突變”等。綜上所述，本研究通過大量數(shù)據(jù)獲得了接近真實的STR突變率的估計值，不僅可為中國法醫(yī)DNA數(shù)據(jù)庫和群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也對開展法醫(yī)學(xué)個體識別、親權(quán)鑒定和遺傳學(xué)研究具有重要的意義。

常染色體STR；有限突變模型；親子鑒定；中國漢族人群；突變分析

STR (short tandem repeat)是人類基因組中非常豐富的一類遺傳標(biāo)記[1]，由于其高度的多態(tài)性[2,3]，被廣泛應(yīng)用于個體識別、親子鑒定和群體遺傳學(xué)等領(lǐng)域。然而，在大多數(shù)STR基因座中都可以觀察到突變事件，一般認(rèn)為復(fù)制滑脫是導(dǎo)致STR突變的主要機制[4]。這些突變現(xiàn)象往往會對法醫(yī)學(xué)實踐中證據(jù)權(quán)重評價產(chǎn)生影響，比如在計算累積父權(quán)指數(shù)(cumula-tive paternity index, CPI)時需要特別考慮突變現(xiàn)象，過高過低的突變率數(shù)據(jù)都不利于得出客觀結(jié)論，因此獲得STR基因座的準(zhǔn)確突變率是非常重要的。

STR基因座突變率的實際評估計算中，往往會受抽樣群體大小的影響[5]。盡管已有研究者發(fā)表大量關(guān)于STR基因座突變率的論文，但基于較少的樣本量，其STR突變率的計算結(jié)果可能存在偏差。除了以上因素外，突變率的不同計算方法也會對STR實際突變率計算產(chǎn)生影響。在已報道的多數(shù)研究中STR突變率一般是通過直接計數(shù)法來計算的5～8]，并且將三聯(lián)體和二聯(lián)體的數(shù)據(jù)進行了合并。然而，該方法沒有考慮“隱性突變(hidden mutation) ”現(xiàn)象，因為人們普遍認(rèn)為當(dāng)發(fā)生突變時，突變步數(shù)越少越真實，但實際并非總是如此，即某些突變會被隱藏。鑒于通過三聯(lián)體和二聯(lián)體的計算得到的STR基因座突變率有一定差異，因此合并三聯(lián)體和二聯(lián)體的突變數(shù)據(jù)可能是不合理的。即，直接計數(shù)法對于STR的實際突變率的估計有一定偏差。

針對以上抽樣群體尺度與計算方法的問題，本研究采用了大量親子鑒定數(shù)據(jù)和Slooten與Ricciardi[9]的更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)挠邢尥蛔兡Ｐ陀嬎惴椒??；?8,313例已確認(rèn)親生關(guān)系的中國漢族人群親子鑒定案例，分別計算了三聯(lián)體和二聯(lián)體兩種情形的19個常染色體STR基因座實際突變率。本文詳細(xì)比較了表面突變率(直接計數(shù)法)和實際突變率(有限突變模型)，并與其他多個群體的STR突變率進行了對比分析。最后，本文還討論了影響STR突變率的幾個因素，比如突變年齡與來源、等位基因長度、基因座雜合度等。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

本研究涉及的基因座突變數(shù)據(jù)來自2009～2019年間中國北京漢族人群的常規(guī)親子鑒定案例的統(tǒng)計結(jié)果，該數(shù)據(jù)已獲得北京通達(dá)首誠司法鑒定所許可使用。所有數(shù)據(jù)均采用匿名化處理，不涉及個體相關(guān)除突變信息以外的其他STR基因座具體分型，也不涉及家系情況。本次統(tǒng)計分析的親子鑒定案例的CPI值均大于10,000，達(dá)到親子鑒定的確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)(未能確認(rèn)的案例被除外)，且突變的STR基因座已經(jīng)過多個試劑盒驗證?？傆?8,313例(78,739個體)親子鑒定數(shù)據(jù)被納入，包括22,113例三聯(lián)體(trio’s)和6200例二聯(lián)體(duo’s) (父親–孩子：2342例；母親–孩子：3858例)。該數(shù)據(jù)涉及的STR基因座包括CODIS 系統(tǒng)()和。由于有限突變模型[9]中未包含基因座的計算矯正參數(shù)，因此本研究中共包括除之外其余19個STR基因座的突變率計算。

