劉利佳, 徐志強, 何佳, 丁永樂, 孫聚濤*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院, 鄭州 450000; 2.浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司, 杭州 310009;3.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司, 鄭州 450000)

煙草黑脛病(tobacco black shank)又稱煙草疫病，是由煙草疫霉菌(Phytophthoranicotianae)引起的一種毀滅性土傳病害[1]。煙草疫霉菌發(fā)生范圍廣，危害重且防治難度大。病原菌發(fā)病流行期防治管理不當(dāng)易造成大田煙株成片發(fā)病，嚴(yán)重時導(dǎo)致整片煙田發(fā)病，造成絕收，因此每年都對煙草生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟損失。煙草疫霉菌長期寄生在病殘體組織上或潛伏于土壤中，可在土壤中存活數(shù)年并逐年累積，其厚垣孢子可伴隨雨水及灌溉水傳播，待環(huán)境合適便萌發(fā)釋放大量活動的游動孢子，造成二次侵染[2]。為降低煙草疫霉菌對煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)的影響，生產(chǎn)上常用化學(xué)殺菌劑防治煙草疫霉菌，雖然取得了一定的防治效果，但殺菌劑的濫用易使病原菌產(chǎn)生抗藥性[3-4]，還極易造成煙葉農(nóng)藥殘留。

木霉菌對多種病原菌具有生防作用[5-8]，且對植物具有促生作用[9-10]、對土壤具有改良作用[11-14]。黃艷青等[15]研究表明，木霉菌可誘導(dǎo)甜瓜抗枯萎病相關(guān)防御反應(yīng)酶系，增強甜瓜對枯萎病的抗性；采用木霉菌拌種能夠顯著增加小麥根基土壤中真菌群落的豐富度，使真菌群落的優(yōu)勢度發(fā)生明顯改變[16-17]，根際土壤中病原真菌的比例顯著降低[17-18]。但關(guān)于哈茨木霉菌誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病防御反應(yīng)及對病原菌產(chǎn)生拮抗作用的作用機理尚未見報道，因此，本試驗以煙草栽培品種NC89為試驗材料，通過超高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-mass spectrometer，LC/MS)技術(shù)分析接種哈茨木霉菌前后NC89對煙草疫霉菌的抗性差異及代謝通路的變化，對比差異代謝物和代謝途徑，深入研究哈茨木霉菌誘導(dǎo)提高NC89對煙草疫霉菌抗性的作用機理，為利用哈茨木霉菌防治煙草疫霉菌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2020年10月在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)毛莊科教園區(qū)及煙草育種實驗室進行。選取烤煙品種NC89為試驗材料，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草育種實驗室提供。煙草疫霉菌1號菌株由河南許昌煙草研究院分離提供。哈茨木霉菌制劑購自美國拜沃股份有限公司，有效成分含量為3×108CFU·g-1。

1.2 試驗方法

1.2.1哈茨木霉帶菌培養(yǎng)基質(zhì)的培養(yǎng) 將培養(yǎng)基質(zhì)(丹麥品氏0～10 mm泥炭土基質(zhì))與蛭石以10∶1的質(zhì)量比混合均勻后，經(jīng)121 ℃、30 min滅菌，待其充分冷卻后制成無菌混合基質(zhì)。按照無菌混合基質(zhì)與哈茨木霉菌制劑以200∶1的質(zhì)量比混合均勻后，用無菌水翻拌至濕潤狀態(tài)，封口置于25 ℃避光培養(yǎng)3 d，用以活化哈茨木霉菌。另制備未接種哈茨木霉菌的無菌混合基質(zhì)備用。

1.2.2煙草疫霉菌株的活化與菌谷的制備 將保存的煙草疫霉菌接種至燕麥固體培養(yǎng)基，置于28 ℃生化培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)5 d活化[1]。在超凈工作臺中，將活化后的煙草疫霉菌沿菌落邊緣用直徑為5 mm的無菌打孔器打孔，并將打制的菌餅轉(zhuǎn)接至裝有小米培養(yǎng)基的接種袋中，每150 g滅菌小米培養(yǎng)基接種6個菌餅，搖勻，使菌餅在培養(yǎng)基中均勻分布(避免菌餅粘連在接種袋上)后，將接種袋封口置于28 ℃生化培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)15 d至形成菌谷[19]。期間每日需要將小米搖散，避免因菌絲生長造成小米結(jié)塊。

