關(guān) 媛,呂秀立,于澤群,李秀芬,李水根,劉群錄3,朱建軍

(1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹研究所,上海 201403;2上海市園林科學(xué)規(guī)劃研究院,上海 200232;3上海交通大學(xué)設(shè)計學(xué)院,上海 200240)

櫟屬植物(QuercusL.)是殼斗科(Fagaceae)櫟屬(Quercus)重要樹種,為落葉或常綠喬木,也是少數(shù)幾個基因組已經(jīng)測序的模式樹種[1]。櫟屬有400個種,主要分布在北美洲、歐洲、亞洲和北非[2],我國有110余種,各地均有分布。狹義的櫟屬即定義的櫟亞屬,全世界約有300種,中國有51個種、14個變種和1個變型[3]。櫟樹在木材、工業(yè)原料、環(huán)境綠化和生態(tài)修復(fù)等方面具有重要價值[4-6]。樹皮可藥用,栓皮櫟的樹皮可做紅酒的軟木塞;木材質(zhì)量很好,是家具、地板、農(nóng)具、車輛等的優(yōu)良用材。此外,櫟樹也是水源涵養(yǎng)和水土保持林的良好樹種,并對有害氣體及逆境具有高度抗性,可作為園林綠化樹種。近年來,隨著城市綠化品質(zhì)的提高,上海市相繼引入耐鹽堿、耐水濕的弗吉尼亞櫟(Quercus virginiana)、沼生櫟(Quercus palustris)、納塔櫟(Quercus nuttallii)等,沼生櫟和納塔櫟等在秋季葉色變紅,緩解了香樟和廣玉蘭等景觀樹種單一的問題[7-8]。最重要的是城市綠化引種高大喬木,將充實綠地群落的上層骨干樹種,增加群落的生物多樣性,極大地豐富園林景觀[9]。

SSR分子標記技術(shù)具有共顯性、易于操作、重復(fù)性好的特點,已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于許多林木的遺傳多樣性研究[10-14]。本研究利用篩選的SSR標記對櫟屬4個種24個單株進行遺傳多樣性分析,以期為該物種的資源利用及引種評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

從中國江蘇和美國不同地區(qū)引進4個種櫟屬植物,共100份種質(zhì)資源,播種在上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹研究所苗圃內(nèi),生長6個月后,根據(jù)表型選取24份櫟屬植物種質(zhì)資源進行分析。分別是來自中國江蘇的麻櫟(Quercus acutissima),編號為Qa-1—Qa-8;美國佛羅里達州的墨西哥白橡(Quercus polymorpha),編號為Qp-1—Qp-8;弗吉尼亞櫟(Quercus Virginiana),編號為Qv-1—Qv-4;來自美國俄勒岡州的沼生櫟(Quercus palustris),編號為Qpa-1—Qpa-4。每份材料取新鮮嫩葉,存于-70℃超低溫冰箱中待用。

1.2 基因組DNA的提取

采用CTAB法[15]提取櫟屬植物基因組DNA,改良后的方法如下:取100 mg櫟樹葉片,放入2 mL離心管中,加入鋼珠,在液氮中速凍后在研磨儀上研磨。研磨完全后加入改良的CTAB溶液[2%CTAB,100 mmol Tris-HCl(pH 8.0),20 mmol EDTA,1.4 mol NaCl,2%PVP,1%β-巰基乙醇],充分混勻,65℃水浴20 min。加入等體積的氯仿∕異戊醇(24∕1,V∕V),充分混勻后12 000 r∕min、4℃離心10 min,將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入等體積預(yù)冷的異丙醇,混勻,12 000 r∕min、4℃離心10 min,倒掉上層溶液,在有DNA沉淀的離心管中加入500μL 70%乙醇,搖晃兩下,然后12 000 r∕min 4℃離心5 min,倒掉廢液,將離心管干燥10 min以上,加入包含RNase的滅菌水(990μL滅菌水加上10μL RNase)50μL,溶解后,用1%瓊脂糖電泳檢測DNA完整性,并用紫外分光光度計檢測DNA的濃度和純度。-20℃冰箱保存待用。