1.2 突變率計算

在已確認(rèn)親生關(guān)系的親子鑒定案例中，當(dāng)發(fā)現(xiàn)STR等位基因違反孟德爾遺傳定律時，認(rèn)為該STR基因座發(fā)生突變事件[10]。在計算過程中，突變步數(shù)與來源的判定根據(jù)Brinkmann等[10]和Weber等[11]的描述，本研究中所有可疑的STR突變事件均再次通過同一試劑盒和其他試劑盒進行檢測，確保分型正確。所有STR基因座的三聯(lián)體和二聯(lián)體父源母源突變事件的統(tǒng)計結(jié)果見附表1。在突變率計算過程中，一方面使用直接計數(shù)法公式*=n/N計算表面突變率，其中n是觀察到的突變事件的數(shù)目，N為減數(shù)分裂的發(fā)生次數(shù)；另一方面在得到表面突變率后，通過概率矯正因子矩陣A矯正得到實際突變率(見方程(I))。其中A_{k, l}代表觀測到k步突變，實際是l步突變的概率。對于任一A_{k, l}，Slooten和Ricciardi[9]基于NFI的參考數(shù)據(jù)集(2085個體)的等位基因型頻率，隨機組合一對夫婦，模擬生成子代的基因型，其中從母親遺傳一個沒有突變的等位基因，但從父親遺傳得到一個實際有l(wèi)步突變的等位基因，即已知實際突變步數(shù)，然后通過觀察得到表面突變步數(shù)。上述過程通過計算機模擬重復(fù)100,000次，計算不同突變步數(shù)的頻率，進而估計最終突變轉(zhuǎn)移概率A_{k, l}。該模型假設(shè)：(1)當(dāng)發(fā)生不確定來源的突變時，認(rèn)為父源與母源發(fā)生的概率相同，均為0.5；(2)當(dāng)觀察到的突變事件可以同時解釋為相同的突變增加或者突變減少時，該模型方法不予區(qū)分。本文采用模型中下列矩陣方程(I)計算實際突變率。

在“方程(I) ”中，k*為表面為k步的突變率，0*為表面不發(fā)生突變的概率；k代表實際為k步的突變率，0為實際不發(fā)生突變的概率；Ak,l是表面突變步數(shù)為k，而實際步數(shù)為l的概率；*為基因座特異性表面突變率;為基因座特異性實際突變率。為了便于理解該模型，方程(Ⅱ)列出了方程(I)的展開式。以TH01為例，統(tǒng)計計算得到了表面突變率k*后，再根據(jù)Slooten和Ricciardi[9]提供的矯正矩陣A_{k, l}，可以結(jié)合方程(Ⅱ)反解出實際突變率k，其具體的計算過程見附表2。本文采用在線計算器(https://www.numberempire.com/matrixbinarycalculator. php)進行矩陣求逆。

方程(Ⅱ)

2 結(jié)果與分析

2.1 突變分析

本項研究中，在28,313例確認(rèn)的親子鑒定案例(22,113例三聯(lián)體和6200例二聯(lián)體)的20個常染色體STR基因座中共發(fā)現(xiàn)了1665個突變事件，所有基因座均觀察到突變現(xiàn)象。基于有限突變模型計算得到的三聯(lián)體和二聯(lián)體的基因座特異性實際突變率和總突變率數(shù)據(jù)顯示(表1，不包含基因座)：三聯(lián)體基因座特異性平均實際突變率范圍為0.00007700 ()～0.00459050 ()，二聯(lián)體為0.00000000 ()～0.00344850 ()；基因座具有較高的父源突變率(0.00767100)和總突變率(0.00459050)，具有較高的母源突變率(0.00237900)，與Jin等[12]基于直接計數(shù)法的研究結(jié)果一致。

