王 戰(zhàn)， 王 麟， 姚 遠(yuǎn)， 劉 靜， 孫桂榮， 劉明軍

青島大學(xué)附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 山東 青島 266003

原發(fā)性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis, PBC)是一種慢性的、膽汁淤積性的自身免疫性肝病[1-2]?；颊咴诩膊≡缙谕鶝](méi)有明顯的臨床癥狀，診斷主要依靠血清膽汁淤積相關(guān)指標(biāo)以及自身抗體的檢測(cè)，由于出血和感染的風(fēng)險(xiǎn)，肝活檢目前并不是PBC的常規(guī)診斷方法[3-4]。自身抗體作為一種相對(duì)無(wú)創(chuàng)的檢測(cè)方法，具有較高的敏感度和特異度，在PBC的早期診斷中具有重要意義[5-6]。抗線粒體抗體(antimitochondrial antibody，AMA)是PBC的特征性自身抗體。AMA包括9種亞型，其中AMA-M2亞型是診斷PBC最有意義的自身抗體[7]。除AMA-M2外，約1/3的PBC患者血清中可檢測(cè)到核膜型或核點(diǎn)型的抗核抗體，如抗核孔膜蛋白抗體(gp210抗體)或抗核體蛋白抗體(sp100抗體)[3,8-9]。2017年歐洲肝病學(xué)會(huì)指南指出gp210抗體與sp100抗體對(duì)診斷AMA陰性的PBC患者具有較好的輔助作用[10]。因gp210抗體與sp100抗體對(duì)PBC的診斷特異度較高，可作為一種可靠的血清標(biāo)志物，減少肝活檢的必要性[5]。

目前，我國(guó)檢測(cè)PBC相關(guān)自身抗體的主要方法為間接免疫熒光法(indirect immunofluorescence,IIF)與免疫印跡法(immunoblotting test,IBT)。上述兩種方法均為定性檢測(cè)，具有耗時(shí)長(zhǎng)，操作繁瑣的缺點(diǎn)，其結(jié)果依賴于操作者的臨床經(jīng)驗(yàn)及技術(shù)水平，具有較高的主觀性[11]。隨著實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，多重微球流式熒光免疫技術(shù)(multiplex bead-based flow fluorescent immunoassay，MBFFI)，作為一種新型的自身抗體檢測(cè)技術(shù)，以熒光編碼微球?yàn)楹诵?，能夠?qū)崿F(xiàn)自身抗體的高通量、快速和定量檢測(cè)[12]，對(duì)疾病的診斷與病情評(píng)估具有重要意義。本研究將MBFFI定量檢測(cè)AMA-M2、gp210、sp100 3種自身抗體的結(jié)果與IBT進(jìn)行比較，進(jìn)一步評(píng)估其對(duì)PBC的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2018年8月—2020年6月于本院就診并臨床確診的PBC患者340例(PBC組)，同時(shí)選取自身免疫性肝炎(AIH)患者81例與系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者62例作為其他疾病組。健康對(duì)照組選自于本院的健康體檢者117例。PBC診斷依據(jù)2017年歐洲肝病學(xué)會(huì)臨床實(shí)踐指南[4]相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)：(1)成年膽汁淤積的患者血清ALP水平升高，AMA滴度>1∶40；(2)AMA陰性患者血清中可檢測(cè)到特異性抗核抗體(核點(diǎn)型或核膜型)；(3)除非患者缺乏PBC特異性自身抗體或合并AIH、非酒精性脂肪性肝病和其他全身性疾病，否則不建議用肝活檢進(jìn)行診斷。AIH診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2019 年美國(guó)肝病學(xué)會(huì)實(shí)踐指引和指南[13]：AIH 的診斷需要符合本病特點(diǎn)的肝組織學(xué)檢查結(jié)果支持，并符合以下特征，(1)血清轉(zhuǎn)氨酶水平升高；(2)血清IgG水平升高和/或一種或多種自身抗體陽(yáng)性；(3)排除其他可導(dǎo)致慢性肝炎的病因，病毒性、遺傳性、代謝性、膽汁淤積性，以及藥物可能誘發(fā)類似AIH的疾病。SLE診斷依據(jù)2012系統(tǒng)性狼瘡國(guó)際協(xié)作組的分類標(biāo)準(zhǔn)[14]，臨床標(biāo)準(zhǔn)包括：急性皮膚性紅斑狼瘡、慢性皮膚性紅斑狼瘡、口腔潰瘍、非瘢痕性脫發(fā)、滑膜炎或關(guān)節(jié)觸痛和晨僵、腎臟受累、神經(jīng)系統(tǒng)受累、溶血性貧血、白細(xì)胞或淋巴細(xì)胞減少、血小板減少；免疫學(xué)標(biāo)準(zhǔn)包括: 抗核抗體陽(yáng)性，抗dsDNA抗體陽(yáng)性、抗Sm抗體陽(yáng)性、抗磷脂抗體陽(yáng)性、低補(bǔ)體、直接Coombs實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性。符合4 項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)(至少符合 1 項(xiàng)臨床標(biāo)準(zhǔn)和 1 項(xiàng)免疫學(xué)標(biāo)準(zhǔn))可診斷為SLE。采取受試者空腹靜脈血，低速離心后取上層血清，分兩份于-36 ℃冰箱冷凍保存，檢測(cè)前復(fù)融至室溫。

