■張心壯 劉 宇 芒 來(lái)

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)馬屬動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部馬屬動(dòng)物遺傳育種與繁殖科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)馬屬動(dòng)物研究中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

畜禽健康是維持畜牧業(yè)持續(xù)平穩(wěn)發(fā)展的必要保證，動(dòng)物體內(nèi)自由基穩(wěn)態(tài)失衡是氧化應(yīng)激-炎癥反應(yīng)-免疫功能失衡，導(dǎo)致畜禽發(fā)病、降低生產(chǎn)性能的根本原因。氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷進(jìn)而衰老并逐步凋亡，激活促炎因子釋放引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等生物大分子的物質(zhì)結(jié)構(gòu)以及生理功能發(fā)生變化，引起動(dòng)物機(jī)體代謝發(fā)生異常、生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制以及抗病能力降低，進(jìn)而降低畜禽生產(chǎn)性能和畜產(chǎn)品品質(zhì)[1]。生產(chǎn)中可以通過(guò)營(yíng)養(yǎng)調(diào)控手段，如在畜禽飼糧中添加抗氧化劑等，改善氧化平衡狀態(tài)，緩解氧化應(yīng)激損傷[2]。

桑葉自古至今作為一種中草藥，富含黃酮、生物堿、多糖等天然活性成分，具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老等藥理作用[3]。大量研究表明桑葉黃酮對(duì)氧化劑和自由基具有較強(qiáng)的清除能力[4-6]。Zhang 等[7]前期的研究結(jié)果表明桑葉提取物能夠通過(guò)提高超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）的含量提高牛肉的抗氧化性能，延長(zhǎng)貨架期，這可能與桑葉黃酮有著密不可分的關(guān)系。桑葉黃酮是經(jīng)過(guò)一系列工藝從桑葉中提取的具有生物學(xué)活性的復(fù)合物[8]。但是對(duì)桑葉黃酮的提取工藝，以及桑葉提取物的抗氧化活性還缺乏系統(tǒng)的研究。響應(yīng)面法（RSM）是一種統(tǒng)計(jì)方法，它使用來(lái)自適當(dāng)試驗(yàn)設(shè)計(jì)的定量數(shù)據(jù)來(lái)確定并同時(shí)求解多變量方程，廣泛應(yīng)用于植物活性物質(zhì)提取工藝的優(yōu)化[9]。本試驗(yàn)以桑葉為研究對(duì)象，通過(guò)單因素試驗(yàn)分析超聲波輔助、提取時(shí)間、提取溫度、料液比以及乙醇濃度對(duì)桑葉黃酮提取率的影響，利用響應(yīng)面法優(yōu)化桑葉黃酮提取工藝，并對(duì)其抗氧化性能進(jìn)行研究，旨在為桑葉黃酮作為天然抗氧化劑在畜禽生產(chǎn)中緩解氧化應(yīng)激應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

試驗(yàn)試劑NaOH、NaNO2、Al（NO3）3、無(wú)水乙醇均為分析純，購(gòu)置于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司；DPPH、蘆丁均為Sigma 試劑標(biāo)準(zhǔn)品。電子天平（ME-204，瑞士METTLER TOLEDO 有限公司）、超聲波儀器、三孔三溫?cái)?shù)顯恒溫水浴鍋（DK-8D，常州申光儀器有限公司）、Epoch 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

采集新鮮桑葉，65 ℃烘干制備桑葉粉，過(guò)80 目篩，干燥貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 單因素對(duì)桑葉黃酮提取率的影響

①超聲波輔助提?。簻?zhǔn)確5 g（精確到0.000 1 g）桑葉粉，按照料液比1∶30 (g/mL)、乙醇濃度60%、60 ℃溫度條件下分別進(jìn)行15、20、25 min的恒溫提取和超聲波輔助提取，提取后分別取200 μL提取液，測(cè)定黃酮提取率。

②乙醇濃度：準(zhǔn)確稱取5 g（精確到0.000 1 g）桑葉粉，按照提取溫度60 ℃、料液比1∶30（g/mL）、乙醇濃度40%、50%、60%、70%和80%，超聲波輔助提取20 min，分別取200 μL提取液，測(cè)定黃酮提取率。

③提取溫度：準(zhǔn)確稱取5 g（精確到0.000 1 g）桑葉粉，按照乙醇濃度60%、料液比1∶30（g/mL）、提取溫度40、50、60、70、80 ℃，超聲波輔助提取20 min，分別取200 μL提取液，測(cè)定黃酮提取率。

