劉家燕，王 鑫，李康然，孔祥玉，秦 莉，曹志嬌

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院急診科，河北 邯鄲 056001)

百草枯是高效、季胺類除草劑。我國是一個農(nóng)業(yè)大國，百草枯在我國廣泛應(yīng)用，因此中毒患者數(shù)量也呈逐年上升趨勢。百草枯進(jìn)入體內(nèi)，造成多器官功能衰竭，病情危重，主要損傷肺、肝、腎等重要臟器，患者病死率高，而且無特效解毒藥物[1]。目前百草枯中毒的病理過程還不十分清楚，雖然前期研究取得一些進(jìn)展，但其分子機(jī)制尚未闡明。已有研究表明，百草枯中毒所導(dǎo)致的臟器損傷與激活的炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素8(interleukin-8，IL-8)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)以及T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+免疫調(diào)節(jié)紊亂緊密相關(guān)[2]。烏司他丁是從尿中提取的一種糖蛋白，在新近的研究中發(fā)現(xiàn)，它具有抑制蛋白酶的活性、抗氧化、阻止炎性細(xì)胞因子的釋放等作用[3]。本研究選取邯鄲市中心醫(yī)院急診科收治的急性口服百草枯中毒患者80例作為研究對象，探討烏司他丁治療百草枯患者的臨床療效以及對炎性細(xì)胞因子和T淋巴細(xì)胞亞群的影響，為臨床提高救治率、降低病死率提供理論參考。現(xiàn)將研究成果報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年1月—2019年12月邯鄲市中心醫(yī)院收治的百草枯中毒患者80例，均符合《急性百草枯中毒診治專家共識(2013)》診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，所有患者年齡大于18歲，都是口服中毒，服毒量為5～100 mL,患者的血和尿中均檢測出百草枯成分，從服毒到來醫(yī)院就診時間小于6 h。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往有嚴(yán)重的基礎(chǔ)疾病，如心、腦血管系統(tǒng)疾病、肝、腎功能障礙，嚴(yán)重貧血，惡性腫瘤，生活不能自理者?；颊吆瀸僦橥鈺栽竻⒓釉搶嶒?。將納入研究的患者按照就診先后順序分為對照組40例、治療組40例進(jìn)行臨床指標(biāo)比較，在兩組中能夠存活14 d的患者(對照組21例，治療組30例)再進(jìn)行血液生化、炎性細(xì)胞因子、T巴細(xì)胞亞群的比較。對照組：男性14例，女性26例，年齡20～69歲，平均(46.50±5.53)歲；治療組：男性16例，女性24例，年齡25～63歲，平均(44.46±5.61)歲。2組患者一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

本研究獲得邯鄲市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2治療方法 2組患者就診后均給予基礎(chǔ)治療。①阻止毒物吸收：立即給予清水洗胃，大約需要5 L以上，直至洗胃液清亮。之后20%甘露醇250 mL、硫酸鎂粉40 g口服導(dǎo)瀉，活性炭100 g分次口服；②血液凈化治療：12 h/次，共進(jìn)行6次。每次治療包括2 h血液灌流(HA-330灌流器由健帆生物科技公司提供)和4 h血液透析；③抑制炎癥反應(yīng)：激素甲潑尼龍10～15 mg·kg-1·d-1聯(lián)合免疫抑制劑環(huán)磷酰胺5～10 mg·kg-1·d-1沖擊，依據(jù)病情逐漸減量。④積極抗氧化治療：口服褪黑素、維生素E，靜脈應(yīng)用谷胱甘肽、大量維生素C、氨溴索、丹參等⑤其他輔助治療：普萘洛爾、當(dāng)歸、川芎、連翹等?？谇患笆车烙凶苽幕颊呖诜祻?fù)新液、金因肽，對于頻繁嘔吐的給予胃復(fù)安、質(zhì)子泵抑制劑等治療，重癥中毒患者，往往有合并癥存在，還應(yīng)積極預(yù)防感染。

治療組在上述治療的基礎(chǔ)上，加用烏司他丁(又名：天普洛安，廣東天普生化醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字H20045327，規(guī)格：10萬U/支)治療，30萬U/次，2次/d靜脈滴注，療程14 d。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1臨床指標(biāo) 觀察14 d 2組患者急性肺損傷(acute lung injury，ALI)/呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)的發(fā)生率(%)、ICU住院時間(d)、存活率(%)、死亡患者存活時間(d)。

1.3.2血液生化及炎性因子指標(biāo) 2組患者在治療前、治療7 d、治療14 d從肘靜脈抽取血液10 mL，在4 ℃條件下高速(4 000 r/min)離心20 min，提取上清液，保存于日本三洋株式會社生產(chǎn)的超低溫冰箱(-80 ℃)待檢。采用日本東芝TOSHIBA-40FR全自動生化分析儀檢測肝腎功能指標(biāo)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)，尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)，肌酐(creatinine，Cr)。采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血液中IL-8、TNF-α、MMP-9的含量，試劑盒由武漢博士德公司提供，操作步驟(包被、洗滌、封閉、加入一抗、二抗、顯色)嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，采用西班牙Cri-Tzw kEnzyme熒光酶標(biāo)儀測量450 nm光波處標(biāo)本的OD值。根據(jù)吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算IL-8、TNF-α、MMP-9的含量。