1.2 研究方法

1.2.1 IBT檢測(cè) IBT檢測(cè)試劑及EUROBlotMaster Ⅱ免疫印跡儀由歐蒙醫(yī)學(xué)診斷公司生產(chǎn)，用于體外定性檢測(cè)自身免疫性肝病IgG類抗體。本研究中膜條包被的抗原主要包括AMA-M2、gp210、sp100。檢測(cè)方法：將膜條放入溫浴槽中，按照1∶100加入稀釋的樣本血清，將膜條置于搖床上溫浴30 min后洗滌；洗滌結(jié)束加入酶結(jié)合物溫浴30 min，待充分反應(yīng)后用已稀釋的清洗緩沖液清洗膜條3次，5 min/次；最后加入1.5 mL底物液顯色，待風(fēng)干后應(yīng)用EUROBLineScan 軟件判讀結(jié)果。所有操作均按照操作標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程進(jìn)行。

1.2.2 MBFFI檢測(cè) MBFFI檢測(cè)的試劑及Luminex 200TM多功能流式點(diǎn)陣儀由上海透景生命科技有限公司提供。MBFFI檢測(cè)方法：將待檢血清于室溫下復(fù)融，加載于TESMI F3999全自動(dòng)加樣儀上進(jìn)行樣本處理，應(yīng)用Luminex 200TM流式點(diǎn)陣儀進(jìn)行樣本檢測(cè)和數(shù)據(jù)處理[15]。本研究中3種自身抗體(AMA-M2、gp210、sp100)的cut off值為20 AU。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩種方法對(duì)同一種自身抗體檢測(cè)結(jié)果的一致性應(yīng)用Kappa檢驗(yàn),Kappa≥0.75表明兩種方法檢測(cè)的一致性較好，0.40≤Kappa<0.75 表明兩種方法檢測(cè)一致性一般，Kappa<0.40表明兩種方法檢測(cè)一致性較差。陽(yáng)性率的比較采用χ2檢驗(yàn)。受試者工作特征曲線(ROC曲線)應(yīng)用Graphpad prism軟件進(jìn)行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MBFFI與IBT檢驗(yàn)一致性比較 應(yīng)用MBFFI與IBT對(duì)所有樣本血清中的AMA-M2、gp210與sp100抗體進(jìn)行檢測(cè)，每種抗體的檢測(cè)陽(yáng)性率與一致性見(jiàn)表1。兩種方法檢測(cè)的每種抗體的陽(yáng)性率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)，一致率均>90.00%。計(jì)算兩種方法檢測(cè)的Kappa指數(shù)，本研究總體樣本中兩種方法檢測(cè)一致性最好的抗體為AMA-M2(Kappa=0.895)。

