陳 靜,李巧珍,宋春艷,章爐軍,尚曉冬,辜運(yùn)富2

(1國家食用菌工程技術(shù)研究中心,農(nóng)業(yè)部應(yīng)用真菌資源與利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所,上海 201403;2四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源學(xué)院,成都 611130)

香菇Lentinula edodes(Berk.)Pegler俗稱香蕈、花菇,屬擔(dān)子菌門傘菌綱傘菌目光茸菌科。香菇因其鮮美口味和營養(yǎng)價(jià)值,成為最受歡迎的食用菌之一,主要種植于中國、日本及其他亞洲國家[1]。烘干后的香菇含58%—60%碳水化合物、20%—23%蛋白質(zhì)、9%—10%纖維、4%—5%灰分和3%—4%脂肪[2]。國內(nèi)外學(xué)者從香菇菌絲體和子實(shí)體中分離出多種活性成分,包括多糖[3-4],蛋白質(zhì)[5-6],嘌呤[7-8]等。其中,香菇多糖因其豐富的營養(yǎng)和藥用價(jià)值受到了廣泛的關(guān)注和研究[9]。香菇多糖以β-(1→3)葡萄糖殘基為主鏈,β-(1→6)葡萄糖殘基為側(cè)鏈,單糖組成主要包括葡萄糖、甘露糖和半乳糖[10,3]。研究表明,香菇多糖具有免疫調(diào)節(jié)[11-12]、抗氧化[13-14]、抗腫瘤[15-16]、抗病毒[17,3]等活性。本研究通過對(duì)香菇多糖提取純化、生物活性及構(gòu)效關(guān)系幾個(gè)方面的研究進(jìn)行綜述,以期為香菇多糖的后續(xù)研究與開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 香菇多糖的提取純化

香菇多糖一般采取傳統(tǒng)方法,以水為溶劑,加熱提取。多糖提取率受料液比、時(shí)間、次數(shù)和溫度等因素的影響。馮賢達(dá)等[18]研究表明,多糖提取最佳工藝為料液比1∶30,提取溫度90℃,兩級(jí)錯(cuò)流提取。第1級(jí)提取60 min,第2級(jí)30 min。李博等[19]研究表明,香菇多糖熱水浸提最佳工藝為:浸提時(shí)間90 min,溫度80℃,料液比1∶45,醇析乙醇量1∶3,此條件下多糖得率為24.88%。萬閱等[20]研究表明,與傳統(tǒng)熱水浸提法比較,超聲波提取法多糖得率更高,且耗時(shí)少。Zhao等[4]采用超聲輔助多糖提取,最佳提取條件為:溫度45℃,時(shí)間21 min,超聲功率290 W,多糖得率可達(dá)9.75%,是熱水萃取的1.62倍。聶小寶等[21]發(fā)現(xiàn),與傳統(tǒng)提取方法相比,微波輔助提取具有時(shí)間短、多糖純度高、節(jié)能、操作簡單、安全、提取率高等優(yōu)點(diǎn)。程俊文等[22]結(jié)果表明,纖維素酶﹑果膠酶﹑木瓜蛋白酶的最佳提取工藝參數(shù)依次為加酶量0.8%,溫度45℃,pH 4.5,提取時(shí)間1 h;加酶量1.0%,溫度45℃,pH 3.5,提取時(shí)間2.0 h;加酶1.0%,溫度45℃,pH 4.0,提取時(shí)間1.5 h。Ke等[23]研究表明,勻漿法能夠有效地提高香菇多糖的提取效率。Li等[14]用真空技術(shù)破壁提取香菇多糖,并采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝參數(shù)。結(jié)果表明,多糖提取的最佳條件是62℃,真空0.08 MPa,1 200 r∕min攪拌25 min,料液比1∶26(V∕W)。在此條件下,多糖的得率為4.28%。Zhang等[24]采用超聲強(qiáng)化亞臨界水兩步法從香菇中提取多糖,最佳工藝條件:萃取溫度140℃,提取時(shí)間40 min,料液比1∶25(V∕W),超聲波功率190 W,該條件下多糖的提取率為17.34%。

