文 霞, 張淑瑤, 陳漪汶, 謝小保

廣東省科學(xué)院微生物研究所，廣東省微生物分析檢測中心，華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510070

隨著人類生活水平的提高，化妝品已逐漸成為人們生活必需品，化妝品中各種營養(yǎng)元素給微生物提供了良好的生存環(huán)境，金黃色葡萄球菌是葡萄球菌屬中對(duì)人類致病力最強(qiáng)的一種，其亦存在于正常人的皮膚表面，與其他微生物組成皮膚表面微生態(tài)系統(tǒng)，一旦人們使用了污染有金黃色葡萄球菌的化妝品，勢必會(huì)導(dǎo)致皮膚微生態(tài)失衡，繼而發(fā)生炎癥、化膿等人體局部化膿性病灶，如果皮膚有破損，甚至可導(dǎo)致敗血癥，另外，金黃色葡萄球菌還可以感染呼吸道，毒害消化道，引起相應(yīng)系統(tǒng)的疾病，因此，國內(nèi)外有關(guān)化妝品的衛(wèi)生要求文件，包括《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)中都將金黃色葡萄球菌列為化妝品常規(guī)檢測項(xiàng)目，要求不得檢出。

在檢測手段上，目前國內(nèi)外檢測機(jī)構(gòu)仍主要采用傳統(tǒng)的方法對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測，整個(gè)過程一般需要3 d～5 d，且操作煩瑣，已不能滿足微生物快速準(zhǔn)確檢測的現(xiàn)實(shí)需要，而且有可能存在可見不可培養(yǎng)(viable but nonculturable，VBNC)的細(xì)菌。因此，迫切需要建立新的快速檢測技術(shù)和方法。近幾十年來，基于分子技術(shù)的PCR方法已成為解決這些問題的最有前景的快速檢測方法之一[1,2]。

PCR技術(shù)以敏感、特異、簡便和快速等優(yōu)點(diǎn)被越來越多地應(yīng)用，研究表明 PCR 鑒定能準(zhǔn)確快速的鑒定金黃色葡萄球菌[3,4]。ALI R等[5]研究指出 PCR是鑒定金黃色葡萄球菌非常好的標(biāo)準(zhǔn)。目前, 關(guān)于金黃色葡萄球菌鑒定方法準(zhǔn)確性的研究已有較多報(bào)道, 而對(duì)于各種鑒定方法在檢驗(yàn)過程中的實(shí)際應(yīng)用研究較少。其中多重PCR方法以準(zhǔn)確、高效的特點(diǎn)廣受研究者關(guān)注。金黃色葡萄球菌會(huì)產(chǎn)生耐熱核酸酶, 耐熱核酸酶編碼基因(nuc基因)不僅為金葡菌所特有, 而且在不同菌株之間具有較高保守性，廖光華等[6]以隨機(jī)挑選的 50 株菌為研究對(duì)象, 建立了一種基于基因進(jìn)行PCR 檢測金黃色葡萄球菌的方法。另外, 研究顯示纖維蛋白原結(jié)合蛋白基因(clfA)存在于所有金黃色葡萄球菌的染色體中[7]，同時(shí),SmaI序列為其他葡萄球菌缺失而金黃色葡萄球菌特有的序列[8]。已有研究證實(shí)這三種基因和序列組合的多重PCR可用于食品中金黃色葡萄球菌的檢測[9]。

另外，合適的增菌培養(yǎng)液是提高菌落檢測效率的有效手段，本研究對(duì)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)中的SCDLP增菌液進(jìn)行了優(yōu)化，并結(jié)合三重PCR方法快速、準(zhǔn)確地檢測化妝品中污染的金黃色葡萄球菌，旨在為化妝品中金黃色葡萄球菌的快速檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

試劑：酪蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉膏(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、NaCl、葡萄糖、酵母提取物、丙酮酸鈉、組氨酸、硫基乙醇酸鈉、卵磷脂、吐溫-80和瓊脂糖(廣州碩恒生物科技有限公司)；2×EasyTaq? PCR SuperMix(北京全式金生物技術(shù)有限公司)、DNA Maker(北京全式金生物技術(shù)有限公司)、細(xì)菌 DNA 提取試劑盒(廣東 Magen 美基生物)、瓊脂糖和營養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱生物技術(shù)有限公司)，凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Red)。

儀器：PCR儀，DNP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱，廣州環(huán)凱微生物科技有限公司；DKB-501A型恒溫水浴鍋，廣州環(huán)凱微生物科技有限公司；DYY-6D型電泳儀，北京六一生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株和引物