同卵雙胞胎(monozygotic, MZ)是由單個精子和單個卵子結(jié)合形成受精卵后，分裂成兩個胚胎形成的，其發(fā)生率約為1/250[13]。從理論上講，同卵雙胞胎擁有相同的基因組，然而研究者在STR[14]、拷貝數(shù)變異(CNV)[15]和單核苷酸多態(tài)性(SNP)[16]中觀察到了一些差異。本次研究中，在10對MZ中發(fā)現(xiàn)了相同突變，包括7例男性和3例女性(附表3)，突變基因座為(2例)、(2例)、(2例)、、、和，且均為一步突變。在已公開發(fā)表的論文中，尚未報道同時在MZ中發(fā)現(xiàn)不一致的STR突變，但Wang等[17]報道了一對MZ中其中一個個體的基因座出現(xiàn)三等位基因模式的案例。在親子鑒定實踐中，一般較少會在同一個體觀察到多個突變。如果觀察到，其可能會干擾鑒定人得出親子關(guān)系的正確結(jié)論。在本次研究的28,313例親子鑒定案件中，共發(fā)現(xiàn)27例孩子的基因型中可觀察到2個突變的事件，發(fā)生率為0.00095363 (27/28,313，20個常染色體STR基因座) (附表4A)；同時也發(fā)現(xiàn)3例孩子的基因型中可觀察到3個突變的事件(附表4B)。在這30例的多基因座突變案例中，本研究使用了總計超過39個基因座的多個STR試劑盒對親子關(guān)系進行了確認(rèn)。

2.2 表面與實際突變率的比較

基于直接計數(shù)法和有限突變模型，計算得到每個STR基因座的表面突變率(*)與實際突變率()，三聯(lián)體的相關(guān)突變率數(shù)據(jù)見附表5，二聯(lián)體相關(guān)數(shù)據(jù)見附表6。在使用有限突變模型的矩陣計算(方程(I))中，本研究發(fā)現(xiàn)有三個負(fù)值的實際突變率，即三聯(lián)體組的和基因座的M2；二聯(lián)體組的基因座的F1(M，F(xiàn)分別代表母源和父源突變)。為了查找原因，本研究分析了和基因座在三聯(lián)體中的突變特征，發(fā)現(xiàn)母源突變中可觀察到一步和三步突變，但未觀察到兩步突變；同理，二聯(lián)體組的基因座僅在父源中觀察到兩步突變，但未觀察到一步突變。即表明，實際突變率負(fù)值可能是在某STR基因座可觀察到高步數(shù)突變，但未觀察到某個低步數(shù)突變的情況下發(fā)生的(即非連續(xù)的突變步數(shù)現(xiàn)象)。換言之，即這幾個負(fù)值可能在提示潛在低步數(shù)突變應(yīng)該會被觀察到，但實際中并沒有觀察到，這已經(jīng)超過了有限突變模型的可解釋范疇。因此在數(shù)據(jù)處理過程中，把三個負(fù)值實際突變率設(shè)為零。如圖1所示，在父源和母源突變之間有一個明顯的界限，特別是在三聯(lián)體的一側(cè)(圖1A)，這可能提示三聯(lián)體與二聯(lián)體的計算得到的STR突變率是有差異的，盡管這種差異可能來自于三聯(lián)體與二聯(lián)體本身，或者來自于樣本量的差異，但可間接說明以往直接合并三聯(lián)體與二聯(lián)體數(shù)據(jù)進行計算存在不合理之處。此外，從該圖也可發(fā)現(xiàn)在三聯(lián)體和二聯(lián)體中，和基因座的表面和實際突變率都較低。與之相反的是，和基因座在三聯(lián)體中的表面和實際突變率均較高，而和基因座在二聯(lián)體中的表面和實際突變率較高。為了進一步分析有限突變模型的校正效果，繪制了實際突變率與表面突變率比值圖(/*) (圖2)。該圖表明，除父源的和(/*≈1)和母源的基因座(/*≈1)外，其余基因座的突變率均得到了較大程度的矯正(/*>1)。就矯正程度而言，二聯(lián)體組的基因座的效應(yīng)表現(xiàn)得更為明顯(與Slooten和Ricciardi[9]的研究結(jié)果相似)，尤其是和基因座。也就是說有限突變模型通過參數(shù)矯正的方式，將更多的隱性的突變挖掘出來。然而，在親子鑒定過程中，需要計算有突變率參與的父權(quán)指數(shù)時，目前一般采用直接計數(shù)法計算得到平均STR突變率(比如男性取0.002；女性取0.001～0.0005)來進行。若為了更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)挠嬎悖刹捎萌?lián)體和二聯(lián)體的父源、母源或者STR基因座特異性突變率，當(dāng)然也可以使用本次研究基于有限突變模型計算獲得的STR基因座特異性實際突變率。從理論上講，計算單個基因座父權(quán)指數(shù)時，采用上述兩種算法得到的突變率，結(jié)果是會存在差異，但對總體的鑒定結(jié)論的影響有限。