2.2 MBFFI與IBT對(duì)PBC組患者血清自身抗體檢測(cè)結(jié)果比較 應(yīng)用MBFFI與IBT檢測(cè)PBC組340例患者血清肝病相關(guān)自身抗體，其陽(yáng)性率與一致性見(jiàn)表2。兩種方法進(jìn)行抗體檢測(cè)的陽(yáng)性率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。兩種檢測(cè)方法檢測(cè)AMA-M2抗體的一致性最好(Kappa=0.874)；兩種檢測(cè)方法檢測(cè)gp210與sp100抗體的一致性較好(Kappa值分別為0.713、0.749)。

2.3 MBFFI對(duì)AMA-M2、gp210、sp100 3種抗體聯(lián)合檢測(cè)的診斷價(jià)值 以340例PBC患者為病例組，以其他疾病組與健康體檢者為對(duì)照組，應(yīng)用MBFFI聯(lián)合檢測(cè)血清AMA-M2、gp210、sp100 3種抗體，該方法用于診斷PBC的敏感度、特異度等指標(biāo)見(jiàn)表3。MBFFI對(duì)3種自身抗體單項(xiàng)檢測(cè)時(shí)，AMA-M2抗體的敏感度(72.06%)最高。聯(lián)合檢測(cè)gp210與sp100兩種抗體的敏感度高于該兩種抗體的單項(xiàng)檢測(cè)，聯(lián)合檢測(cè)AMA-M2、gp210與sp100 3種抗體的敏感度高于3種抗體的單項(xiàng)檢測(cè)，而特異度小于單項(xiàng)檢測(cè)。與單項(xiàng)檢測(cè)AMA-M2抗體相比，3種抗體聯(lián)合檢測(cè)診斷PBC的誤診率略高但漏診率降低。MBFFI單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)3種抗體的ROC曲線見(jiàn)圖1。3種抗體單項(xiàng)檢測(cè)時(shí)，AMA-M2抗體診斷PBC的ROC曲線下面積(0.850 3)高于gp210抗體(0.703 9)與sp100抗體(0.635 2)。3種抗體聯(lián)合檢測(cè)診斷PBC的ROC曲線下面積最大為0.907 0，gp210與sp100抗體聯(lián)合檢測(cè)的ROC曲線下面積高于gp210與sp100抗體的單項(xiàng)檢測(cè)，但低于AMA-M2抗體的單項(xiàng)檢測(cè)及3種抗體的聯(lián)合檢測(cè)。

表1 MBFFI與IBT檢測(cè)所有樣本總體一致性比較

表2 MBFFI與IBT對(duì)PBC組患者血清自身抗體檢測(cè)結(jié)果比較

圖1 MBFFI檢測(cè)AMA-M2、gp210、sp100 3種抗體的ROC曲線

3 討論

自身抗體的檢測(cè)對(duì)于PBC的早期診斷具有非常重要的意義。AMA是PBC的標(biāo)志性抗體，而gp210抗體與sp100抗體可出現(xiàn)在30%～50%的AMA陰性的PBC患者中。當(dāng)患者血清中未檢測(cè)出AMA，但具有PBC相關(guān)生化及臨床表現(xiàn)時(shí)，可以通過(guò)檢測(cè)gp210與sp100抗體來(lái)協(xié)助診斷PBC[16]。IIF是檢測(cè)肝病相關(guān)自身抗體最廣泛應(yīng)用的方法，但其缺點(diǎn)在于結(jié)果判讀易受人為因素影響[17]。隨后出現(xiàn)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、IBT等檢測(cè)方法雖然克服了IIF的一些局限性，但仍然具有耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣、無(wú)法實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等缺點(diǎn)[18]。隨著實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的發(fā)展，MBFFI將不同顏色的熒光素按照不同比例與聚苯乙烯微球結(jié)合，構(gòu)建100種帶有可識(shí)別熒光的熒光微球。將100種熒光微球與抗原耦聯(lián)，可對(duì)多種不同抗原抗體結(jié)合物進(jìn)行檢測(cè)，具有靈活性與多抗體性[17]。

