劉 瑤，張曉勇，程 霞，梁 瀟，漆淑華*

1中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所，中國(guó)科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510301；2中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室(廣州)，廣州 511458；4華南農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，廣州 510642

由無(wú)乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)和海豚鏈球菌(S.iniae)引起的羅非魚(yú)鏈球菌病給羅非魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[1,2]。目前羅非魚(yú)養(yǎng)殖主要利用抗生素等化學(xué)藥物對(duì)鏈球菌病進(jìn)行防治,但長(zhǎng)時(shí)間地使用廣譜抗生素會(huì)誘導(dǎo)出耐藥菌株[1,2]。

鏈格孢菌屬(Alternaria)真菌廣泛存在于自然界，已鑒定的有300余種腐生菌、內(nèi)生菌和病原菌[3]。從鏈格孢菌屬真菌中已發(fā)現(xiàn)許多結(jié)構(gòu)新穎的活性化合物，化合物類型主要有吡喃酮類、萜類、甾醇類、芳香聚酮類、蒽醌類、生物堿類、肽類等[4-9]，部分化合物具有抑制酶、細(xì)胞毒、抗真菌、抗氧化、促進(jìn)單雙子葉植物根系生長(zhǎng)等生物活性[4-9]，其中鏈格孢菌毒素比如alternariol、alternariol methyl ether、tentoxin等具有顯著毒性[4]。細(xì)極鏈格孢菌(Alternariatenuissima)是一種常見(jiàn)的環(huán)境真菌，有關(guān)A.tenuissima次級(jí)代謝產(chǎn)物研究較少[10,11]，本研究組Pan等[12,13]曾從深海沉積物來(lái)源的A.tenuissimaDFFSCS013中分離到結(jié)構(gòu)新穎的螺環(huán)稠合氫化蒽醌和含氮蒽醌類化合物等。

為尋找新型抗生素，我們以羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌和海豚鏈球菌為指示菌，對(duì)一批從羅非魚(yú)腸道分離鑒定的真菌進(jìn)行了抗菌篩選，從中篩選到一株鏈格孢菌屬真菌A.tenuissimaSCSIO41701有顯著抑制無(wú)乳鏈球菌和海豚鏈球菌生長(zhǎng)活性。本研究采用活性追蹤法對(duì)A.tenuissimaSCSIO41701大米培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物中抑制羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌和海豚鏈球菌生長(zhǎng)的活性化合物進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

超導(dǎo)核磁共振儀(Bruker AVANCE500型，內(nèi)標(biāo)為T(mén)MS)；分析天平(SH 200E型電子天平)；中壓制備液相色譜(CHEETAH MP200 system(Agela Technologies))；高效液相色譜儀(Shimadzu LC-20AT pump with a Shimadzu SPD-M20A Photodiode Array Detector)；高效液相色譜分析柱(YMC ODS-SP，5 μm，150 mm×4.6 mm)；高效液相色譜半制備柱(YMC-Pack ODS，S-5 μm，250 mm×10 mm)；超聲波清洗器(KQ-5000D型，昆山市超聲儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器(SB-2000，上海艾朗儀器有限公司)。

試劑：甲醇、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、三氟乙酸、濃硫酸、二甲基亞砜(DMSO)等均為分析純，購(gòu)買(mǎi)自廣州試劑廠；色譜級(jí)甲醇、乙腈均為購(gòu)自默克公司；怡寶純凈水購(gòu)自于勝佳超市。

1.2 菌種

本實(shí)驗(yàn)所使用的真菌菌株A.tenuissimaSCSIO41701是從羅非魚(yú)腸道內(nèi)溶物中分離獲得，并結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，通過(guò)真菌DNA提取、ITS序列擴(kuò)增以及序列比后鑒定為A.tenuissima。該菌株的ITS序列在GeneBank中注冊(cè)編號(hào)為MK281554，其與菌株A.tenuissimaZB11263537的ITS序列(KX783377)相似度為99%。該菌株保存在中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所海洋微生物中心。