1.2.3試驗設(shè)計 在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)將NC89包衣種子(包衣丸化使用的包衣料中主要成分是凹凸棒粉及滑石粉等惰性材料，其余輔料為粘合劑和染料等)均勻播種于50孔穴盤(無菌基質(zhì))中進行標(biāo)準(zhǔn)化育苗。成苗后，選取健壯且生長勢均勻的煙草幼苗連其根部土壤一同移入裝有相應(yīng)培養(yǎng)基質(zhì)(200 g)的塑料盆中(直徑9 cm、高8 cm)，移栽過程中應(yīng)避免傷害到煙苗根部。培養(yǎng)基質(zhì)共設(shè)置4個處理：①無菌基質(zhì) (NC89CK)；②無菌基質(zhì)，然后將制備好的煙草疫霉菌菌谷以0.5 g·株-1的比例輕埋于緊貼煙苗根部側(cè)面深1 cm處，表面仍以無菌土覆蓋，避免病原物逸散(NC89_P)；③混合了哈茨木霉菌株的無菌基質(zhì)(NC89_T)；④無菌基質(zhì)混合哈茨木霉菌株后，將制備好的煙草疫霉菌菌谷以0.5 g·株-1的比例輕埋于緊貼煙苗根部側(cè)面深1 cm處，表面以混合了哈茨木霉菌的基質(zhì)覆蓋(NC89_T_P)。所有處理均以無菌水保濕，置于28 ℃的人工氣候室中保濕培養(yǎng)。每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)10株，即每個處理30株煙苗。NC89_P和NC89_T_P處理接種煙草疫霉菌后，于開始發(fā)病時，按照煙草病蟲害分級及調(diào)查方法(GB/T23222—2008規(guī)定)調(diào)查煙苗的發(fā)病情況，計算發(fā)病率和病情指數(shù)(disease index，DI)。

發(fā)病率=每個處理發(fā)病的株數(shù)/該處理總株數(shù)×100%

(1)

病情指數(shù)(DI)=∑(各級病株數(shù)×該病級值)/(調(diào)查總株數(shù)×最高級值)×100

(2)

依據(jù)煙草品種抗病性鑒定標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 23224—2008)將抗性分為六級：高抗或免疫(immune，I)：DI=0；抗病(resistant，R)：DI<20；中抗(middle resistant，MR)：20≤DI<40；中感(middle susceptible，MS)：40≤DI<60；感病(susceptible，S)：60≤DI<80；高感(high susceptible，HS)：80≤DI≤100。

1.3 LC/MS分析

將4個處理組的煙苗分別拔出，將根部用清水沖洗干凈，用無菌剪刀將根莖交接處剪下，快速置于液氮中保存?zhèn)溆?。其中，取一部分用干冰封存寄送至武漢金開瑞生物工程有限公司進行非靶向代謝組學(xué)分析。

1.3.1LC/MS前處理 每個處理取100 mg研磨好的根莖交接處組織樣本置于EP管中，并加入500 μL 80%甲醇水溶液，漩渦震蕩使其充分溶解，冰浴靜置5 min使蛋白析出后，4 ℃ 15 000 r·min-1離心20 min；然后取一定量的上清液加入適量質(zhì)譜級水稀釋至甲醇含量為53%(以達到上機要求)，4 ℃ 15 000 r·min-1離心20 min，收集上清液，于-80 ℃條件下保存，用于LC/MS分析。

1.3.2LC/MS分析和數(shù)據(jù)預(yù)處理 將經(jīng)過前處理的樣本采用Thermo Fisher 的Vanquish UHPLC色譜儀與Hypesil Gold column (100 mm×2.1 mm, 1.9 μm)色譜柱，色譜儀的設(shè)置參照Want等[20]的方法進行，色譜梯度洗脫程序見表1。

表1 洗脫梯度Table 1 Elution gradient

采用Thermo Fisher 的Q ExactiveTMHF質(zhì)譜儀。質(zhì)譜儀設(shè)置參照Boulesteix等[21]的方法進行。樣品質(zhì)譜信號采集分別采用正、負離子掃描模式。

質(zhì)控(quality control，QC)樣本由所有實驗樣本等體積混合制成，每個質(zhì)控樣本的體積和分析方法與供試樣本完全相同。在整個分析過程中，每10個分析樣本中插入一個質(zhì)控樣本，用于檢測試驗過程的可靠性。