表1 三聯(lián)體與二聯(lián)體STR基因座特異性實際突變率

“”表示實際突變率；“F”表示父源；“M”表示母源。

圖1 三聯(lián)體和二聯(lián)體表面和實際突變率熱圖

A：三聯(lián)體情形；B：二聯(lián)體情形；“*”表示表面突變率；“”表示實際突變率。

圖2 表面突變率與實際突變率比較

“A”和“B”代表三聯(lián)體組父源(F)和母源(M)的/*比值；“C”和“D”分別代表二聯(lián)體組父源(F)和母源(M)的/*比值；空白處表示比式的分母為零的情況。

2.3 三聯(lián)體和二聯(lián)體組突變率的比較

在以往基于直接計數(shù)法研究中，一般將三聯(lián)體和二聯(lián)體組的數(shù)據(jù)進行合并計算突變率。然而，三聯(lián)體和二聯(lián)體得到的突變率水平是有一定差異，其在2.1和2.2中已進行部分闡述。在大多數(shù)STR基因座中，三聯(lián)體父源的實際突變率值大于二聯(lián)體的父源相關(guān)值(圖3，綠色>黑色)；三聯(lián)體母源的實際突變率值大于二聯(lián)體的母源相關(guān)值(圖3，粉色>藍(lán)色)；它們的比值表現(xiàn)出相似的規(guī)律(圖3)，特別是在基因座。與此同時，本研究也發(fā)現(xiàn)存在相反趨勢的基因座，如三聯(lián)體組的、和二聯(lián)體組的等，因此將三聯(lián)體和二聯(lián)體的數(shù)據(jù)合并是不合理的，它們之間的差異是存在且不宜忽略的。

2.4 父源和母源突變率的比較

在1665個突變事件中，共觀察到1178例父源突變和293例母源突變事件，同時有194例突變來源不明(父源或母源)，其中父源突變占多數(shù)，為70.75% (圖4A)。在三聯(lián)體組中，總F為0.06405550，M為0.01937639 (表1)；二聯(lián)體中，總F為0.05146300，M為0.01220500 (表1)。從以上數(shù)據(jù)可以得知，父源突變率一般較母源突變率高，在三聯(lián)體和二聯(lián)體組中分別約為3.3倍和4.2倍，其與以往的研究結(jié)果一致[11,12]。Jónsson等[18]對冰島1548個三聯(lián)體進行的新生突變(de novo mutations, DNMs)研究也表明父源的突變數(shù)量約是母源的4倍，這也側(cè)面反映了本次研究的結(jié)果。本研究還比較了不同突變來源的基因座特異性突變率(圖5)。如圖5A顯示，三聯(lián)體中絕大多數(shù)基因座不同突變來源計算得到的突變率具有一定差異性，除和基因座外，父源突變率是母源突變率2倍以上。而二聯(lián)體組也顯示了相似的趨勢(圖5B)。這可能是男性與女性形成配子時經(jīng)歷的細(xì)胞分裂次數(shù)不同，而男性需要產(chǎn)生更多的配子的緣故[10]?？梢灶A(yù)知，使用突變來源特異性基因座突變率將有助于親子關(guān)系等法醫(yī)學(xué)鑒定得出的更加客觀而準(zhǔn)確結(jié)論。另外，為了說明不同突變來源的年齡范圍，本研究制作了父源(圖4B)和母源(圖4C)突變年齡的扇形圖，從中可以看到父源突變的年齡范圍比母源突變的年齡范圍更廣，這可能是由于男性在較長時間內(nèi)可以保持一定的生殖能力，而女性不可以的原因。