1.3 培養(yǎng)基及發(fā)酵條件

大米培養(yǎng)基：大米80 g，酵母浸膏0.4 g，葡萄糖0.4 g，水120 mL。

配3 kg的大米培養(yǎng)基，用一升錐形瓶分裝，每瓶大米約80 g，共40瓶。將培養(yǎng)基滅菌，在無(wú)菌操作臺(tái)中將菌株SCSIO41701的孢子用已滅菌的竹簽刮下，轉(zhuǎn)移到無(wú)菌水中，再用已滅菌的移液槍吸取5 mL菌液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基中，26 ℃下靜置培養(yǎng)30天后收瓶。

1.4 提取與分離

將3 kg大米的發(fā)酵產(chǎn)物用細(xì)胞破碎儀進(jìn)行破碎，用丙酮浸泡約12 h，重復(fù)三次，合并提取液，減壓濃縮，再用乙酸乙酯萃取，濃縮得到浸膏約44.30 g。總浸膏經(jīng)正相硅膠柱層析，用CH2Cl2/MeOH(1∶0→1∶1)溶劑系統(tǒng)洗脫，最后洗脫液通過(guò)TLC檢測(cè)合并得到12個(gè)組分(Fr.1～Fr.12)。用甲醇溶解時(shí)發(fā)現(xiàn)組分Fr.6～Fr.10中均有一部分甲醇不溶物，分別將Fr.6～Fr.10中甲醇不溶物過(guò)濾出來(lái)，TLC點(diǎn)板確定它們化學(xué)成分基本相同，均主要含2個(gè)化合物，只是不同組分中兩者比例不同，合并共得到10.26 g甲醇不溶物，其中來(lái)自Fr.6～Fr.10的重量分別為1.86、1.43、0.41、1.74、4.78 g。

取Fr.6中54 mg甲醇不溶物用甲醇和二氯甲烷(1∶1)的混合溶劑溶解，經(jīng)薄層制備板刮板得到化合物1(32 mg)。濾液經(jīng)中壓ODS柱分離，以甲醇/水/TFA(三氟乙酸)(V/V 5∶95∶0.03→100∶0∶0.03)梯度洗脫，分離得到11個(gè)亞組分(Fr.6.1～Fr.6.11)。Fr.6.2經(jīng)中壓ODS柱(沖洗系統(tǒng)MeOH/H2O/TFA，V/V 5∶95∶0.03→100∶0∶0.03)分離得到7個(gè)亞組分(Fr.6.2.1～Fr.6.2.3)。Fr.6.2.1經(jīng)HPLC(MeOH/H2O/TFA，V/V 55∶45∶0.03)分離純化得到化合物8(2 mg，tR=22.4 min)。Fr.6.3經(jīng)中壓ODS色譜柱(MeOH/H2O/TFA，V/V 5∶95∶0.03→100∶0∶0.03)分離得到7個(gè)亞組分(Fr.6.3.1～Fr.6.3.7)。Fr.6.3.2經(jīng)Sephdex LH-20凝膠柱(CH2Cl2/MeOH=1∶1)除去色素后，經(jīng)HPLC(MeOH/H2O/TFA，V/V 60∶40∶0.03)分離純化得到化合物7(11.8 mg，tR=25.0 min)。Fr.6.3.5經(jīng)Sephdex LH-20凝膠柱(CH2Cl2/MeOH=1∶1)除去色素后，經(jīng)HPLC(MeOH/H2O/TFA，V/V 80∶20∶0.03)分離，得到化合物4(10.1 mg，tR=37.2 min)。Fr.6.4經(jīng)中壓ODS色譜柱(MeOH/H2O/TFA，V/V 5∶95∶0.03→100∶0∶0.03)分離得到10個(gè)亞組分(Fr.6.4.1～Fr.6.4.10)，F(xiàn)r.6.4.4經(jīng)HPLC(MeOH/H2O/TFA，V/V 52∶48∶0.03)分離純化得到化合物5(28.6 mg，tR=17.1 min)。Fr.6.8經(jīng)Sephdex LH-20凝膠柱分離(MeOH洗脫)得到3個(gè)亞組分(Fr.6.8.1～Fr.6.8.3)，F(xiàn)r.6.8.3經(jīng)HPLC(MeOH/H2O/TFA，V/V 75∶20∶0.03)分離，得到化合物3(8 mg，tR=40.0 min)。將Fr.7中甲醇不溶物過(guò)濾后的濾液經(jīng)中壓ODS柱分離，以甲醇/水/TFA(V/V 5∶95∶0.03→100∶0∶0.03)梯度洗脫，得到13個(gè)亞組分(Fr.7.1～Fr.7.13)。Fr.7.7經(jīng)Sephdex LH-20凝膠柱分離(CH2Cl2/MeOH，V/V 1∶1)得到5個(gè)亞組分(Fr.7.7.1～Fr.7.7.5)。Fr.7.7.2經(jīng)HPLC(MeOH/H2O/TFA，V/V 54∶46∶0.03)分離，得到化合物9(41 mg，tR=12.5 min)。Fr.7.9經(jīng)Sephdex LH-20凝膠柱分離(CH2Cl2/MeOH=1∶1)除去雜質(zhì)，得到化合物2(15 mg)。Fr.7.13經(jīng)Sephdex LH-20凝膠柱分離(CH2Cl2/MeOH=1∶1)得到3個(gè)亞組分(Fr.7.13.1～Fr.7.13.3)，F(xiàn)r.7.13.2經(jīng)HPLC(MeOH/H2O/TFA，V/V 65∶35∶0.03)分離，得到化合物6(14.8 mg，tR=12.8 min)。