香菇多糖基本提取溶劑有三種:酸溶液、堿溶液和水。提取的粗多糖可通過一系列技術(shù)進(jìn)一步純化,如用乙醇、乙酸、CTMAB等沉淀,過氧化氫脫色,Sevag法去除蛋白質(zhì),離子交換色譜法、凝膠過濾法和親和色譜法層析[25]。通常,離子交換色譜法用來分離中性多糖和酸性多糖[26]。香菇多糖的幾種提取方法和純化工藝見表1。

表1 香菇多糖不同提取方法和純化工藝Table 1 Identification of lentinan by different extraction method and purification procedure

2 香菇多糖的生物活性

2.1 免疫調(diào)節(jié)活性

食用菌多糖能增強(qiáng)人體免疫力,幫助宿主適應(yīng)不同的環(huán)境脅迫且無副作用,被稱為生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(Biological response modifiers,BRMs)[25,34]。香菇多糖可刺激宿主產(chǎn)生不同的效應(yīng)細(xì)胞并發(fā)揮作用,如T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,也可增加免疫細(xì)胞的吞噬能力來殺滅人體中的癌細(xì)胞,且對(duì)遷移的癌細(xì)胞也有作用。它被稱為體內(nèi)T細(xì)胞定向免疫增強(qiáng)劑、巨噬細(xì)胞抗腫瘤活性的刺激劑[35-37]。Kupfahl等[11]檢測了香菇多糖在小鼠李斯特菌感染模型中的免疫應(yīng)答作用,發(fā)現(xiàn)香菇多糖可通過增強(qiáng)CD8 T細(xì)胞的特異性來提高小鼠抗李斯特菌的作用。同時(shí),香菇多糖能促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞分化并合成抗體[38-40]。另外,Wang等[41]結(jié)果表明,無論體外還是體內(nèi),香菇多糖可以通過增強(qiáng)體腔細(xì)胞的生存能力和吞噬作用提高日本海參的非特異性免疫力。

2.2 抗腫瘤活性

1969年,Chihara從香菇中分離出香菇多糖,發(fā)現(xiàn)其可使測試小鼠腫瘤縮小80%或完全消退[42-43]。香菇多糖抗腫瘤作用的重要機(jī)制為在腫瘤部位觸發(fā)延遲型超敏反應(yīng),并誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的產(chǎn)生,如自然殺傷細(xì)胞和T細(xì)胞[44]。且香菇多糖能增強(qiáng)某些特定免疫細(xì)胞的吞噬能力,以搜索和破壞人體遷移癌細(xì)胞[45-46]。另外,香菇多糖能在體外抑制小鼠肉瘤細(xì)胞的增殖,其抑制率與分子量有關(guān)[32]。Zhang等[27]研究發(fā)現(xiàn),香菇多糖可通過線粒體途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,且對(duì)荷瘤小鼠體重和器官?zèng)]有不良影響。Zhang等[47]研究表明,香菇多糖誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是通過快速刺激活性氧的產(chǎn)生,使線粒體膜電位喪失以及細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加形成的。

2.3 抗氧化活性

抗氧化活性是天然多糖的一種常見生物活性,受原料、提取工藝和干燥方法影響[48-50]。Wang等[13]研究表明,香菇菌絲體多糖具有抗氧化活性,可降低衰老風(fēng)險(xiǎn)。不同提取方法獲得的多糖不僅具有不同的化學(xué)成分和構(gòu)象,而且抗氧化活性也不同。Chen等[51]用熱水從香菇子實(shí)體中提取粗多糖LEP(Lentinus edodespolysaccharide),經(jīng)DEAE-瓊脂糖凝膠CL-6B層析純化得到三種多糖組分,其中,LEPC1具有明顯的濃度依賴性抗氧化活性。Zhang等[24]采用超聲強(qiáng)化亞臨界水萃取法(Ultrasonic enhanced subcritical water extraction,USWE)從香菇中提取多糖,通過DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical)自由基清除法評(píng)價(jià)其抗氧化活性,并與亞臨界水萃取(Subcritical water extraction,SWE)、超聲波萃取(Ultrasonic extraction,UE)、熱水萃取(Hot water extraction,HWE)多糖樣品進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)USWE樣品的抗氧化活性最高。與傳統(tǒng)熱水萃取法相比,動(dòng)態(tài)超高壓微射流技術(shù)(Dynamic high pressure microfluidization,DHPM)輔助萃取香菇多糖對(duì)羥基自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基和亞硝酸鹽的清除能力更強(qiáng)。香菇多糖的抗氧化能力還與其分子量有關(guān),低分子量組分具有較高的抗氧化能力,而高分子量組分具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性[33,52-53]。