實(shí)驗(yàn)菌株：大腸桿菌Escherichiacoli(ATCC 8039)、銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa(ATCC 9027)、金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus(ATCC 6538、ATCC6538P、CMCC26003)，標(biāo)準(zhǔn)菌株購于廣東省科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心；沃氏葡萄球菌Staphylococcuswarneri、腐生葡萄球菌Staphylococcussaprophytics、弗氏檸檬酸桿菌Citrobacterfreundi，惡臭假單胞菌Pseudomonasputida，肺炎克雷伯氏菌Klebsiellapneumoniae，粘質(zhì)沙雷氏菌Serratiamarcescens，污染菌株來源于受污染的化妝品樣品。

引物合成：以SmaI限制性酶切片斷特異序列、以耐熱核酸酶基因nuc、纖維蛋白原結(jié)合蛋白基因clfA為靶基因，利用Primer5.0設(shè)計(jì)引物，委托北京六合華大基因科技有限公司廣州分公司合成, 其序列見表1。

表1 引物序列

1.3 實(shí)驗(yàn)樣品

實(shí)驗(yàn)樣品來源于市售的保濕乳、化妝水、面霜、潔面膏、爽膚水和粉底液，各1瓶，經(jīng)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)中微生物檢測方法檢測后，未有微生物污染。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1單重PCR特異性實(shí)驗(yàn)

分別采用合成好的金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶基因(nuc基因)、特異性序列(SmaI序列)和纖維蛋白原結(jié)合蛋白基因(clfA基因)引物分別對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC6538、金黃色葡萄球菌ATCC6538P和金黃色葡萄球菌CMCC26 003的總DNA進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：濃度為1 pg/μL～100 ng/μL的DNA模板1 μL、含Mg2+的10×緩沖溶液10 mM、dNTP 0.2 mM、Taq DNA聚合酶 1.0 U、引物對(duì)的上下游引物各0.5 μM，加ddH2O至總體積為25 μL；PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s、48 ℃退火40 s、72 ℃延伸1 min 30 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.4.2單重和多重PCR檢測靈敏度實(shí)驗(yàn)

以不同濃度的金黃色葡萄球菌ATCC6538 DNA模板對(duì)上述三對(duì)引物的單重和多重PCR檢測靈敏度進(jìn)行測試，其中金黃色葡萄球菌ATCC6538 DNA模板濃度分別為134.82 ng/μL、13.48 ng/μL、1.35 ng/μL、134.82 pg/μL、13.48 pg/μL、1.35 pg/μL和0.13 pg/μL。PCR反應(yīng)體系和條件同1.4.1。

1.4.3人工污染化妝品中金黃色葡萄球菌的檢測

1.4.3.1人工污染樣品

將市售的六個(gè)不同類型化妝品樣品(保濕乳、化妝水、面霜、潔面膏、爽膚水和粉底液)，進(jìn)行人工隨機(jī)致病菌污染，保濕乳中加入金黃色葡萄球菌StaphylococcusaureusATCC 6538，化妝水中加入金黃色葡萄球菌StaphylococcusaureusATCC 6538和大腸桿菌EscherichiacoliATCC 8039，面霜中加入金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC 6538和銅綠假單胞菌PseudomonasaeruginosaATCC 9027，潔面膏中加入大腸桿菌EscherichiacoliATCC 8039，爽膚水中加入銅綠假單胞菌PseudomonasaeruginosaATCC 9027，粉底液中加入大腸桿菌EscherichiacoliATCC 8039和銅綠假單胞菌PseudomonasaeruginosaATCC 9027，控制加入上述致病菌污染后各樣品的菌懸液的終濃度為10 CFU/mL，由此制備得到各化妝品的人工污染樣品。

1.4.3.2人工污染樣品增菌培養(yǎng)

制備增菌液：取酪蛋白胨17 g、大豆蛋白胨3 g、牛肉膏3 g、NaCl 5 g、葡萄糖2.5 g、酵母提取物0.5 g、丙酮酸鈉15 g、組氨酸5 g、硫基乙醇酸鈉1 g、卵磷脂2 g和吐溫-80 10 g，先將卵磷脂在少量蒸餾水中加溫溶解后，再與其他成分混合，加熱溶解至1 L，調(diào)pH為7.2～7.3，備用。