圖3 三聯(lián)體和二聯(lián)體中Fμ、Mμ及其比值的比較

“trio’s”表示三聯(lián)體組；“duo’s”表示二聯(lián)體組；空白處表示比式的分母為零的情況。

圖4 本次研究中突變事件來源、年齡和步數(shù)的比較

A：突變來源分布；B：父源突變年齡分布；C：母源突變年齡分布；D：突變步數(shù)分布。

2.5 突變步長與突變方向分析

在所有的突變事件中，共觀察到1614個一步突變、34個兩步突變、8個三步突變和9個非整步突變。一步突變占總突變事件的96.94%，是主要的突變類型，逐步突變模型(stepwise mutation model, SMM)可以解釋一步突變?yōu)橹鞯默F(xiàn)象[19,20]。在其他非一步突變中，兩步突變占2.04%，三步突變占0.48%，而非整步突變占0.54% (圖4D)。發(fā)生非整步突變的基因座分別為：(3例)、(2例)、、、和；突變來源為父親的6例，母親的1例，未能確定突變來源的2例；非整步的突變方向，其中7例突變減少，1例突變增加，另有1例不能確定突變方向；關(guān)于非整步突變的步數(shù)，0.1、0.2、0.3步均有觀察到，其中有5例含有0.2步突變，2例有0.3步突變，1例有0.1步突變，另有1例為0.3或者0.1步突變。就本研究觀察到的9例非整步突變而言，突變減少和包含0.2步突變是占多數(shù)的，詳細(xì)信息展現(xiàn)在附表7中。為了進一步分析有限突變模型對于STR基因座等位基因不同突變步數(shù)的突變率影響，本研究計算了三聯(lián)體中發(fā)生一步突變與兩步突變的比值(圖6)。在父源(圖6A)中，1*/2*的值普遍大于1/2，特別是在基因座(本次研究：1*/2*≈104；1/2≈73)，這表明由于有限突變計算模型的使用，1/2之間的差異正在減小。這些規(guī)律與Slooten與Ricciardi[9]的研究相似(1*/2*≈75；1/2≈58)，也就是說更多的高步數(shù)隱性突變被挖掘出來。在母源(圖6B)基本上也顯示了這一規(guī)律，但發(fā)現(xiàn)了具有相反趨勢的基因座，如、和，根據(jù)該模型作者的解釋[9]，這可能是由于模型本身不完美的原因造成的。

盡管有限突變計算模型中不考慮突變方向(突變減少/增加)，但本研究仍然統(tǒng)計了等位基因減少和增加的分布情況。在1665次突變事件中(附表8)，總計有706次突變減少(mutation loss)，703次突變增加(mutation gain)，256次為不確定突變方向或者分組；突變減少與增加(loss/gain)之比約為1∶1，與Lan等[21]的研究相似。Brinkmann等[10]報道認(rèn)為突變的發(fā)生與等位基因的長度存在一定關(guān)聯(lián)，長的等位基因比短的等位基因更易于發(fā)生突變；Shao等[5]認(rèn)為較長的等位基因傾向于發(fā)生突變減少事件，而短的等位基因則更傾向于發(fā)生突變增加事件。為了探究等位基因長度與突變方向之間的關(guān)系，參照Ge等[22]和Xu等[23]的方法，將每個STR基因座的等位基因根據(jù)長度分為三組，即較短(short group)、中等(medium group)、較長(long group)等位基因組，詳細(xì)的統(tǒng)計數(shù)據(jù)見附表8。從表中可計算得知在以上三個分組中，總的突變次數(shù)分別為105、1042、397，其中中等等位基因長度組發(fā)生的突變事件最多(約為67.49%)，較長等位基因長度組次之(約為25.71%)，而較短等位基因長度組最少(約為6.80%)，也即中等及較長等位基因更易于發(fā)生突變，較短的等位基因發(fā)生突變較少，這與Xu等[23]的研究結(jié)論一致；較短等位基因組突變減少與增加(loss/gain)的比值約為0.49 (<1)，中等組為0.86，較長組為1.72 (>1)，本研究結(jié)果也表現(xiàn)出等位基因“短變長，長變短”的規(guī)律，這也得到Shao等[5]、Ge等[22]、Xu等[23]、Dupuy等[24]的支持，其可能與STR的序列結(jié)構(gòu)有關(guān)。