1.3.3數(shù)據(jù)分析 將質(zhì)譜分析得到的原始文件(.raw)導(dǎo)入Compound Discoverer 3.1軟件，對LC/MS上機檢測的結(jié)果進行譜圖處理及數(shù)據(jù)庫搜庫，得到初步的代謝物定性定量結(jié)果，然后對數(shù)據(jù)進行質(zhì)控，以保證數(shù)據(jù)結(jié)果的準(zhǔn)確度和可靠性。接下來對代謝物進行多元統(tǒng)計分析，通過主成分分析反映組間樣本的總體代謝差異；由監(jiān)督的偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)反映組內(nèi)樣本之間的變異度大小。最后，通過代謝通路綜合差異代謝物分析解釋代謝物的生物學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 NC89不同處理對接種煙草疫霉菌后發(fā)病的影響

以NC89CK和NC89_T為對照，接種煙草疫霉菌6 d后，NC89_P開始發(fā)病(表2)；接種哈茨木霉菌的NC89_T_P處理病情指數(shù)顯著低于未接種哈茨木霉菌的NC89_P，這表明哈茨木霉菌能有效提高NC89對煙草疫霉菌的抗性。

表2 不同處理接種煙草疫霉菌后的發(fā)病情況Table 2 Incidence of tobacco in different treatments inoculated with Phytophthora nicotianae

2.2 NC89各處理根莖部樣品的LC/MS分析和數(shù)據(jù)預(yù)處理

正、負離子模式下NC89CK、NC89_P、NC89_T及NC89_T_P根莖部典型的基峰離子流圖顯示，原始質(zhì)普數(shù)據(jù)經(jīng)處理后，正離子模式下檢測到810個代謝物(圖1)，負離子模式下檢測到402個代謝物(由保留時間和質(zhì)核比值組成的數(shù)據(jù)對表示)(圖2)。

2.3 NC89各處理誘導(dǎo)差異代謝產(chǎn)物的鑒定

正、負離子模式下NC89_P和NC89CK及NC89_T_P和NC89_T的主成分分析結(jié)果(圖3)表明，不同處理間存在顯著差異。建立兩個比較組的PLS-DA模型(模型的解釋率用R2Y表示，模型的預(yù)測能力以Q2Y評價，當(dāng)R2Y大于Q2Y時，認(rèn)為模型建立良好)，經(jīng)七次循環(huán)交互驗證(7-fold cross-validation)得到模型評價參數(shù)R2和Q2， R2和Q2越接近1.00，表明模型越可靠。此外，為防止模型“過擬合”，對該模型進行200次樣品的分組標(biāo)記、隨機打亂、再次建模和預(yù)測過程，期間每次建模對應(yīng)的R2和Q2值可以得到一條回歸線，若模型未“過擬合”，該回歸線為R2數(shù)據(jù)大于Q2數(shù)據(jù)，且Q2回歸線與Y軸截距小于0[21]。對模型質(zhì)量進行判別(圖4和5)，處理組和對照組的總體分布趨勢較穩(wěn)定且趨勢明顯，模型的解釋率和預(yù)測能力較好，模型質(zhì)量較高?！斑^擬合”驗證表明：所得參數(shù)R2Y大于Q2Y(圖4)，且Q2回歸線與Y軸截距小于0(圖5)，表明該模型未“過擬合”，能夠有效用于對照組和處理組間的最大差異對比，因此適合進行后續(xù)分析。

2.4 不同處理間差異代謝物的鑒定

如表3所示，NC89CK與NC89_P相比，正離子模式下共篩選出188個差異代謝物，其中上調(diào)的有114個，下調(diào)的有74個；負離子模式下共篩選出120個差異代謝物，其中上調(diào)的有77個，下調(diào)的有43個。NC89_T_P與NC89_P相比，正離子模式下共篩選出的390個差異代謝物，其中上調(diào)的有215個，下調(diào)的有175個；負離子模式下共篩選出195個差異代謝物，其中上調(diào)的有121個，下調(diào)的有74個。將PLS-DA模型中VIP值大于1.40的化合物，初步認(rèn)定為差異達到顯著的化合物。對接種煙草疫霉菌前后差異代謝物含量的變化倍數(shù)進行比對分析(表4和5)發(fā)現(xiàn)，差異代謝物主要包括生物堿類化合物、黃酮及類黃酮、脂肪酸及其衍生物、苯丙烷類化合物、水楊酸、甜菜堿、萜類和泛酸等化合物，這些物質(zhì)可能參與煙草對疫霉菌的抗性反應(yīng)，以及哈茨木霉菌對煙草疫霉菌抗性反應(yīng)的調(diào)控。此外，比較倍數(shù)變化值表明，接種哈茨木霉菌后，NC89中對煙草疫霉菌抗病反應(yīng)的代謝產(chǎn)物含量明顯提高，由此說明，哈茨木霉菌有利于提高NC89的代謝水平。