1.3 SSR標記分析

PCR反應(yīng)體系為:基因組DNA 30 ng,0.5μmol引物,200μmol dNTPs,2 mmol MgCl2,1×Taq buffer、1 U Taq DNA聚合酶,總反應(yīng)體系為20μL。PCR反應(yīng)程序為:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s,51.5—55℃退火45 s,72℃延伸1 min,35個循環(huán);72℃延伸5 min;4℃保存擴增產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物先用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,篩選出有特異性條帶的PCR產(chǎn)物,再用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,恒定電壓200 V,電泳2 h。電泳結(jié)束后銀染,用相機成像保存。SSR引物序列參照Hardwood Genomics Project(https:∕∕www.hardwoodgenomics.org∕organism∕Quercus∕alba)網(wǎng)站序列,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物信息見表1。

表1 SSR分析所用的引物序列Table 1 The sequences of primers used in SSR analysis

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

根據(jù)分子量大小對各引物擴增出的等位基因進行排序,在電泳圖譜上清晰且可重復(fù)出現(xiàn)的條帶記為“1”,同一位置沒有條帶的記為“0”,建立0∕1矩陣。用NTSYS-pc 2.1軟件計算遺傳相似系數(shù),獲得相似系數(shù)矩陣。以非加權(quán)類平均法(UPGMA)進行聚類分析,構(gòu)建樹狀聚類圖。采用PopGENE 32軟件計算等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)、Nei基因多樣性指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標記的多態(tài)性分析

用24份不同種的櫟屬植物資源基因組DNA作為模板進行PCR擴增,產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測,結(jié)果顯示從44對SSR引物中篩選出13對擴增片段清晰的引物,如圖1所示,利用引物20458對24份櫟屬植物材料進行PCR擴增,其產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測可獲得清晰的條帶,并且不同材料擴增的片段大小不同。為了更好地檢測不同材料的等位基因,利用非變性聚丙烯酰胺凝膠檢測片段的差異,其中9對多態(tài)性引物擴增結(jié)果可用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。這9對引物在24份材料中共檢測到62個等位基因變異,每對引物檢測到的等位基因變異范圍為4—12個,平均每對引物檢測到6.9個等位基因。其中引物46284檢測到的等位基因最多,為12個。如圖2所示,引物38169對24份櫟屬植物樣品擴增出的條帶介于100—150 bp。各位點的平均有效等位基因為4.96,Nei多樣性指數(shù)分布范圍在0.628 5—0.891 5,平均每個位點為0.758 6,Shannon信息指數(shù)分布范圍為1.184 3—2.336 7,平均每個位點為1.635 7(表2)。

表2 24份櫟屬植物材料的遺傳多樣性Table 2 The genetic diversity of the 24 Quercus resources

圖1 SSR引物20458擴增結(jié)果Fig.1 The amplification results of primer 20458

圖2 SSR引物38169的擴增結(jié)果Fig.2 The amplification results of primer 38169

2.2 SSR標記的聚類分析

由圖3所示,24份種質(zhì)資源間遺傳相似系數(shù)的平均值為0.700 8,變化范圍為0.492 8—0.971 0,其中Qpa-4和Qp-1遺傳相似系數(shù)最低。聚類結(jié)果顯示,在遺傳相似系數(shù)0.65處,引種的櫟屬資源可以分為兩大類,第Ⅰ類為中國江蘇收集的麻櫟,第Ⅱ類為美國收集的3個種的引種資源,其中沼生櫟和弗吉尼亞櫟聚為一類,墨西哥白橡單獨聚為一類(圖4)。在遺傳相似系數(shù)0.82處,24個櫟屬資源可以清晰的分成四類。其中弗吉尼亞櫟的Qv-2和Qv-3、墨西哥白橡的Qp-5和Qp-8遺傳相似系數(shù)最高,為0.971 0。SSR標記的聚類結(jié)果和不同種的植物分類學(xué)結(jié)果基本一致,可以很好的將不同種的櫟屬資源劃分開。

圖3 24份櫟屬植物資源遺傳相似系數(shù)Fig.3 The genetic similarity co-efficient of the 24 Quercus resources