1.5 抗菌活性測(cè)定

1.5.1 紙片法抗菌初篩

采用紙片法，以DMSO為溶劑，將待測(cè)組分配制成20 mg/mL，待測(cè)單體化合物配制成10 mg/mL，陽(yáng)性對(duì)照環(huán)丙沙星和青霉素分別配成5 mg/mL。以無(wú)乳鏈球菌和海豚鏈球菌為指示菌。細(xì)菌先搖床培養(yǎng)24 h(30 ℃)，用無(wú)菌水稀釋至酶標(biāo)儀OD值0.01～0.02，取稀釋后的細(xì)菌150 μL，涂布于細(xì)菌培養(yǎng)皿中。將滅菌的紙片(直徑6 mm)用滅菌的鑷子取每6個(gè)均勻放入培養(yǎng)皿，以環(huán)丙沙星和青霉素(12.5 μg/disc)為陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照為DMSO。取2.5 μL待測(cè)樣品滴入紙片，每個(gè)樣品兩個(gè)平行試驗(yàn)，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1天，觀察現(xiàn)象。

1.5.2 96孔板法測(cè)MIC值

采用倍半稀釋法，對(duì)初篩有顯著抗菌活性的化合物1進(jìn)行MIC值測(cè)定。采用96孔板，每孔加入192 μL的稀釋好菌液(OD值0.01～0.02)和8 μL樣品(10 mg/mL)，樣品最終濃度分別為200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5 μg/mL。最后，放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，12 h后用酶標(biāo)儀測(cè)量，查看結(jié)果。陽(yáng)性對(duì)照每孔加入192 μL稀釋的菌液和8 μL環(huán)丙沙星，陰性對(duì)照每孔加入192 μL稀釋的菌液和8 μL DMSO。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

采用硅膠柱層析、Sephadex LH-20凝膠柱層析、HPLC等色譜技術(shù)從A.tenuissimaSCSIO41701大米發(fā)酵產(chǎn)物中共分離純化得到9個(gè)化合物(見(jiàn)圖1)，通過(guò)1H NMR、13C NMR、MS等波譜技術(shù)鑒定了這些化合物的結(jié)構(gòu)。