分別取10 mL化妝品的人工污染樣品，加入90 mL增菌液中，充分混勻；陰性對(duì)照為100 mL增菌液，陽性對(duì)照為加入了金黃色葡萄球菌ATCC6538的100 mL增菌液(終濃度為1 CFU/mL～10CFU/mL)，各組置于37 ℃振蕩培養(yǎng)箱中150 r/min培養(yǎng)6 h。

1.4.3.3人工污染樣品PCR檢測

基因組DNA提取：取上述振蕩培養(yǎng)后的增菌液各10 mL，離心收集菌體，用生理鹽水洗滌3次，采用Magen細(xì)菌DNA提取試劑盒提取六個(gè)化妝品的人工污染樣品、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照中的細(xì)菌基因組DNA，采用BioSpec-nano超微量分光光度計(jì)測定濃度，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用設(shè)計(jì)的三對(duì)引物對(duì)化妝品的人工污染樣品、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照中金黃色葡萄球菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系和條件同1.4.1。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL用1%瓊脂糖凝膠(含染色劑Gold view)在120 v電壓下電泳30 min，然后置于Bio-Red凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 單重PCR特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用本研究設(shè)計(jì)的三對(duì)引物(nuc、SmaI、clfA)分別對(duì)三株金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC6538、ATCC6538P、CMCC26003)進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示三對(duì)引物均能擴(kuò)增出清晰的條帶，目的條帶的大小分別為618 bp、822 bp和348 bp(見圖1)，采用三對(duì)引物分別對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞菌、沃氏葡萄球菌、腐生葡萄球菌、弗氏檸檬酸桿菌、惡臭假單胞菌、肺炎克雷伯氏菌和粘質(zhì)沙雷氏菌8種化妝品常見的污染微生物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明8株細(xì)菌均未擴(kuò)增出條帶，表明本研究設(shè)計(jì)的引物特異性良好(見圖2、圖3和圖4)。

M：DNA marker；1、4、7：金黃色葡萄球菌ATCC 6538；2、5、8：金黃色葡萄球菌ATCC6538P；3、6、9：金黃色葡萄球菌CMCC26003。

M：DNA marker；1：大腸桿菌；2：銅綠假單胞菌；3：沃氏葡萄球菌；4：腐生葡萄球菌；5：弗氏檸檬酸桿菌；6：惡臭假單胞菌；7：肺炎克雷伯氏菌；8：粘質(zhì)沙雷氏菌。

M：DNA marker；1～8：污染菌株樣品同圖2。

M：DNA marker；1～8：污染菌株樣品同圖2。

2.2 單重和多重PCR檢測靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用三對(duì)引物分別對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行靈敏度檢測，結(jié)果顯示，nuc基因擴(kuò)增的靈敏度為1.35pg/μL，clfA基因擴(kuò)增的靈敏度為13.48 pg/μL，SmaI序列擴(kuò)增的靈敏度為13.48 pg/μL；當(dāng)同時(shí)采用三對(duì)引物進(jìn)行多重PCR組合擴(kuò)增時(shí)，金黃色葡萄球菌的靈敏度為1.35 pg/μL，見圖5、圖6、圖7和圖8。

M：DNA marker；1～7：濃度為134.82 ng/μL、13.48 ng/μL、1.35ng/μL、134.82 pg/μL、13.48 pg/μL、1.35pg/μL和0.13 pg/μL的DNA模板；8：陽性對(duì)照；9：陰性對(duì)照。

M代表DNA marker；1～9代表的擴(kuò)增樣品同圖5

M代表DNA marker；1～9代表的擴(kuò)增樣品同圖5

M：DNA marker；1～9：擴(kuò)增樣品同圖5

2.3 人工污染化妝品中金黃色葡萄球菌的檢測結(jié)果

分別對(duì)6種不同類型的化妝品進(jìn)行人工污染后，傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法檢測污染樣品中微生物的總數(shù)，重復(fù)檢測三次取平均值，結(jié)果是保濕乳為1.5CFU/g，化妝水為2.6 CFU/g，面霜為7.3 CFU/g，潔面膏為9.6 CFU/g，爽膚水為2.4 CFU/g，粉底液為5.5 CFU/g。經(jīng)增菌培養(yǎng)后，采用多重PCR方法檢測其中的金黃色葡萄球菌，結(jié)果顯示，污染有金黃色葡萄球菌的化妝品樣品(保濕乳、化妝水、面霜)均能檢出各基因相應(yīng)條帶，而沒有加入金黃色葡萄球菌的化妝品樣品(潔面膏、爽膚水和粉底液)未出現(xiàn)條帶(見圖9)，表明金黃色葡萄球菌多重PCR檢測引物能快速、準(zhǔn)確檢測出污染化妝品中的金黃色葡萄球菌，且在保濕乳中，經(jīng)增菌后，可檢出1.5 CFU/g的金黃色葡萄球菌。