圖4 24份櫟屬植物資源SSR聚類分析Fig.4 The clustering map of the 24 Quercus resources by SSR markers

3 結(jié)論與討論

SSR分子標記具有共顯性、擴增穩(wěn)定、重復(fù)性好的特點,是常用的遺傳多樣性分析方法之一,但利用SSR標記對櫟屬植物進行遺傳多樣性分析的研究較少。徐小林等[16]利用16對SSR標記對我國栓皮櫟天然群體進行遺傳多樣性分析,發(fā)現(xiàn)平均等位基因數(shù)為8.43個,有效等位基因數(shù)平均為5.95個,平均Nei多樣性指數(shù)為0.804 1,Shannon信息指數(shù)為1.830 8。秦英英等[17]利用11對SSR標記對遼東櫟天然群體進行遺傳多樣性分析,發(fā)現(xiàn)平均等位基因數(shù)為10.27個,有效等位基因數(shù)平均為5.19個,平均Nei多樣性指數(shù)為0.752 1,Shannon信息指數(shù)為1.754 3。本研究中,9對SSR引物在24份材料中檢測到平均等位基因數(shù)為6.9個,平均有效等位基因為4.96,平均Nei多樣性指數(shù)為0.758 6,Shannon信息指數(shù)為1.635 7,說明不同種的櫟屬植物遺傳多樣性水平較高,差異較大。本研究中,平均等位基因數(shù)、平均Shannon信息指數(shù)、平均Nei多樣性指數(shù)都略低于以往的研究結(jié)果,推測是因為研究材料不同所致。

對櫟屬植物天然群體來說,較高的遺傳多樣性水平是保持群體穩(wěn)定的基礎(chǔ)。魏高明[18]利用SSR分子標記技術(shù)對蘇浙皖地區(qū)的4個櫟屬樹種,共300個個體進行遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳變異研究,結(jié)果顯示4個樹種不僅存在較高的遺傳多樣性,而且普遍具有基因漸滲現(xiàn)象。郭斌[19]利用9對SSR標記對遼東櫟、蒙古櫟、北美紅櫟和猩紅櫟進行聚類分析,發(fā)現(xiàn)北美紅櫟和猩紅櫟聚為一類,為一個混合組,這是因為櫟屬植物為風(fēng)媒異交,花粉具有很強的長距離傳播能力,種子傳播能力也很強,因此櫟屬植物在自然狀態(tài)下,種之間界限模糊,種間雜交或漸滲情況頻繁。麻櫟是中國主要的櫟屬樹種,廣泛分布于全國各地,本研究中,麻櫟單獨聚為一類,而引種自美國的3個樹種聚為一大類,這和引種母株的地理分布有關(guān)。其中,弗羅里達州的墨西哥白橡單獨聚為一亞類,弗吉尼亞櫟和沼生櫟聚為一亞類,這兩種櫟在秋季葉片變紅,而墨西哥白橡沒有這樣的性狀,與形態(tài)學(xué)結(jié)果相似。弗吉尼亞櫟在美國東南部分布較廣,為美國櫟屬植物的重要代表,它和沼生櫟生長習(xí)性及表型差異很大,推測兩個樹種之間有基因漸滲現(xiàn)象[20]。本研究中,有2份墨西哥白橡和2份弗吉尼亞櫟聚類分析沒有分開,推測是因為采用的分子標記數(shù)量不足所致。

我國對櫟屬植物的引種歷史悠久,引入中國的櫟類樹種大約20余種,在長三角地區(qū)優(yōu)選了5種北美櫟樹,這些主要集中用于引種試驗研究[21]。而對這些引種樹種進行鑒定、遺傳多樣性評價的研究還很少。本研究結(jié)果表明,在上海引種的4種櫟屬植物的遺傳多樣性較高,利用SSR分子標記用于分析櫟屬植物種間的親緣關(guān)系,方法簡單,結(jié)果可靠,研究結(jié)果可為櫟屬植物引種管理、鑒定、保護及評價提供重要依據(jù)。引種群體是由種子繁殖而來,所以種內(nèi)差異較小,用SSR標記技術(shù)進行種內(nèi)資源關(guān)系鑒定,還需要更多的有效引物。