圖5 不同突變來源的基因座特異性突變率比較

A：三聯(lián)體情形；B：二聯(lián)體情形；空白處表示比式的分母為零的情況。

圖6 三聯(lián)體父源與母源的突變步長分析

A：父源情形；B：母源情形；空白處表示比式的分母為零的情況。

2.6 雜合度與實際突變率的關(guān)系

一般認(rèn)為，雜合度高的基因座其突變率也較高，也即突變率高可能是基因座雜合度高的一個原因。據(jù)此根據(jù)已有文獻報道的雜合度數(shù)據(jù)[25]，分析了每個STR基因座的雜合度和實際突變率的關(guān)系，使用Origin軟件繪制線性擬合圖(圖7)，Pearson?s= 0.68454。結(jié)果也相似地表明，雜合度較低的STR基因座突變率普遍較低，如、基因座，這與前人的研究相一致[12]。

3 討論

不同的突變率計算方法結(jié)果可能存在潛在的偏差，比如傳統(tǒng)的直接計數(shù)法在處理突變數(shù)據(jù)時未考慮到“隱性突變”現(xiàn)象[26,27]。此處以兩個確認(rèn)的三聯(lián)體親子鑒定為例進行說明(下文“a”為正整數(shù))。案例一：某STR基因座母親的分型是M=(a, a+1)，孩子是C=(a, a+1)，父親是F=(a–1, a+1)，假設(shè)真實的遺傳情況為孩子C的“a+1”來自母親M的“a+1”，“a”來自父親F的“a–1”或者“a+1”一步突變后的“a”，即實際發(fā)生一步突變。從表面上看，可能會認(rèn)為孩子C的“a+1”遺傳自父親F的“a+1”,而“a”遺傳自母親M的“a”，此時表面上會認(rèn)為沒有突變發(fā)生，即“突變發(fā)生有無認(rèn)識偏差”型隱性突變(Type Ⅰ型)；案例二：某STR基因座母親的分型是M=(a+1, a+1)，孩子是C=(a, a–1)，父親是F=(a, a–1)，假設(shè)真實遺傳情況為孩子C的“a–1”來自母親M的“a+1”兩步突變后的“a–1”，“a”來自父親F的“a”，即實際發(fā)生兩步突變。從表面上看，可能會認(rèn)為孩子C的“a–1”遺傳自父親F的“a–1”，“a”遺傳自母親M的“a+1”一步突變后的“a”，此時表面上會認(rèn)為發(fā)生一步突變，因為當(dāng)不知道突變真相時，一般判斷為較短的突變步數(shù)，即“真實突變步數(shù)認(rèn)識偏差”型隱性突變(Type Ⅱ型)。類似地，隱性突變也可以出現(xiàn)在二聯(lián)體中。在上述案例中，表面觀察到的突變被定義為表面突變(apparent mutation, ApM)，而不可見的真實突變被定義為實際突變(actual mutation, AcM)。因此，如果不考慮隱性突變(比如直接計數(shù)法)，突變率可能就會被低估。盡管研究者無法直接從表面的STR分型突變現(xiàn)象中洞察真實的突變，但Slooten和Ricciardi[9]通過突變模擬的方式研究了該隱性突變現(xiàn)象，并提供了可接近真實突變率的計算模型和矯正參數(shù)。該模型根據(jù)突變的等位基因是否超過STR等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)品(ladder)的范圍L，可分為有限突變模型(restricted mutation model)和無限突變模型(unrestricted mutation model)，而真實的生物學(xué)過程可能介于這兩個模型之間。當(dāng)不知道突變的等位基因是否超過Ladder時，無限突變模型可能是合適的。然而，基于大量數(shù)據(jù)研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)[9]，突變的等位基因不包括在Ladder中是一種非常少見的現(xiàn)象，本次研究的數(shù)據(jù)也證明這一點。綜合上述，鑒于使用簡單的有限突變模型是具有一定合理性的，本研究擬采用該模型計算實際STR突變率。