M：DNA marker；1：保濕乳；2：化妝水；3：面霜；4：潔面膏；5：爽膚水；6：粉底液；7：陽性對(duì)照，8：陰性對(duì)照。

2.4 討論

目前，市場上的化妝品種類繁多且來源廣泛，特別是新型化妝品的不斷推出，加上各種人為因素與技術(shù)問題等給化妝品微生物檢驗(yàn)工作帶來極大挑戰(zhàn)，但總的趨勢是化妝品微生物的合格率在逐年上升，然而由于化妝品中防腐劑的非正常添加，導(dǎo)致一些致病性金黃色葡萄球菌、糞大腸菌群的檢出率很低[10-12]，因此，化妝品微生物檢測的靈敏度也有待提高。

微生物的檢測方法主要依賴傳統(tǒng)的瓊脂平板培養(yǎng)法，方法繁瑣，耗時(shí)長，且容易出現(xiàn)誤檢和漏檢。防腐劑的存在也使相當(dāng)一部分化妝品的抑菌作用無法清除，很大程度上影響了檢驗(yàn)結(jié)果。本研究首先對(duì)金黃色葡萄球菌的增菌液進(jìn)行了優(yōu)化，在SCDLP增菌液的基礎(chǔ)上添加了一些化合物，如組氨酸、巰基乙醇酸鈉，可與卵磷脂和吐溫-80產(chǎn)生協(xié)同作用，進(jìn)一步中和化妝品中常見的防腐劑，使微生物可以快速恢復(fù)生長。另外，根據(jù)YOON等[13]的報(bào)道，酵母膏和丙酮酸鈉可促進(jìn)金黃色葡萄球菌復(fù)蘇生長，特別是金黃色葡萄球菌在不同壓力條件下(高溫、低溫、缺氧、紫外線等)處于休眠狀態(tài)或生長受限的情況，其中，丙酮酸鈉是一種VBNC狀態(tài)微生物復(fù)蘇促進(jìn)劑，可以刺激VBNC細(xì)胞的新陳代謝及DNA和蛋白質(zhì)的生物合成[14,15]，因此，優(yōu)化的增菌液可有效擴(kuò)增化妝品中的金黃色葡萄球菌。增菌后，即進(jìn)行多重PCR實(shí)驗(yàn)，本文多重PCR靈敏度可達(dá)到1.35 pg/μL，比徐曉可等[9]采用相同三組引物和序列擴(kuò)增的靈敏度要高。同時(shí)，對(duì)人工污染樣品，經(jīng)增菌后，在保濕乳中可檢出1.5 CFU/g的金黃色葡萄球菌，且特異性良好。本研究還添加了空白對(duì)照，可減小微生物檢測的誤差，降低漏檢和誤檢的可能性。但是，普通PCR檢測方法也有弊端，其只能進(jìn)行定性檢測，無法檢測到污染微生物的具體數(shù)量，而且PCR法檢測的是微生物的DNA，其表示的是存在DNA即存在微生物，但當(dāng)微生物死亡，其核酸還存在的情況也包含在內(nèi)，所以也可能出現(xiàn)假陽性的結(jié)果，但通過前期的6 h增菌培養(yǎng)后，這種假陽性的可能性會(huì)大大降低。盡管如此，更加準(zhǔn)確且能定量的方法仍然需要建立，如將熒光染料疊氮溴化乙錠(ethidium monoazide，EMA)或疊氮溴化丙錠(propidium monoazide，PMA)與實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)相結(jié)合的方法等，作者將繼續(xù)對(duì)此改進(jìn)方法進(jìn)行深入研究。

3 結(jié)論

本研究提出了一種可快速定性檢測化妝品中金黃色葡萄球菌的方法，即微生物預(yù)富集結(jié)合多重PCR的檢測方法可以有效將受防腐劑等其他壓力條件下的VBNC狀態(tài)金黃色葡萄球菌復(fù)蘇并檢測出來，且靈敏度和特異性均較好。該方法適用于包括保濕乳、化妝水、面霜、潔面膏、爽膚水和粉底液等不同性質(zhì)的化妝品產(chǎn)品。