圖1 化合物1～9的化學(xué)結(jié)構(gòu) Fig.1 Structures of compounds 1-9

化合物1無(wú)色尖晶；1H NMR(700 MHz，DMSO-d6)δ：11.76(1H，s，OH-3)，10.96(1H，s，OH-5)，10.37(1H，s，OH-9)，7.26(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，6.72(1H，d，J=2.5 Hz，H-8)，6.64(1H，d，J=2.5 Hz，H-10)，6.37(1H，d，J=2.0 Hz，H-4)，2.70(3H，s，H-11)；13C NMR(175 MHz，DMSO-d6)δ：138.3(s，C-7)，117.6(d，C-8)，158.5(s，C-9)，101.6(d，C-10)，152.6(s，C-10a)，164.1(s，C-2)，97.4(s，C-2a)，164.7(s，C-3)，100.9(d，C-4)，165.5(s，C-5)，104.3(d，C-6)，138.1(s，C-6a)，108.8(s，C-7a)，25.3(q，C-11)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[14]對(duì)比一致，故鑒定該化合物為aternariol。

化合物2淡黃色固體；1H NMR(700 MHz，DMSO-d6)δ：11.83(1H，s，OH-3)，10.38(1H，s，OH-9)，7.23(1H，d，J=2.2 Hz，H-6)，6.73(1H，d，J=2.6 Hz，H-8)，6.65(1H，d，J=2.6 Hz，H-10)，6.62(1H，d，J=2.2 Hz，H-4)，2.73(3H，s，H-11)，3.91(3H，s，H-12)；13C NMR(175 MHz，DMSO-d6)δ：137.3(s，C-7)，117.4(d，C-8)，158.6(s，C-9)，101.3(d，C-10)，152.5(s，C-10a)，164.7(s，C-2)，98.5(s，C-2a)，164.1(s，C-3)，99.2(d，C-4)，166.2(s，C-5)，103.4(d，C-6)，137.5(s，C-6a)，108.8(s，C-7a)，25.0(q，C-11)，55.9(q，C-12)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[15]對(duì)比一致，故鑒定該化合物為aternariol methyl ether。

化合物3棕紅色無(wú)定形粉末；1H NMR(700 MHz，DMSO-d6)δ：11.91(1H，s，OH-3)，10.01(1H，s，OH-10)，9.15(1H，s，OH-9)，7.22(1H，d，J=2.2 Hz，H-6)，6.73(1H，s，H-8)，6.61(1H，d，J=2.2 Hz，H-4)，3.91(3H，s，H-12)，2.65(3H，s，H-11)；13C NMR(175 MHz，DMSO-d6)δ：138.5(s，C-6a)，98.4(s，C-2a)，164.2(s，C-3)，99.3(d，C-4)，166.2(s，C-5)，103.5(d，C-6)，164.7(s，C-2)，109.2(s，C-7a)，141.6(s，C-10a)，131.2(s，C-10)，147.1(s，C-9)，116.9(d，C-8)，126.5(s，C-7)，55.9(q，C-12)，24.6(q，C-11)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[16]對(duì)比一致，故鑒定該化合物為3-hydroxyalternariol 5-O-methylether。

化合物6黃色固體；1H NMR(700 MHz，DMSO-d6)δ：11.35(1H，s，OH-3)，11.32(1H，s，OH-7)，6.92(1H，d，J=2.1 Hz，H-6)，6.59(1H，m，H-4)，3.86(3H，s，H-5)，3.05(1H，d，J=17.7 Hz，H-9)，2.80(1H，d，J=17.7 Hz，H-9)，1.61(3H，s，H-10)；13C NMR(175 MHz，DMSO-d6)δ：196.6(s，C-8)，167.9(s，C-2)，165.7(s，C-5)，163.9(s，C-3)，149.6(s，C-7)，132.8(s，C-6a)，129.8(s，C-7a)，105.8(d，C-6)，101.7(d，C-4)，99.3(s，C-2a)，81.6(s，C-9a)，56.0(q，C-5)，46.8(t，C-9)，27.4 (q，C-10)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道的化合物4數(shù)據(jù)對(duì)比一致，由于文獻(xiàn)[18]沒(méi)給具體命名，在此系統(tǒng)命名此化合物為1，6-dihydroxy-8-methoxy-3a-methyl-3，3a- dihydrocyclopenta[c]isochromene- 2，5-dione。