1.3.3T淋巴細(xì)胞亞群檢測 采用SAP酶標(biāo)法檢測2組患者治療前、治療7 d、治療14 d的血液中T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+百分比。在血液標(biāo)本中加入一抗工作液，在室溫孵育20 min,用PBS液進(jìn)行反復(fù)沖洗,加入生物素標(biāo)記的二抗S-A/AP試劑盒(由美國ZYMED公司生產(chǎn))，然后加入堿磷酶標(biāo)記的鏈霉卵白素形成復(fù)合物，最后滴入顯色劑，借助堿磷酶使底物顯色。使用默賽飛EVOS M7000顯微成像系統(tǒng)觀察帶有紅色標(biāo)記的陽性細(xì)胞，計算出陽性細(xì)胞百分比。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計數(shù)資料采用χ2檢驗；計量資料采用獨立樣本t檢驗和重復(fù)測量的方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.12組患者臨床指標(biāo)比較 治療組患者ALI/ARDS的發(fā)生率、ICU的住院時間顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；治療組的存活例數(shù)和死亡患者存活時間顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組臨床指標(biāo)比較

2.22組患者血液生化指標(biāo)比較 在治療后，2組患者ALT、AST、BUN、Cr均有不同程度的下降，2組在組間、時點間、組間·時點間交互作差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表2 2組血液生化指標(biāo)比較

2.3TNF-α、MMP-9含量的變化 經(jīng)烏司他丁治療后，2組患者中IL-8、TNF-α、MMP-9的含量均降低，2組在組間、時點間、組間·時點間交互作差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

表3 2組患者炎性細(xì)胞因子含量比較

2.4兩組患者血液中T淋巴細(xì)胞亞群比較 治療后，外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD4+/CD8+含量較治療前升高(P<0.05)，CD8+含量反而下降(P<0.05)；與對照組比較，治療組在應(yīng)用烏司他丁治療后，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+升高更加顯著(P<0.05)，CD8+含量下降更為明顯(P<0.05)。2組在組間、時點間、組間·時點間交互作差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。見表4。

表4 兩組患者血液中T淋巴細(xì)胞亞群水平比較

3 討 論

近年來，許多研究發(fā)現(xiàn)臟器損傷與炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的免疫紊亂息息相關(guān)，因此，在探討百草枯中毒病理過程中,炎癥反應(yīng)及其免疫紊亂成為人們研究的熱點問題。百草枯可以經(jīng)皮膚、呼吸道、口服等多種途徑導(dǎo)致中毒，但口服是主要途徑。基礎(chǔ)研究和動物實驗均表明，進(jìn)入體內(nèi)的百草枯作為電子載體，與氧結(jié)合生成有活性的超氧陰離子，在過氧化物歧化酶的作用下進(jìn)一步生成H2O2，H2O2經(jīng)過氧化還原反應(yīng)生成高活性的氧自由基，從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生級聯(lián)放大的炎癥反應(yīng)并釋放大量炎性細(xì)胞因子，導(dǎo)致免疫功能紊亂，引起細(xì)胞損傷、凋亡，破壞臟器功能[5]。烏司他丁是從尿液中提取的一種蛋白酶抑制劑，相對分子質(zhì)量6 700 000，143個氨基酸組成，它對纖溶酶、α-糜蛋白酶、絲氨酸酶、胰蛋白酶等多種酶有抑制作用，同時還可以穩(wěn)定溶酶體膜，阻止溶酶體酶的活化，減少炎性細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等的聚集，清除氧自由基、抑制炎性介質(zhì)的釋放，調(diào)節(jié)免疫功能[6]。我國雖然已經(jīng)對百草枯中毒進(jìn)行了深入的研究，但烏司他丁對其的治療暫無確切的臨床結(jié)論。本研究將烏司他丁注射液用于百草枯的治療，明顯降低了中毒患者ALL/ARDS的發(fā)生率，提高了存活率，縮短了在ICU內(nèi)的住院時間，延長了死亡患者的存活時間，血液生化指標(biāo)ALT、AST、Cr、BUN也明顯下降，改善了中毒患者的臨床及生化指標(biāo)。