表3 差異代謝物的篩選Table 3 Screening of differential metabolites

表4 NC89_P 與 NC89CK重要差異代謝物Table 4 Important differential metabolite between NC89_P and NC89CK

表5 NC89_T_P 與NC89_T重要差異代謝物Table 5 Important differential metabolite between NC89_T_P and NC89_T

2.5 差異代謝物的代謝通路分析(基于KEGG數(shù)據(jù)庫)

通過富集代謝通路分析能確定差異代謝物參與的主要生化代謝途徑及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而解釋代謝物在代謝通路中的生物學(xué)意義。用超幾何檢驗公式[22]對NC89接種哈茨木霉菌前后抗煙草疫霉菌代謝途徑中的差異代謝通路進行分析，并與所有鑒定的代謝物背景相比，得到差異代謝物富集的代謝通路或代謝途徑(表6和7)，并根據(jù)對比的富集結(jié)果，繪制KEGG富集氣泡圖(圖6)。結(jié)果表明，接種哈茨木霉菌前后，NC89抗煙草疫霉菌共有的差異代謝產(chǎn)物主要包括脂肪酸和氨基酸類。接種哈茨木霉菌前，NC89抗煙草疫霉菌共有的代謝通路有27條，抗病相關(guān)通路為20條。接種哈茨木霉菌后，NC89抗煙草疫霉菌特有的代謝途徑為：不飽和脂肪酸代謝、苯丙惡唑類化合物代謝、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)、單萜及二萜類生物合成、黃酮和類黃酮的生物合成以及亞油酸代謝、丙酮酸代謝、抗壞血酸代謝、煙酸代謝和個別氨基酸代謝。由此表明， NC89接種哈茨木霉菌后，對煙草疫霉菌的抗病響應(yīng)在代謝水平發(fā)生變化，從而導(dǎo)致NC89對煙草疫霉菌的抗性增強。此外，研究NC89對煙草疫霉菌的抗病代謝通路發(fā)現(xiàn)，NC89主要通過苯丙烷類植保素、萜烯類植保素、不飽和脂肪酸及抗壞血酸和過氧化物的清除等途徑來抵抗煙草疫霉菌的侵染。哈茨木霉菌還引起了氮素代謝、碳代謝和戊糖磷酸途徑等基礎(chǔ)調(diào)控代謝的差異，說明哈茨木霉菌對煙草產(chǎn)生了一定的促生作用。

表6 NC89_P和NC89CK差異代謝通路富集Table 6 NC89_P VS NC89CK differential metabolic pathway enrichment

表7 NC89_T_P和NC89_T差異代謝通路富集Table 7 NC89_T_P VS NC89_T differential metabolic pathway enrichment

