張 一， 張巍巍， 謝方瑜， 李文利， 姜大磊， 賈孝娟， 付來琳， 王 堯，陳 斌， 宋 敏， 紀莉莎， 解祥軍

1 青島大學附屬青島市市立醫(yī)院 a.消化內(nèi)科， b.心內(nèi)科， c.肝膽外科， d.內(nèi)窺鏡室，山東 青島 266011； 2大連醫(yī)科大學， 遼寧 大連 116044

胰腺癌(pancreatic cancer，PC)是全球癌癥死亡第七大原因[1]，目前手術仍是PC患者的主要治療選擇，僅約20%的患者可手術切除，晚期生存期不超過12個月[2-3]。交界性可切除胰腺癌(borderline resectable pancreatic cancer，BR-PC)是介于可切除與不可切除之間的一個分期，將約1/3的不可切除PC納入交界性可切除PC后而達到術后切緣陰性(R0)，從而使患者獲益[4]。微小RNA(miRNA)在血液循環(huán)中具有高度穩(wěn)定性，且PC具有獨特miRNA表達譜[5]。本研究旨在探討血清miR-486-5p聯(lián)合CA19-9對評估PC可手術性的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2018年9月—2020年12月青島市市立醫(yī)院確診的PC患者60例(其中可切除PC 21例、交界性可切除PC 11例，為可手術組;不可切除PC 28例為不可手術組)，年齡(60.65±9.22)歲；良性疾病對照組30例(包括慢性胰腺炎15例、導管內(nèi)乳頭狀黏液瘤7例和胰腺囊腫8例)，年齡(59.50±10.52)歲；健康對照組44例，年齡(60.23±9.01)歲。收集PC患者年齡、性別、腫瘤大小、位置、淋巴轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移情況。

1.2 PC患者納入標準 根據(jù)NCCN PC診治指南[6]，Ⅰ～Ⅱ期為可切除PC，交界性可切除PC的判定標準為滿足以下任何一項或多項：腫瘤侵犯肝總動脈但未累及腹腔干；侵犯腸系膜上動脈半周以下；侵犯腸系膜上靜脈、門靜脈或兩者交界處，但能進行血管切除和重建；單純侵犯腸系膜上靜脈或門靜脈?？汕谐齈C和經(jīng)新輔助化療后手術達到切緣陰性的交界性可切除PC患者，根據(jù)術后標本、病理結(jié)果結(jié)合影像學檢查評估腫瘤大小、分期及淋巴轉(zhuǎn)移；不可切除PC通過CT、MRI、PET-CT等影像學檢查以及轉(zhuǎn)移性疾病的活檢確診和分期。排除無法進行臨床評價腫瘤大小、分期、淋巴轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移的不可切除患者。所有受試者均在接受手術、放療或化療前采集血清樣本。

1.3 實驗方法

1.3.1 血清制備 對所有受試者采空腹全血5 ml，4 ℃，3000 r/min，離心5 min，取上層血清置于凍存管內(nèi)并于-80 ℃冰箱內(nèi)保存至使用。

1.3.2 RNA提取 每份樣品取200 μL，采用TRNzol總RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取RNA，使用NanoDrop?ND-2000分光光度計(Thermo fisher)測定RNA濃度和純度。

1.3.3 逆轉(zhuǎn)錄反應 使用miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(復能基因，貨號：QP013)和miRNA-486-5p引物(GENEWIZ公司)進行反轉(zhuǎn)錄合成的互補DNA[Poly(A)加尾法]。反應條件為：37 ℃ 60 min，37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min，終止反應，于4 ℃保存?zhèn)溆?。miRNA-486-5p引物序列：正向5′-ACACTCCAGCTGGGTCCTGTACTGAGCTGCCC-3′，反向5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；U6序列：正向5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3.4 實時熒光PCR測定 使用熒光定量PCR儀(ABI 7500型)進行實時定量測定。PCR循環(huán)條件：30 s 95 ℃預變性，5 s 95 ℃、34 s 60 ℃共40個循環(huán)。以U6作為內(nèi)參。并且根據(jù)real time PCR原始檢測結(jié)果，按照2-△△ct計算相對定量。所有反應均一式三份進行，實驗操作均嚴格按產(chǎn)品制造商說明書進行。

1.3.5 血清CA19-9的水平檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法測定CA19-9的水平，試劑盒購自 Roche(上海)公司。

1.4 倫理學審查 本研究獲得青島市市立醫(yī)院倫理委員會批準，批號： 2021臨審字第018號。所有患者均簽署知情同意書。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。不符合正態(tài)分布的計量資料以M(P25～P75)表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。采用GraphPad Prism8.0軟件繪制受試者工作特征曲線(ROC曲線)，計算ROC曲線下面積(AUC)，利用二元logistic回歸公式，計算得出聯(lián)合miR-486-5p和CA19-9的預測概率值，通過MedCale 15.2.2進行Z檢驗比較各組AUC間的差異。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清中miR-486-5p的表達水平 采用qRT-PCR檢測134例受試者血清miR-486-5p，并計算相對表達量?？墒中g組和不可手術組血清miR-486-5p的表達均高于胰腺良性疾病組和健康對照組，且不可手術組miR-486-5p的表達顯著高于可手術組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)(表1)。

表1 各組血清miR-486-5p水平比較

2.2 PC組血清miR-486-5p的表達與臨床病理參數(shù)的關系 以miR-486-5p中位表達作為參照，分為低表達組和高表達組。結(jié)果顯示，在TNM分期、有無淋巴轉(zhuǎn)移和有無遠處轉(zhuǎn)移中miR-486-5p的低表達和高表達差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)(表2)。