圖7 19個常染色體STR基因座雜合度與實際突變率的關(guān)系

基于以上有限突變模型計算獲得的STR基因座實際突變率，本研究一方面為了觀察其是否有時間差異，收集了Yan等[28]于2006年報道的與本研究具有相同來源的北京漢族突變率數(shù)據(jù)，這組數(shù)據(jù)調(diào)查了6532例親子鑒定案例中的19,754個樣本的17個常用STR基因座特異性突變率, 這些基因座均包含在本次研究中；另一方面為了觀察本研究的北京漢族與中國其他漢族人群突變率的地域差異，收集了中國其他地區(qū)或省(華北、華東、華南地區(qū)和河南、上海、貴州、河北、云南、福建、廣東等省)漢族群體的突變率數(shù)據(jù)(附表9)。如各基因座突變率比較的散點圖所示(圖8)，在時間變化方面：共享的17個STR基因座中，除和外，其余13個基因座的突變率在14年間中增幅較大(紅色方框與黑色圓點)，尤其是和的突變率增加將近一倍；在地域變化方面，不同漢族群體間的STR基因座特異性突變率具有一定差異，特別是在和基因座，這些差異可能來自于多個地域來源樣本的遺傳結(jié)構(gòu)不同[29,30]，或是使用群體樣本量不同，或使用的計算模型方法不同。

親子鑒定實踐中，有時可能遇到假突變現(xiàn)象(fake mutation)，其應(yīng)引起足夠的重視。例如，本次研究中在一例確認(rèn)的三聯(lián)體親子鑒定中基因座發(fā)現(xiàn)其基因型不符合遺傳規(guī)律的現(xiàn)象，稱之為“假四步突變(fake four-steps mutation) ”：假設(shè)父AF=8，母親M=12和孩子C=8 (圖9)。當(dāng)使用四個STR擴增試劑盒(PowerPlex?21 (Promega，美國)、MicroreaderTM21 (閱微基因，北京)、MicroreaderTM23sp-B (閱微基因，北京)、AGCU 17+1 system (中德美聯(lián)，無錫))確認(rèn)基因型后，得到相同的結(jié)果。起初，懷疑母親和孩子之間可能發(fā)生了四步突變，即母親的等位基因“12”突變?yōu)椤?”。為了進一步證實這個猜想，首先使用ForenSeq DNA Signature Prep Kit (Verogen, 美國)在MiSeq FGx儀器(Illumina，美國)中進行測序，并使用ForenSeq通用分析軟件(Verogen，美國)分析原始數(shù)據(jù)。測序結(jié)果顯示(圖9)，母親的等位基因“8”發(fā)生了丟失，其序列與孩子的等位基因“8”是一致的。為了繼續(xù)尋找母親等位基因丟失的原因，使用primer5軟件設(shè)計了基因座的引物(F：TGGAAGCTGCATAGAC；R：ACTCCATACAAATGCAAGAGA)，并進行了克隆測序(圖9)。如紅色方框所示(圖9)，母親的等位基因“8”的核心區(qū)上游第17 bp處發(fā)生單堿基突變，由正常的“C”突變?yōu)椤癟”。以上研究表明，基因座引物結(jié)合區(qū)的突變可能是多個試劑盒未能成功擴增出母親等位基因“8”的原因。實際中，真正的四步突變是非常少見的，當(dāng)遇到可疑的四步突變時，測序有時是很必要的。