3 討論

本試驗以對煙草疫霉菌有一定抗性的NC89為試驗材料，利用LC/MS技術(shù)探究添加哈茨木霉菌前后NC89對煙草疫霉菌抗病過程中根莖部位在代謝水平產(chǎn)生的變化。PLS-DA分析發(fā)現(xiàn)，不同處理間有明顯的分離趨勢，結(jié)合差異代謝物及富集通路表明，接種哈茨木霉菌后，提高了NC89對煙草疫霉菌的抗性。分析原因可能是大量抗病相關(guān)代謝物含量發(fā)生變化有助于NC89抵抗煙草疫霉菌的侵染[23-28]，如生物堿類物質(zhì)[28-30]、脂肪酸及其衍生物[23]、類黃酮[31]、水楊酸[32-36]、單萜及二萜[37]和泛酸[30]等。此外，接種哈茨木霉菌后還檢測到了磷酸肌醇[26]及苯并惡唑嗪酮[24]等代謝物。脂肪酸及其衍生物對植物抗病信號傳導(dǎo)具有重要作用。研究表明，甘油-3-磷酸(G3P)可誘導(dǎo)擬南芥(Arabidopsisthaliana)對炭疽病菌(Colletotrichumhigginsianum) 產(chǎn)生基礎(chǔ)抗性[26]。植物角質(zhì)層主要由脂肪酸及其衍生物構(gòu)成，高度疏水的結(jié)構(gòu)可有效保護植物內(nèi)部組織免受細菌和真菌等病原體的侵染[23,26]。油酸(C18∶1)和亞油酸(C18∶2)能夠誘導(dǎo)蛋白激酶C介導(dǎo)的煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NAD-PH)氧化酶的活化，從而誘導(dǎo)植物活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生[23]。此外，茉莉酸等脂肪酸衍生物對植物應(yīng)對機械損傷、提高植物抗病性具有重要作用[32-33]；丙酮酸積累是消除ROS的第一道防線；脯氨酸可清除植物在逆境脅迫下由于代謝不平衡而積累的活性氧[38]；類黃酮和萜類與植物的抗病性密切相關(guān)[31,37]；泛醌和其他萜類醌的生物合成途徑中，致病疫霉釋放的RXLR-effector AVR3a以宿主U-box泛素連接酶CMP G1為底物，通過宿主馬鈴薯U-box泛素連接酶StCMPG1的自泛素化反應(yīng)，誘發(fā)細胞死亡[30]。

本研究對比差異代謝通路發(fā)現(xiàn)，氮和硫代謝也存在顯著差異，可能是由于接種哈茨木霉菌對煙草產(chǎn)生了一定的促生作用，與前人研究結(jié)果相一致[11,39]。接種哈茨木霉菌會引起煙草對疫霉菌免疫應(yīng)答過程中代謝物發(fā)生變化。結(jié)合差異代謝物與富集通路顯示，接種哈茨木霉菌后，脂肪酸及其衍生物代謝途徑、苯丙氨酸代謝途徑及氨基酸代謝途徑均檢測到顯著差異。差異代謝物中，賴氨酸、色氨酸和脯氨酸等不僅是生物堿合成途徑的起始物質(zhì)，同時還參與了對煙草疫霉菌免疫應(yīng)答反應(yīng)中苯丙烷類木質(zhì)素和生物堿等抗病相關(guān)物質(zhì)及其次生代謝產(chǎn)物的合成；脂肪酸及其代謝產(chǎn)物參與植物內(nèi)源激素如茉莉酸的合成途徑。研究表明，植物內(nèi)源激素作為誘導(dǎo)植物相關(guān)防衛(wèi)基因表達的信號分子，其本身也參與對病原物的免疫應(yīng)答反應(yīng)[32]。此外，脫落酸與植物抗逆作用相關(guān)，外源施加脫落酸可誘導(dǎo)茉莉酸的合成，二者在植物體內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程也存在一定聯(lián)系[40]；水楊酸在植物遭遇外界傷害時，可抑制茉莉酸等物質(zhì)的合成及其所誘導(dǎo)基因的表達，而茉莉酸能阻止病原菌侵染后造成的水楊酸累積，從而表現(xiàn)出一種拮抗作用[32-33]。不僅如此，脫落酸與水楊酸復(fù)合處理，能提高植物對溫度脅迫的抵抗能力[34-36]。接種哈茨木霉菌后，NC89的茉莉酸代謝顯著上調(diào)，這些內(nèi)源性植物激素的相互協(xié)同或拮抗作用達到了一種動態(tài)平衡，顯著提高了NC89對煙草疫霉菌的抗性。

通過代謝組學(xué)分析，有利于對哈茨木霉菌誘導(dǎo)抗性提升的抗病機理進行解析。哈茨木霉菌可誘導(dǎo)煙草植株在受到病害脅迫時激活抗病相關(guān)的代謝通路，產(chǎn)生抗病相關(guān)代謝物——包括直接代謝產(chǎn)物和次生代謝產(chǎn)物，這些產(chǎn)物直接或間接的增強了植物的抗病性。此外，結(jié)合基因組學(xué)和蛋白組學(xué)，還能找到哈茨木霉菌誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生的激素代謝及信號傳導(dǎo)相關(guān)基因的表達差異，有利于深入研究哈茨木霉菌對煙草疫霉菌的生防機理。