李 靜， 曹 宇， 馮永美， 郭遠(yuǎn)強(qiáng)， 蔣 貝， 王春妍

1 天津醫(yī)科大學(xué) 研究生院， 天津 300192； 2 天津市第二人民醫(yī)院 a.科研室， b.肝病科， 天津 300192；3 南開(kāi)大學(xué) 藥學(xué)院， 天津 300192

HBV感染仍然是一個(gè)嚴(yán)峻的全球性的健康問(wèn)題，是導(dǎo)致肝衰竭、肝硬化、肝細(xì)胞癌(HCC)的重要危險(xiǎn)因素。乙型肝炎病情的慢性化以及進(jìn)展主要與HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)有關(guān)[1]。血清中的HBV RNA主要是3.5 kb的HBV RNA preC mRNA和pgRNA，其本質(zhì)是前基因組RNA，只能轉(zhuǎn)錄自cccDNA[2-3]。Giersch等[4]研究證明pgRNA與cccDNA存在強(qiáng)相關(guān)性。HBV pgRNA可以反映肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA 的真實(shí)存在水平和轉(zhuǎn)錄活性[4-5]。HBV pgRNA的水平受核苷(酸)類(lèi)似物(NAs)的影響較小，在長(zhǎng)期接受抗病毒藥物治療患者的臨床檢測(cè)中更具有指導(dǎo)意義。Halgand等[6]研究提示pgRNA是病毒復(fù)制和預(yù)后的敏感標(biāo)志物。故此，本研究擬針對(duì)HBV相關(guān)HCC患者長(zhǎng)期應(yīng)用NAs治療后，高敏HBV DNA低于檢測(cè)下限，進(jìn)行HBV RNA檢測(cè)水平及意義分析，以期尋找長(zhǎng)期NAs抗病毒治療，HBV DNA低于檢測(cè)下限，疾病進(jìn)展可能原因。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2019年6月—2020年8月天津市第二人民醫(yī)院收治的HBV相關(guān)HCC患者。所有病例診斷均符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2019年版)》[7]，至少2年NAs抗病毒治療，至少2次間隔3個(gè)月經(jīng)羅氏試劑檢測(cè)高敏HBV DNA檢測(cè)小于20 IU/mL，排除其他肝炎病毒、酒精性肝炎、自身免疫性肝病、遺傳代謝性肝病所致肝癌患者。所有HCC患者均經(jīng)過(guò)手術(shù)切除、消融、介入或分子靶向藥物治療，再次或反復(fù)出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)或新發(fā)。

1.2 檢測(cè)方法 HBV DNA定量檢測(cè)試劑購(gòu)自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司，檢測(cè)采用熒光定量PCR法，檢測(cè)下限為20 IU/mL。HBV RNA定量檢測(cè)試劑購(gòu)自中國(guó)湖南圣湘生物科技有限公司，檢測(cè)下限為100 IU/mL。HBV血清標(biāo)志物采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，試劑購(gòu)自雅培醫(yī)療(上海)有限公司。肝功能檢測(cè)使用日本日立7180自動(dòng)生化儀。

1.3 倫理學(xué)審查 本研究經(jīng)天津市第二人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批號(hào)：津二人民倫審字[2018]15號(hào)。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 共納入患者60例，其中男47例，女13例，年齡32～79歲(表1)。

表1 入組患者一般資料

2.2 AFP不同水平HBV RNA定量比較 根據(jù)AFP水平不同，分為AFP陽(yáng)性組及AFP陰性組，兩組HBV RNA水平分別為0(0～3.57)、0(0～2.00)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-1.474，P=0.141)。

2.3 BCLC不同分期HBV RNA定量比較 根據(jù)BCLC分期不同，分為BCLC A期、B+C+D期，兩組HBV RNA水平分別為0(0～2.0)、0(0～2.0)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-0.607，P=0.544)。

2.4 HBeAg不同水平HBV RNA定量比較 根據(jù)HBeAg水平不同，分為HBeAg陽(yáng)性組和HBeAg陰性組，兩組HBV RNA水平分別為2.99(0～4.80)、0(0～0.50)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-3.400，P=0.001)。