圖8 中國10個不同地區(qū)或省漢族人群突變率比較

圖9 基于三種方法對D13S317基因座的測序結(jié)果

本研究在28,313例確認(rèn)的親子鑒定案例中，共發(fā)現(xiàn)1665個突變事件?；谝陨贤蛔償?shù)據(jù)和有限突變模型，分別計算了三聯(lián)體和二聯(lián)體案例中的父源與母源的19個常染色體STR基因座的特異性實際突變率。與直接計數(shù)法計算突變率相比，本次的計算結(jié)果揭示了更多的隱性突變現(xiàn)象，因此獲得的突變率數(shù)值理論上更加接近真實情況。本研究不僅可為中國法醫(yī)DNA數(shù)據(jù)庫和群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也對開展法醫(yī)學(xué)個體識別、親權(quán)鑒定和遺傳學(xué)研究具有重要的意義。

附加材料詳見文章電子版www.chinagene.cn。

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Actual mutational research of 19 autosomal STRs based on restricted mutation model and big data

Zhiyong Liu2, He Ren3, Chong Chen4, Jingjing Zhang5, Xiaomeng Zhang1, Yan Shi4, Linyu Shi1, Ying Chen4, Feng Cheng1, Li Jia4, Man Chen6, Qingwei Fan7, Jiarong Zhang1, Wanting Li1, Mengchun Wang1, Zilin Ren8, Yacheng Liu4, Ming Ni8, Hongyu Sun2, Jiangwei Yan1

Short tandem repeat (STR) markers have been widely used in forensic paternity testing and individual identification, but the STR mutation might impact on the forensic result interpretation. Importantly, the STR mutation rate was underestimated due to ignoring the “hidden” mutation phenomenon in most similar studies. Considering this, we useSlooten and Ricciardi’s restricted mutation model based on big data to obtain more accurate mutation rates for each marker. In this paper, the mutations of 20 autosomal STRs loci (and; The restricted model does not include the correction factor of, this paper calculates remaining 19 STR loci mutation rates) were investigated in 28,313 (Total: 78,739 individuals) confirmed parentage-testing cases in Chinese Han population. As a result, total 1665 mutations were found in all loci, including 1614 one-steps, 34 two-steps, 8 three-steps, and 9 nonintegral mutations. The loci-specific average mutation rates ranged from 0.00007700 () to0.00459050 () in trio’s and 0.00000000 () to 0.00344850 () in duo’s. We analyzed the relationship between mutation rates of the apparent and actual, the trio’s and duo’s, the paternal and maternal,respectively. The results demonstrated that the actual mutation rates are more than the apparent mostly, and the values of1*/2*(apparent) are also greater than1/2 (actual) commonly (1*,1;2*,2 are the mutation rates of one-step and two-step). Therefore, the “hidden” mutations are identified. In addition, the mutations rates of trio’s and duo’s, the paternal and maternal, exhibit significant difference. Next, those mutation data are used to do a comparison with the studies of other Han populations in China,which present the temporal and regional disparities. Due to the large sample size, some rare mutation events, such as monozygotic (MZ) mutation and “fake four-step mutation”, are also reported in this study. In conclusion, the estimation values of actual mutations are obtained based on big data, they can not only provide basic data for the Chinese forensic DNA and population genetics databases, but also have important significance for the development of forensic individual identification, paternity testing and genetics research.

autosomal STR; restricted mutation model; parentage testing; Chinese Han population; mutational analysis

2021-06-02;

2021-08-18

國家自然基金重點項目(編號：82030058)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 82030058)]

劉志勇，博士研究生，研究方向：法醫(yī)遺傳學(xué)。E-mail: liuzhy255@mail2.sysu.edu.cn

任賀，碩士，副教授，研究方向：法醫(yī)遺傳學(xué)。E-mail: snoopy_fr@sohu.com

劉志勇和任賀并列第一作者。

嚴(yán)江偉，博士，教授，研究方向：法醫(yī)基因組學(xué)。E-mail: yanjw@sxmu.edu.cn

10.16288/j.yczz.21-197

2021/8/31 17:30:44

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20210831.1400.001.html

(責(zé)任編委: 朱波峰)