2.2 抗菌活性結(jié)果

采用紙片擴(kuò)散法測(cè)試發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯粗提物、各組分，以及各化合物的抗菌活性結(jié)果見(jiàn)表1。在100 μg/disc濃度下，乙酸乙酯粗提物抑制無(wú)乳鏈球菌和海豚鏈球菌生長(zhǎng)的抑菌圈大小均為15 mm；在50 μg/disc濃度下，各組分對(duì)無(wú)乳鏈球菌和海豚鏈球菌的生長(zhǎng)均有一定的抑制作用，其中組分Fr.6～Fr.10抗菌活性較強(qiáng)，抑菌圈大小為14～21 mm；在25 μg/disc濃度下，化合物1～11中只有1對(duì)無(wú)乳鏈球菌和海豚鏈球菌均顯示較強(qiáng)抗菌活性，抑菌圈大小為10 mm，而其他化合物則沒(méi)有或只有弱抗菌活性。對(duì)于活性化合物1進(jìn)一步采用96孔板稀釋法測(cè)試了其MIC值，抑制無(wú)乳鏈球菌和海豚鏈球菌的MIC值均為12.5 μg/mL，陽(yáng)性對(duì)照藥環(huán)丙沙星抑制這兩株病原菌的MIC值均為3.125 μg/mL。

表1 組分和化合物的抗菌活性Table 1 Antibacterial activities of fractions and compounds

3 討論

在本研究中，我們通過(guò)抗菌活性追蹤分離鑒定了真菌A.tenuissimaSCSIO41701中抑制羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌和海豚鏈球菌生長(zhǎng)的主要活性化合物是高含量的aternariol(1)，并通過(guò)HPLC分析和薄層點(diǎn)板分析，發(fā)現(xiàn)組分Fr.6～Fr.10中都含有大量的化合物1和2，其中化合物1是主峰，推測(cè)抗菌活性較好的組分Fr.6～Fr.10都主要通過(guò)化合物1起抗菌作用。導(dǎo)致化合物1和2交叉分布在這些組分中的原因，是由于經(jīng)正相硅膠柱分離粗提物時(shí)高含量的化合物1和2微溶于沖洗用的二氯甲烷-甲醇溶劑系統(tǒng)?；衔?～6都屬于苯并吡喃內(nèi)酯類化合物，比較它們的結(jié)構(gòu)和抗羅非魚(yú)鏈球菌活性，推測(cè)苯環(huán)C-5上羥基和C7-C10a間共軛體系的存在對(duì)其抗菌活性起重要作用。

化合物1和2是常見(jiàn)的鏈格孢菌毒素，?？捎诠任?、水果、油菜、葵花籽、橄欖等食品中檢測(cè)到?；衔?和2均有細(xì)胞毒活性，可通過(guò)誘導(dǎo)基因突變，促使DNA鏈在體外產(chǎn)生遺傳毒性斷裂，并抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶I和IIα[14]，且2能誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞的線粒體突變[15,22,23]。此外，化合物1有較好的抑制金色葡萄球菌、乳鏈球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌的活性，MIC值均為7.82 μg/mL，并有強(qiáng)抑制植物病原真菌蘋(píng)果腐爛菌、西瓜枯萎病菌、番茄灰霉菌和辣椒疫霉菌的活性，MIC值為15.63、7.82、1.96、3.91 μg/mL[24]；化合物2對(duì)枯草芽孢桿菌、假單胞菌、拉爾斯頓氏菌、青枯菌、單胞菌也有抗菌作用，MIC50值分別為28.83、34.29、27.08、29.21、30.06 μg/mL[15]。在本研究中，我們首次發(fā)現(xiàn)化合物1有較強(qiáng)的殺死羅非魚(yú)病原菌無(wú)乳鏈球菌和海豚鏈球菌的活性，且在菌株A.tenuissimaSCSIO41701中產(chǎn)量高，但鑒于該化合物作為真菌毒素有較強(qiáng)的毒性，后續(xù)能否開(kāi)發(fā)用于羅非魚(yú)鏈球菌病的防治還有待深入研究。