2.3 血清miR-486-5p聯(lián)合CA19-9對PC可手術性的預測價值 miR-486-5p和CA19-9單獨檢測的預測能力相似(P>0.05)。但兩者聯(lián)合在胰腺良性疾病和健康人群中區(qū)分可手術PC的診斷價值優(yōu)于CA19-9(Z值分別為2.510、2.841，P值分別為0.012、0.005)(表3，圖1～2)。在區(qū)分可手術組和不可手術組中，兩者聯(lián)合的診斷價值優(yōu)于miR-486-5p和CA19-9(Z值分別為2.069、2.387，P值分別為0.039、0.017)(表3，圖3)。區(qū)分可手術組與良性疾病組、區(qū)分可手術組與健康對照組以及區(qū)分可手術組與不可手術組miR-486-5p的臨界值分別為1.447、1.08和3.39；聯(lián)合CA19-9后分別為3.12、3.21和6.63。

表2 PC血清miR-486-5p與臨床特征的關系

表3 miR-486-5p、CA19-9和聯(lián)合后對

圖1 區(qū)分可手術組和良性疾病組的ROC曲線

圖2 區(qū)分可手術組和健康對照組的ROC曲線

圖3 區(qū)分可手術組和不可手術組的ROC曲線

3 討論

PC早期診斷困難，5年相對存活率僅為9%[7-8]。新輔助治療可縮小腫瘤體積從而達到切緣陰性[9]。可切除PC患者經(jīng)治療后5年生存率為2.8%～31.4%，不可切除的患者為0.6%～3.8%，早期手術切除后可延長2年生存期[10]。CA19-9對有癥狀的患者診斷敏感度為79%～81%，特異度為82%～90%[11]，但部分Lewis表型陰性者CA19-9呈假陰性，而在一些消化道腫瘤、良性膽道梗阻或特發(fā)性肺纖維化患者中可能為假陽性[12-13]。因此，急需要性價比更高的循環(huán)生物標志物預測可手術的PC，從而改善預后。

miRNA是一類長18～25個核苷酸(nt)的短單鏈非編碼RNA[14]，調(diào)節(jié)約30%的人類基因[15]。miRNAs的表達與癌癥的類型、腫瘤分期和藥物治療反應相關[16]，經(jīng)廣泛研究可作為多種腫瘤的潛在生物標志物。miR-486位于染色體8q11的sAnk1區(qū)域，與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展相關[17]。Xu等[18]研究了PC患者血漿中671種miRNAs，發(fā)現(xiàn)29個異常表達，其中miR-486-5p表達上調(diào)。李兆申團隊[19]發(fā)現(xiàn)CircNFIB1過表達可以通過miR-486-5p軸抑制PC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，敲除miR-486-5p可增強5-氟尿嘧啶對PANC-1細胞遷移和侵襲的抑制作用。更有趣的是，在部分消化道腫瘤(如食管癌[17]、結(jié)腸癌[20]、肝癌[21]等)中miR-486-5p表達下調(diào)，這有利于鑒別PC與其他消化道腫瘤。上述研究表明了miR-486/miR-486-5p是PC的癌基因，且與PC的侵襲和轉(zhuǎn)移有關，猜測miR-486-5p可能作為預測PC可切除性的標志物。

本研究結(jié)果顯示，PC中血清miR-486-5p相對定量明顯高于良性疾病組和健康對照組，這與以往研究結(jié)果一致，提示在PC血清中，miR-486-5p表達可能上調(diào)，有作為PC診斷標志物的潛力。另外，不可手術組miR-486-5p表達明顯高于可手術組，表明miR-486-5p可能用于預測PC的可切除性。Mees等[22]研究證明，在高侵襲性和轉(zhuǎn)移性PC組織中，miR-486以CD40作為靶點表達明顯上調(diào)，且許多miRNAs可穩(wěn)定的從原發(fā)腫瘤釋放到血液循環(huán)中[23]。本研究進一步證實，隨TNM分期越晚miR-486-5p表達越高，且與淋巴轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移相關?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，本研究利用ROC曲線評估m(xù)iR-486-5p對PC可切除性的預測價值，結(jié)果顯示，miR-486-5p 和CA19-9預測能力相似，但在胰腺良性疾病和健康人群中預測可手術PC的敏感度和特異度優(yōu)于CA19-9。聯(lián)合miR-486-5p與CA19-9的預測價值、特異度和敏感度均優(yōu)于CA19-9，同時，能更好區(qū)分可手術和不可手術PC。提示miR-486-5p可作為PC的補償性血清生物標志物，聯(lián)合CA19-9預測可切除和交界可切除PC的臨床應用價值更高。本研究缺點在于樣本量較小，未來需要擴大樣本量且多中心實驗進一步驗證。

綜上所述，本研究結(jié)果表明血清miR-486-5p在PC患者中表達上調(diào)，miR-486-5p聯(lián)合CA19-9能進一步診斷PC的可切除性。目前缺乏研究循環(huán)miR-486-5p對可切除和交界性可切除PC診斷價值的文獻，而血清檢測是臨床最佳非侵襲性檢測方式，miR-486-5p可能成為預測PC可切除性的無創(chuàng)性生物標志物。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：張一負責課題設計，資料分析，撰寫論文；張巍巍、謝方瑜、賈孝娟、付來琳、王堯參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；張巍巍、謝方瑜、李文利、姜大磊負責擬定寫作思路；陳斌、宋敏、紀莉莎負責修改論文；解祥軍指導撰寫文章并最后定稿。