2.4 抗病毒活性

一般來說,抗病毒化合物抑制甚至殺死病毒主要通過三種方式:第一,直接接觸并殺死病毒;第二,防止病毒吸附滲透到宿主細(xì)胞;第三,阻礙病毒復(fù)制和生物合成或抑制病毒組裝、成熟和釋放[54]。香菇多糖在體外對(duì)傳染性造血器官壞死病病毒表現(xiàn)出一定程度的直接滅活作用[55],其機(jī)制可能與穩(wěn)定的病毒-多糖復(fù)合物占據(jù)病毒包膜上的位點(diǎn)有關(guān)[56-59]。香菇多糖具有抗人體免疫缺陷病毒和單純皰疹1型病毒作用[60-61],且具有較強(qiáng)的體外抗乙型肝炎病毒活性[4]。香菇多糖能抑制1型脊髓灰質(zhì)炎病毒和1型牛皰疹病毒的復(fù)制[17]。此外,香菇多糖可以選擇性地與細(xì)胞表面受體結(jié)合,進(jìn)一步抑制病毒在細(xì)胞中的侵襲[55,62]。Ren等[3]從香菇菌絲體中提取了一種具有抗病毒活性的多糖,其通過調(diào)節(jié)機(jī)體的先天免疫和特異性免疫來實(shí)現(xiàn)直接滅活病毒和抑制病毒復(fù)制。

3 香菇多糖的構(gòu)效關(guān)系

香菇多糖的初級(jí)結(jié)構(gòu)以(1→3)-β-D-葡萄糖殘基為主鏈,每5個(gè)葡萄糖有2個(gè)(1→6)葡萄糖殘基支鏈,支鏈由(1→6)-β-D-和(1→3)-β-D-葡萄糖殘基組成,也含有少數(shù)內(nèi)部β-(1→6)鍵[63]。Maeda等[64]利用光散射測定的香菇多糖的平均分子量為950—1 050 ku,Suzuki等[65]通過凝膠滲透色譜和準(zhǔn)彈性光散射測定的香菇多糖的分子量為300—800 ku[65]。Zhang等[66]采用超聲輻照法獲得了304—1 832 ku不同分子量的香菇多糖。

3.1 結(jié)構(gòu)與生物活性的關(guān)系

多糖由一定數(shù)量的單糖殘基組成。多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)是通過單糖殘基位置、糖鏈的位置以及單糖殘基的序列來確定的[38]。對(duì)食用菌來說,主鏈由β-(1→3)連接且有β-(1→6)分支的葡聚糖結(jié)構(gòu),具有抗腫瘤活性,主鏈由(1→6)連接的β葡聚糖活性較低,高分子量葡聚糖比低分子量葡聚糖活性高[67-69]。當(dāng)香菇多糖經(jīng)二甲基亞砜、尿素或氫氧化鈉處理后,其三級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞,隨著變性程度的加深,抗腫瘤活性降低[70]。另外,研究發(fā)現(xiàn),主鏈的分支度也是影響其活性的因素。一般來說,活性最強(qiáng)的聚合物的分支度在20%—33%[38]。Bae等[71]研究發(fā)現(xiàn),多糖去分支可以提高其生物活性,當(dāng)香菇多糖的分支度為32%時(shí),免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性最大。

藥用食用菌免疫刺激活性不僅來源于生物活性多糖,還可通過多糖-蛋白復(fù)合物產(chǎn)生。螺旋葡聚糖可附著在某些蛋白上形成復(fù)合物,進(jìn)而刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生抗體[72]。研究表明,當(dāng)β葡聚糖與蛋白質(zhì)以復(fù)合物形態(tài)存在時(shí),其生物效率得到提升[73]。香菇多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物在體內(nèi)比未結(jié)合蛋白的多糖具有更高的抗腫瘤活性,且進(jìn)一步分離蛋白后的香菇多糖無抗腫瘤活性[74-76]。這表明多糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度與其免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性的強(qiáng)弱有關(guān)。

