邢 煒，洪 豆，徐碧林，王 政，劉 暢，范 霞，鄭永良，呂銳玲

（黃岡師范學院 生物與農(nóng)業(yè)資源學院，湖北 黃岡 438000）

靈芝（Ganoderma lucidum Karst）隸屬多孔菌科（Polyporaceae）靈芝屬 （Ganodermae）[1]。靈芝是我國傳統(tǒng)名貴中藥，素有“仙草”的美譽。具有免疫調(diào)節(jié)[2]、抗氧化與延緩衰老[3]、抗糖尿病[4]、延長睡眠時間[5]、神經(jīng)保護[6]、保護酒精誘導的肝損傷[7]，以及治療癌癥[8]等諸多作用。近年來隨著“健康中國”上升為國家戰(zhàn)略，我國大健康產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展。靈芝作為大健康產(chǎn)業(yè)中具有悠久文化歷史的藥用真菌，其相關的基礎研究仍然非常薄弱[9]，其分類的混亂在很大程度上阻礙了靈芝基礎研究的發(fā)展。黃岡大別山世界地質(zhì)公園位于大別山南麓，是中國中央山系地質(zhì)、地理、生態(tài)、氣候分界線的重要組成部分。也是中國重要的生物基因庫，是生物多樣性、豐富性、珍稀性和典型性最具代表的區(qū)域之一[10]。

通過對黃岡大別山采集野生靈芝子實體進行形態(tài)學及18S rDNA分子鑒定，經(jīng)馴化后進行小面積制種。在加強野生靈芝資源研究和保護的基礎上，對野生靈芝資源進行馴化和種質(zhì)資源的開發(fā)，培育適合當?shù)貧夂虻撵`芝品種，為靈芝的基礎研究和生產(chǎn)推廣提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1．1．1 供試菌株

從黃岡大別山國家地質(zhì)公園內(nèi)蘄春縣株林鎮(zhèn)姑娘山 （東經(jīng) 115°29′825″，北緯 30°19′521″，海拔52．202 m）采集到野生靈芝子實體，經(jīng)組織分離獲得菌株HZ1。對照菌株靈芝G10和韓芝購買于華中農(nóng)業(yè)大學菌種中心。

1．1．2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：土豆200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g，加水至1 L。土豆煮沸過濾再加入葡萄糖、瓊脂定容至1 L。培養(yǎng)基121℃滅菌30 min，用于原種分離及活化菌株。

PDB培養(yǎng)基：PDA固體培養(yǎng)基不加入瓊脂。主要用于收集菌絲。

原種、栽培種配方為A：櫟木屑80%、麥麩13%、玉米5%、糖1%、石膏粉1%；B：桑木屑80%、麥麩13%、玉米5%、糖1%、石膏粉1%；C：櫟木屑58%、棉籽殼32%、麩皮8%、石膏粉1%、石灰0．5%、過磷酸鈣0．5%；D：桑木屑58%、棉籽殼32%、麩皮8%、石膏粉1%、石灰0．5%、過磷酸鈣0．5%。水適量（拌好的料中含水量約為60%），pH 5～6，原種培養(yǎng)料用650 mL菌種瓶裝料滅菌，栽培種培養(yǎng)料用聚丙烯塑料袋（33 cm×17 cm×0．005 cm）裝料滅菌。上述培養(yǎng)料均需121℃，滅菌2 h。

1.2 試劑與儀器

真菌基因組DNA快速抽提試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司；熊果酸標準品，中國藥檢所；α-淀粉酶（BR級），上海源葉生物科技有限公司；高氯酸、冰醋酸、香草醛、三氯甲烷、苯酚、硼酸銨均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

752C可見紫外分光光度計，上海譜元儀器有限公司；DHZ-C智能恒溫搖床，太倉實驗設備廠；RE-52A旋轉蒸發(fā)儀、SHZ-95循環(huán)水式多用真空泵，鞏義英峪予華儀器廠。