本研究中應(yīng)用MBFFI對(duì)所有血清樣本中的AMA-M2、gp210、sp100抗體進(jìn)行檢測(cè)，其陽(yáng)性率與IBT檢測(cè)相差不大，一致性較好。在340例PBC患者中，MBFFI對(duì)AMA-M2、gp210與sp100抗體檢測(cè)的陽(yáng)性率與IBT大致相同，一致性較好。IBT為目前檢測(cè)肝病相關(guān)自身抗體較為成熟且應(yīng)用廣泛的檢測(cè)技術(shù)，本研究中MBFFI檢測(cè)PBC特異性自身抗體與IBT一致性較好，且具有快速、自動(dòng)化、高通量和定量檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)，因此MBFFI有可能成為臨床常用的PBC相關(guān)自身抗體檢測(cè)方法。相關(guān)研究表明應(yīng)用MBFFI聯(lián)合檢測(cè)多種自身抗體可能提高診斷某些自身免疫性疾病的敏感度[12]，且其檢測(cè)抗核抗體結(jié)果與IBT具有較好的一致性[15]，但尚未發(fā)現(xiàn)其他相關(guān)研究對(duì)MBFFI與IBT檢測(cè)PBC相關(guān)自身抗體結(jié)果的對(duì)比評(píng)價(jià)。

表3 MBFFI檢測(cè)AMA-M2、gp210與sp100抗體的診斷性能

本研究與Villalta等[19]應(yīng)用INOVA診斷公司的一種基于微球的多重分析系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果相比，應(yīng)用該方法檢測(cè)的AMA-M2、gp210與sp100抗體的敏感度分別為63.90%、23.70%、15.50%，均低于本研究所用的MBFFI方法，但其特異度較高，ROC曲線比較顯示該研究檢測(cè)3種自身抗體的ROC曲線下面積為AMA-M2 0.836、gp210 0.528、sp100 0.487。本研究的ROC曲線顯示，AMA-M2、gp210與sp100抗體的ROC曲線下面積分別為0.850 3、0.703 9、0.635 2，均高于Villalta等的研究，檢測(cè)結(jié)果的差異可能與地域和種族不同有關(guān)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)AMA-M2、gp210與sp100 3種自身抗體聯(lián)合檢測(cè)診斷PBC的ROC曲線下面積更大，提示3種自身抗體聯(lián)合檢測(cè)對(duì)PBC具有更大的診斷價(jià)值，有利于與其他自身免疫性肝病相鑒別。相關(guān)研究針對(duì)亞洲PBC患者血清gp210與sp100抗體檢測(cè)敏感度與特異度進(jìn)行了分析，與亞洲人群檢測(cè)上述兩種抗體的平均敏感度與特異度相比[20]，MBFFI檢測(cè)gp210抗體的敏感度較低而特異度高，檢測(cè)sp100抗體的敏感度與特異度與平均水平一致。AMA-M2抗體與其他抗體相比在診斷PBC時(shí)具有較高的敏感度與特異度，本研究中當(dāng)3種抗體聯(lián)合檢測(cè)時(shí)診斷PBC的敏感度要高于AMA-M2抗體的單項(xiàng)檢測(cè)，且其漏診率更低，提示3種抗體聯(lián)合檢測(cè)更有利于PBC患者的篩查與早期診斷。

綜上所述，MBFFI對(duì)于AMA-M2、gp210與sp100 3種自身抗體的檢測(cè)與IBT相比一致性較好。應(yīng)用MBFFI聯(lián)合檢測(cè)3種自身抗體對(duì)診斷PBC的敏感度更高、診斷價(jià)值更大，有利于PBC的早期診斷。本研究還需要進(jìn)行大樣本和多中心的研究驗(yàn)證。MBFFI從方法學(xué)的角度優(yōu)于IBT，能夠快速、高通量的對(duì)樣本進(jìn)行定量檢測(cè)，易于自動(dòng)化與標(biāo)準(zhǔn)化，符合臨床需求，具有重要的臨床價(jià)值。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開(kāi)研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：王戰(zhàn)負(fù)責(zé)標(biāo)本收集，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，收集資料，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，文章撰寫(xiě)；姚遠(yuǎn)、孫桂榮參與資料整理和分析；王麟、劉靜參與收集資料和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)；劉明軍負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，擬定寫(xiě)作思路，指導(dǎo)文章撰寫(xiě)。