3.2 分子量與生物活性的關(guān)系

多糖是天然高分子多聚物,分子量的高低是影響其生物活性的重要因素。分子量過低,多糖不能形成具有活性的聚合結(jié)構(gòu),而過高則不利于多糖進(jìn)入生物體內(nèi)[77]。眾所周知,香菇多糖的分子量與免疫增強(qiáng)活性密切相關(guān)[28,78]。相對(duì)分子質(zhì)量高的香菇多糖比相對(duì)分子質(zhì)量低的具有更強(qiáng)的抗病毒活性[4]。這可能與其和免疫細(xì)胞碳水化合物受體的親和力不同有關(guān)[79]。分子量為400—600 ku的香菇多糖具有多種生物活性,如抗腫瘤(纖維肉瘤)、抗病毒(新城疫病毒)、刺激細(xì)胞因子表達(dá)等[26,1]。Ren等[3]研究發(fā)現(xiàn),合適分子量的多糖能夠保證自身輕易通過組織屏障進(jìn)入細(xì)胞,極大地提高了其抑制病毒復(fù)制的生物學(xué)效率。Qian等[33]研究發(fā)現(xiàn),分子量最高的香菇多糖的抗腫瘤活性較差,可能是因?yàn)橄愎蕉嗵堑捏w積太大,無法進(jìn)入細(xì)胞所致。而分子量較高的香菇多糖對(duì)體外培養(yǎng)的人原位胰腺腺癌細(xì)胞和人宮頸癌細(xì)胞均有較高的抑制作用。Wang等[29]研究也發(fā)現(xiàn),高分子量多糖的抗腫瘤作用強(qiáng)于低分子量多糖。高分子量多糖在各濃度水平上具有較高的腫瘤抑制率,而且表現(xiàn)良好。

4 總結(jié)與展望

香菇多糖是一類結(jié)構(gòu)多樣的大分子聚合物,其單糖組分通過糖苷鍵相互連接,不同的連接位點(diǎn),會(huì)形成多種多樣的分支結(jié)構(gòu)或線性結(jié)構(gòu)。隨著香菇全基因組測序的完成,學(xué)者們已經(jīng)開始從分子水平上揭示香菇多糖代謝調(diào)控機(jī)制,但其多糖合成的代謝途徑還難以解析。目前,香菇多糖主要靠從香菇子實(shí)體或菌絲體中分離純化,提取分離步驟復(fù)雜、得率低、質(zhì)量難以控制,無法滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。為提高香菇多糖得率,不僅可以采用新型技術(shù)輔助提取香菇多糖,而且可以通過遺傳育種手段提高香菇菌種多糖含量,包括紫外誘變[80-81]、氮離子誘變[82]、紫外誘變結(jié)合雜交育種[83]等。如何將新技術(shù)與遺傳育種研究成果更好地應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中,需要結(jié)合實(shí)際情況做更多的研究和轉(zhuǎn)化工作。

香菇多糖具有多種藥效,包括免疫刺激[12]、抗腫瘤[16]、抗感染[84]和抗炎[85]等。但是,要提高其水溶性、口服后滲透腸道黏膜的能力及臨床療效,還需要與化學(xué)修飾、納米生物技術(shù)、靶向治療和免疫治療等新興技術(shù)相結(jié)合,開展相關(guān)的臨床試驗(yàn)。另外,雖然香菇多糖具有多種生理活性,但是其結(jié)構(gòu)復(fù)雜,均一多糖獲取困難,而且不同材料不同提取方法獲得的多糖在結(jié)構(gòu)和活性上存在差異,缺乏對(duì)其構(gòu)效關(guān)系的完整認(rèn)識(shí)。而要闡明多糖的構(gòu)效關(guān)系,則要通過生物、化學(xué)、計(jì)算機(jī)等手段,將各種儀器方法確定的基本結(jié)構(gòu)參數(shù)和活性參數(shù)集合起來。