1.3 試驗方法

1．3．1 形態(tài)學鑒定

根據(jù)參考文獻[11-12]對野生靈芝子實體形態(tài)特征進行鑒定。

1．3．2 菌株分離及保存

采用組織分離法，選取幼嫩未散粉野生靈芝子實體，將菌蓋與菌柄部分用手術刀切成0．5 cm3小塊，經(jīng)75%酒精消毒10 s，無菌水清洗3遍后，接種于直徑90 mm PDA平板上（25℃，黑暗，3 d），挑取子實體小塊周圍萌發(fā)的菌絲，獲得純培養(yǎng)菌株HZ1。將菌株HZ1接種于試管斜面上，待斜面長滿后置于4℃冰箱保存。

1．3．3 菌株HZ1的18S rDNA分子鑒定

采用真菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取DNA，提取的DNA進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，后采用真菌通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和 ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）進行PCR擴增，引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。擴增條件為94℃預變性3min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳，PCR產(chǎn)物交由武漢華大基因科技有限公司進行測序，所測得18S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫進行Blast比對，采用軟件MEGA 7．0對所測18S rDNA序列進行比對、Neighbor Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1．3．4 靈芝菌株HZ1原種培養(yǎng)料的篩選

采用常規(guī)制備食用菌栽培種的方法[13]，木屑進行粉碎處理，木屑、棉籽殼、玉米粉和麩皮拌料前提前預濕3 h。已滅菌原種栽培料冷卻至約30℃進行無菌接種，室溫培養(yǎng)，培養(yǎng)期間及時檢查污染狀況和記錄生長情況。培養(yǎng)料配方A、配方B、配方C和配方D各接種30瓶。

1．3．5 靈芝菌株HZ1有效活性成分的測定

將PDA培養(yǎng)基上活化好的菌株（28℃，5 d）沿菌落邊緣用直徑6mm的打孔器打取10個菌餅接入裝有100 mL PDB液體培養(yǎng)基的250 mL的搖瓶中，28℃，100 r·min-1搖床培養(yǎng)7 d，將液體菌絲在無菌條件下勻漿20 s，取4mL菌絲碎片轉接入新的PDB液體培養(yǎng)基，28℃，100 r·min-1搖床培養(yǎng)7 d，用漏斗和濾紙過濾菌絲，烘干至恒重后進行有效活性成分的提取和測定。

1）菌絲體胞內(nèi)多糖提取

菌絲體胞內(nèi)多糖提取采取水提法[14]進行。取烘干磨碎的靈芝菌絲體1．0 g，加30倍體積的蒸餾水，于90℃下浸提1．5 h，以轉速10 000 r·min-1離心20 min，取上清液Ⅰ，沉淀加30倍體積的蒸餾水再次浸提 1．5 h，10 000 r·min-1離心 20 min，取上清液Ⅱ，將沉淀烘干；上清液Ⅰ和上清液Ⅱ合并，加入2 mg的α-淀粉酶 60℃酶解1 h，加水定容至100mL，用吸管準確吸取10mL，加入40mL無水乙醇混勻，4℃醇沉12 h，以轉速5 000 r·min-1離心5min，沉淀用80%乙醇潤洗3次，60℃烘干得多糖粗樣品。

2）胞外多糖分離和提取

將菌絲PDB液體培養(yǎng)后過濾所得發(fā)酵液100 mL中加入 2 mgα-淀粉酶 60℃酶解1 h）用同樣方法[14]測定胞外多糖含量。

3）靈芝菌絲體蛋白質(zhì)含量測定

靈芝菌絲體蛋白質(zhì)含量測定參照參考文獻[15]。

4）靈芝菌絲體總三萜含量的測定

靈芝菌絲體總三萜含量的測定參照參考文獻[16]。

1．3．6 靈芝菌株HZ1農(nóng)藝性狀的測定

根據(jù)1．3．4的栽培配方篩選結果，選擇最適合靈芝菌絲生長的培養(yǎng)料栽培配方裝袋50袋，滅菌接種后置于室溫培養(yǎng)。7 d后測定菌絲生長速度，待子實體成熟后開始測量不同品種靈芝菌蓋的直徑、顏色，菌柄的長度、直徑、顏色等性狀。計算不同品種的鮮品產(chǎn)量。