研究表明，炎癥反應(yīng)及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子在百草枯中毒病理過程中起著極其重要的作用[7]。炎性細(xì)胞因子IL-8是由上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的[8]。在炎癥反應(yīng)中具有很強(qiáng)的趨化作用，它可以趨化并激活中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞，這些被激活的炎性細(xì)胞進(jìn)一步合成和釋放TNF-α、MMP-9等多種炎性細(xì)胞因子，參與炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致組織細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)的損傷[9]。TNF-α作為炎癥反應(yīng)的早期細(xì)胞因子，促使各種免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)，它主要由活化的巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生[10]。具有啟動、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的作用。目前研究證明，在血管表皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腹腔間皮細(xì)胞等多種細(xì)胞表面存在TNF-α受體，當(dāng)TNF-α與受體結(jié)合后，促使細(xì)胞產(chǎn)生和分泌MMP-9、IL-1、IL-6、IL-8等細(xì)胞因子，起到放大炎癥反應(yīng)的效應(yīng)。基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9是一種糖蛋白，又稱為明膠酶B，它是由單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞分泌的，以膠原蛋白、彈性蛋白、Ⅳ型膠原為底物，降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，破壞組織結(jié)構(gòu)[11]。IL-8、TNF-α、MMP-9在炎癥反應(yīng)中相互協(xié)同、相互輔助，形成正反饋效應(yīng)。實驗證明，MMP-9基因序列的啟動子存在TNF-α的結(jié)合位點，TNF-α與之結(jié)合，促進(jìn)MMP-9的基因表達(dá)，當(dāng)該結(jié)合位點被阻斷后，TNF-α上調(diào)MMP-9的作用也被抑制[12]。MMP-9不僅接受TNF-α、IL-8的調(diào)節(jié)，還可以協(xié)助相關(guān)轉(zhuǎn)化酶，使TNF-α的前體轉(zhuǎn)化為有活性的TNF-α。另外，MMP-9還通過裂解IL-8氨基末端特異位點，使IL-8趨化活性較原來增加30倍。已有研究表明，許多疾病的病理學(xué)改變?nèi)缒摱景Y、多臟器功能衰竭、急性呼吸窘迫綜合征與炎性細(xì)胞因子IL-8、TNF-α、MMP-9水平增高密切相關(guān)[13]。本研究結(jié)果顯示，在百草枯中毒治療前的各個時間點，血漿中炎性細(xì)胞因子IL-8、TNF-α、MMP-9含量均呈高水平表達(dá)，提示在百草枯中毒中，IL-8、TNF-α、MMP-9起重要作用，經(jīng)過烏司他丁治療后，IL-8、TNF-α、MMP-9均有不同程度的下降，與治療前比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明烏司他丁能夠抑制百草枯中毒導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，減少炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，對百草枯中毒的救治有積極的作用。

近期研究發(fā)展，多種疾病的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體的免疫功能紊亂密切相關(guān)[14]。T淋巴細(xì)胞亞群是反映機(jī)體免疫功能狀態(tài)和平衡情況的重要指標(biāo)。在眾多實驗中發(fā)現(xiàn)，通過對T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+的分析，可以判斷疾病嚴(yán)重程度[15]。CD3+是免疫系統(tǒng)中最為重要的組成部份，它既參與細(xì)胞免疫，又調(diào)控體液免疫。CD4+屬于輔助/誘導(dǎo)性T淋巴細(xì)胞，通過調(diào)節(jié)TNF-β、IL-2、IFN-γ細(xì)胞因子和IL-4、5、6、10的分泌輔助B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體，從而調(diào)控體液免疫。CD8+屬于抑制/細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，能夠識別靶細(xì)胞，誘導(dǎo)靶細(xì)胞溶解凋亡。正常狀態(tài)下，T淋巴細(xì)胞每個亞群的數(shù)量處于動態(tài)平衡，它們之間既互相協(xié)作又相互制約，維持機(jī)體免疫功能的穩(wěn)定[16]。當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)病理改變時，T淋巴細(xì)胞總數(shù)CD3+、CD4+、CD8+以及它們的比值發(fā)生變化，免疫功能受損，調(diào)節(jié)發(fā)生紊亂。因此，觀察T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)目的變化，成為研究百草枯中毒患者免疫功能的簡便可靠方法。本研究結(jié)果顯示，在百草枯中毒后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值均降低，CD8+含量增高，提示T淋巴細(xì)胞功能處于紊亂狀態(tài)，機(jī)體免疫受到抑制。在應(yīng)用烏司他丁治療后，治療組患者的CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值均升高，CD8+含量降低，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明烏司他丁可以糾正百草枯中毒患者T淋巴細(xì)胞亞群失調(diào)的狀態(tài)，改善組織細(xì)胞免疫功能紊亂，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活性，提高機(jī)體免疫力。因此，烏司他丁對機(jī)體T淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用可以為百草枯中毒治療提供新的思路。

綜上所述，通過研究烏司他丁對百草枯中毒患者炎性細(xì)胞因子及T淋巴細(xì)胞亞群的影響，不僅闡明了百草枯中毒的病理機(jī)制，而且也為烏司他丁治療百草枯中毒奠定了理論基礎(chǔ)。實驗表明，烏司他丁抑制了炎性因子的釋放，調(diào)節(jié)了機(jī)體的免疫功能，改善了中毒患者內(nèi)環(huán)境的平衡狀態(tài)，對百草枯中毒的治療發(fā)揮了積極的作用，值得推廣。