2.5 HBsAg不同水平HBV RNA定量比較 根據(jù)HBsAg水平不同，分為A、B、C 3組，分別為HBsAg≤100 IU/mL、100 IU/mL

2.6 相關(guān)分析 分別以年齡、ALT、AST、GGT、ALP、HBsAg、HBeAg、AFP值作為自變量，血清中HBV RNA水平作為因變量，進(jìn)行相關(guān)分析， HBsAg滴度與HBV RNA水平相關(guān)(r=0.292，P<0.05),其余無(wú)相關(guān)性(P值均>0.05)。

3 討論

NAs對(duì)cccDNA無(wú)直接抑制和清除作用[8]，即使能快速有效抑制HBV DNA低至檢測(cè)下限，肝臟中存在的cccDNA仍在影響病毒的復(fù)制[9]，使得NAs長(zhǎng)期治療的患者仍有一部分會(huì)發(fā)展至終末期肝病，甚至肝癌[10]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在60例HBV相關(guān)HCC經(jīng)長(zhǎng)期抗病毒治療患者中，HBV RNA檢測(cè)陽(yáng)性者9例，占比15%。提示在HBV DNA低于檢測(cè)下限后，仍存在部分患者HBV RNA陽(yáng)性，應(yīng)進(jìn)一步追求血清中HBV RNA低于檢測(cè)下限作為病毒學(xué)應(yīng)答指標(biāo)。

HBeAg是由C區(qū)的前C基因編碼而來(lái)，HBeAg陽(yáng)性通常被認(rèn)為具有高感染性。本研究入組HBeAg陰性患者46例，HBV RNA陽(yáng)性2例(4.3%)；HBeAg陽(yáng)性患者14例，HBV RNA陽(yáng)性7例(50.0%)，且HBV RNA水平更高(Z=-3.400，P=0.001),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但Pearson相關(guān)分析提示，HBV RNA水平與HBeAg水平?jīng)]有相關(guān)性。分析HCC患者已處于肝病終末期，經(jīng)長(zhǎng)期抗病毒治療后，HBV DNA定量低于檢測(cè)下限，大多數(shù)患者已出現(xiàn)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換；或者可能出現(xiàn)PreC區(qū)和基本核心啟動(dòng)子區(qū)頻繁突變，HBeAg減少或完全喪失，故此HBeAg滴度高低可能與HBV RNA水平無(wú)明顯相關(guān)性。

HBsAg是HBV感染的傳統(tǒng)血清學(xué)標(biāo)志物，HBsAg陰轉(zhuǎn)被認(rèn)為臨床治愈[8]。HBsAg的持續(xù)存在是慢性乙型肝炎患者發(fā)展為肝硬化和HCC的危險(xiǎn)因素。當(dāng)血清中HBV DNA低于檢測(cè)下限時(shí)，HBsAg完全由cccDNA編碼而來(lái)，而HBV RNA為cccDNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。故此，本研究深入分析HBV RNA水平與HBsAg之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)不同HBsAg組間HBV RNA定量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Pearson相關(guān)分析提示，HBV RNA滴度與HBsAg水平具有相關(guān)性(r=0.292，P<0.05)。血清HBsAg滴度越高，HBV RNA水平越高，肝內(nèi)cccDNA水平高，預(yù)示病毒轉(zhuǎn)錄狀態(tài)活躍，可能更易出現(xiàn)腫瘤，病情進(jìn)展。

本研究也發(fā)現(xiàn)，AFP水平與HBV RNA水平無(wú)關(guān)。HCC早期患者與其他各期相比，HBV RNA水平?jīng)]有差異，提示HBV RNA水平對(duì)于HCC的診斷及疾病所處狀態(tài)沒(méi)有預(yù)測(cè)價(jià)值。

由于HBV RNA檢測(cè)在臨床中尚未廣泛應(yīng)用，檢測(cè)試劑尚未標(biāo)準(zhǔn)化，本研究尚存在一定的局限性。后續(xù)研究擬入組初次發(fā)現(xiàn)肝臟腫瘤患者，經(jīng)過(guò)根治治療，隨訪2～3年，以觀察HCC患者生存期、腫瘤復(fù)發(fā)/新發(fā)與HBV RNA之間的關(guān)系。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開(kāi)研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：李靜負(fù)責(zé)收集整理資料，撰寫(xiě)論文；曹宇負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)操作；馮永美負(fù)責(zé)統(tǒng)計(jì)分析；蔣貝負(fù)責(zé)患者入組及篩選；郭遠(yuǎn)強(qiáng)負(fù)責(zé)分析、解釋數(shù)據(jù)；王春妍負(fù)責(zé)指導(dǎo)撰寫(xiě)文章，修改論文。