2 結果與分析

2.1 野生靈芝的形態(tài)學鑒定

研究從黃岡大別山國家地質(zhì)公園蘄春株林鎮(zhèn)姑娘山采集的野生靈芝子實體的生境及其形態(tài)特征見圖1。

圖1 野生靈芝生長環(huán)境及子實體Fig．1 Fruitbodies and growing environmentof awild Ganoderma lingzhi

由圖1可知，其地面植被為板栗樹、櫟木等闊葉落葉樹種及灌木叢、蕨類等，子實體生長在落葉櫟木伐樁上。靈芝子實體近圓形，菌蓋肥大，輪紋明顯，直徑 5．3 cm～15．6 cm，厚 1．2 cm～1．8 cm；菌柄紅褐色，粗壯有光澤，側生，長度5 cm～15 cm，直徑1．2 cm～2．8 cm，幼芝菌蓋呈扇形，邊緣白色厚實，菌肉白色。根據(jù)形態(tài)初步鑒定其為多孔菌科靈芝屬真菌。

2.2 野生靈芝的分離

野生靈芝經(jīng)分離后菌落特征見圖2。

圖2 菌株HZ1菌落形態(tài)Fig．2 Colony morphology of strain HZ1

由圖2可知，經(jīng)分離獲得的野生靈芝菌株HZ1在PDA培養(yǎng)基中菌落圓形，偶爾會出現(xiàn)羽毛狀，菌絲白色，生長到后期菌落中心部位菌絲微發(fā)黃，分離獲得的菌株用試管斜面保存于4℃冰箱。

2.3 菌株HZ1 18S rDNA分子鑒定

經(jīng)PCR擴增和凝膠電泳檢測，獲得18S rDNA序列片段616 bp，測序結果在GenBank中進行Blast比對，構建的分子系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。

圖3 靈芝ITS序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogentic tree constructed by Ganodermaspp.based on ITS sequences

由圖3結果表明，菌株HZ1與靈芝屬Ganoderma lingzhi物種聚于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一支，自展支持率100%。結合形態(tài)學鑒定結果，推定菌株HZ1為Ganoderma lingzhi。

2.4 菌株HZ1原種最適培養(yǎng)料配方的篩選

不同原種培養(yǎng)基對菌絲生長發(fā)育的影響結果見表1。

表1 不同原種培養(yǎng)基對菌絲生長發(fā)育的影響Tab.1 Mycelial growth and development on different mother spawn substrate

從表1可知，菌株HZ1菌絲在原種瓶中萌發(fā)和封口時間最早的是配方A和配方B，分別為2 d和5 d；滿瓶時間最早是配方B，其他時間順序依次為配方A（42 d）、配方C（45 d）和配方D（48 d）；配方A菌絲生長濃密、潔白、粗壯，菌絲密度高，生長勢良好。配方B的菌絲滿瓶時間最短，且極少有氣生菌絲，生長勢強，菌絲白色，但菌絲比配方A和配方C稀疏。配方C菌絲濃密、潔白、粗壯，菌絲密度高，生長勢最強。配方D菌絲生長稀疏、發(fā)黃，菌絲密度稀薄、不均勻，生長勢較配方A、配方B和配方C差。配方A和配方B有菌皮，配方C和配方D無菌皮。綜合以上特征，菌絲生長最好的是配方C。

2.5 菌株HZ1活性成分含量測定

不同菌株靈芝活性成分含量見表2。

表2 不同靈芝活性成分含量比較Tab.2 Comparison of the active components of different kinds of Ganoderma lingzhi

由表2可知，菌株HZ1多糖含量0.703mg·mL-1，比對照菌株靈芝G10和韓芝含量高（P<0.01）；菌株靈芝G10蛋白質(zhì)含量最高（0.085 mg·mL-1），其次為菌株韓芝（0.072 mg·mL-1），菌株HZ1的蛋白質(zhì)含量達到0.069mg·mL-1，與對照菌株韓芝蛋白質(zhì)含量差異不顯著。菌株HZ1的總三萜含量0.786mg·mL-1，比對照菌株靈芝G10含量高（P<0.01）。但綜合靈芝多糖、蛋白質(zhì)和總三萜的總含量，菌株HZ1的總有效活性成分含量高于對照菌株靈芝G10和韓芝。

2.6 菌株HZ1與本地栽培品種農(nóng)藝性狀的對比試驗

不同靈芝菌株栽培情況統(tǒng)計見表3。

表3 不同靈芝菌株農(nóng)藝性狀比較Tab.3 Comparison of the agronomic traits of different kinds of Ganoderma lingzhi

由表3可以看出，菌株HZ1菌絲平均生長速度比對照菌株靈芝G10和韓芝生長速度快（P<0.01），較適宜黃岡本地的氣候條件；菌株HZ1的菌蓋直徑可達20 mm，幼菇顏色淡黃；菌株HZ1的菌柄長度為40 mm，菌柄直徑約17 mm，顏色為紅褐色，每袋可產(chǎn)靈芝鮮菇298 g，比對照菌株靈芝G10和韓芝產(chǎn)量高（P<0.01）。因此，菌株HZ1綜合農(nóng)藝性狀良好，具有一定的潛在的商業(yè)推廣價值。

3 討論與結論

靈芝物種在我國分布廣泛。吳國華等[17]從浙江龍泉森林中獲得了8株野生靈芝菌株，對具有生長優(yōu)勢的菌株LQ06通過形態(tài)學和ITS序列分析，確定為靈芝屬靈芝（Ganoderma lingzhi），并對菌株LQ06進行林下椴木栽培，發(fā)現(xiàn)菌株LQ06栽培表現(xiàn)優(yōu)良。金鑫等[18]分別對采集于海南島的3株野生靈芝進行形態(tài)和分子鑒定，并對子實體多糖的單糖組分和抗氧化活性進行了分析，3株靈芝分別為紫芝（G.sinense）、南方靈芝（G.australe）、無柄紫靈芝（G.mastoporum）；3株靈芝多糖的單糖組成和摩爾比存在一定的差異。張焱珍等[19]從云南臨滄的野生靈芝子實體中分離純化獲得純培養(yǎng)物YAASM4672，結合形態(tài)學與ITS序列分析鑒定為靈芝（G.lingzhi），并設計了9種栽培種培養(yǎng)基，測定其栽培特性，結果表明該菌在2號栽培種配方（78%玉米芯、18%米糠、2%高粱粉、1%石膏粉、1%白砂糖）中菌絲生長和子實體農(nóng)藝性狀（覆土組優(yōu)于露地組）表現(xiàn)最好。趙麗麗等[20]從南平市順昌縣分離獲得一株野生靈芝，經(jīng)生物學特性比較和ITS測序后鑒定為彎柄靈芝（G.flexipes）。解凡等[21]對采自福建的3株野生靈芝進行鑒定，結果為重傘靈芝（G.multipileum）。

靈芝作為一種藥用真菌，活性成分一直備受關注。李亞晗等[22]報道，靈芝多糖的抗癌作用主要通過免疫調(diào)節(jié)、抗增殖、促凋亡、抗轉移和抗血管生成。黃晗等[23]報道，靈芝多糖能夠通過抑制TLR4/NF-κB信號通路，從而減輕膿毒癥大鼠炎癥反應并保護肺功能。亓小妮等[24]報道，靈芝三萜具有抗腫瘤、保肝護肝和增強免疫等生理功能，目前已經(jīng)成為評價靈芝產(chǎn)品質(zhì)量的重要指標之一。研究從大別山上分離得到野生靈芝1株，經(jīng)室內(nèi)馴化研究發(fā)現(xiàn)，活性物質(zhì)靈芝多糖、蛋白質(zhì)和總三萜的總含量比對照高，田間的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)也良好，可為靈芝商品化推廣提供菌種資源。