④提取時(shí)間：準(zhǔn)確稱取5 g（精確到0.000 1 g）桑葉粉，按照乙醇濃度60%、料液比1∶30（g/mL）、提取溫度60 ℃、超聲波輔助提取10、15、20、25、30 min，分別取200 μL提取液，測(cè)定黃酮提取率。

⑤料液比：準(zhǔn)確稱取5 g（精確到0.000 1 g）桑葉粉，按照乙醇濃度60%、提取溫度60 ℃、料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50（g/mL），超聲波輔助提取20 min，分別取200 μL提取液，測(cè)定黃酮提取率。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化桑葉提取物的因素與水平

使用Design-Expert 7.1.3 設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)方案，根據(jù)單因素試驗(yàn)選擇桑葉黃酮提取率較高的4 個(gè)單因素對(duì)應(yīng)的參數(shù)作為優(yōu)化桑葉黃酮提取工藝的水平零點(diǎn)如表1所示，分別為乙醇濃度60%、溫度60 ℃、提取時(shí)間20 min、料液比1∶30（g/mL），系統(tǒng)生成29 個(gè)試驗(yàn)處理。

表1 桑葉提取試驗(yàn)的因素和水平

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考付麗紅等[10]方法建立黃酮提取率測(cè)試的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1 mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品原液置于1.5 mL 的離心管中，再分別補(bǔ)加0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0 mL的95%乙醇溶液，封蓋混勻，得到不同濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取200 μL 放在新的離心管中，加入20% NaNO2溶液30 μL，充分混勻后反應(yīng)3 min，加入40% Al（NO3）3溶液40 μL，充分混勻后反應(yīng)3 min，最后加入20% NaOH溶液100 μL，充分混勻后反應(yīng)10 min。每個(gè)樣品各取200 μL，加入到96 孔板上，記好每個(gè)孔中蘆丁原液的濃度，放入全自動(dòng)酶標(biāo)儀中，設(shè)置波長(zhǎng)為510 nm，測(cè)得吸光度值。得到線性回歸方程為y=2.476x-0.004，R2=0.988。

1.2.5 黃酮提取率的檢測(cè)

準(zhǔn)確吸取200 μL 提取液于1.5 mL 刻度離心管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟測(cè)定樣品中黃酮濃度，并根據(jù)以下公式計(jì)算桑葉黃酮提取率。

得率（mg/g）=C×N×V/M

式中：C——測(cè)定液總黃酮提取率（mg/mL）；

N——稀釋倍數(shù)；

V——樣品體積（mL）；

M——原料質(zhì)量（g）。

1.2.6 桑葉提取物DPPH自由基清除活性的測(cè)定

參考Pereira等[11]的方法進(jìn)行改進(jìn)，按照中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)向29支離心管加入2 mL不同提取條件的桑葉提取物，然后分別加入濃度3×10-4mol/L DPPH 溶液2.0 mL，混合搖勻，反應(yīng)30 min后在517 nm處測(cè)定其吸光度A1。以2.0 mL 無(wú)水乙醇代替DPPH 的吸光度為A2，以2.0 mL的純化水代替樣品溶液的吸光度為A0，以無(wú)水乙醇作為參比液。DPPH 自由基清除活性可用以下公式表示。

SA（%）=[1-（A1-A2）/A0]×100

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次，試驗(yàn)結(jié)果使用SAS 9.2 統(tǒng)計(jì)軟件中GLM模型對(duì)桑葉黃酮提取率進(jìn)行單因素方差分析，Duncan’s 法多重比較。Design-Expert 7.1.3建立桑葉黃酮提取率和DPPH 自由基清除活性的響應(yīng)面模型，并分析其響應(yīng)面結(jié)果。P<0.05表示差異顯著，0.050.1表示差異不顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)對(duì)桑葉提取物黃酮提取率的影響(見(jiàn)圖1～圖5)

圖1 超聲波輔助與恒溫提取桑葉黃酮提取率的比較

圖2 乙醇濃度對(duì)桑葉提取物黃酮提取率的影響

圖3 提取溫度對(duì)桑葉提取物黃酮提取率的影響

圖4 提取時(shí)間對(duì)桑葉提取物黃酮提取率的影響

圖5 料液比對(duì)桑葉提取物黃酮提取率的影響

由圖1 可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，超聲波輔助提取與恒溫提取所得黃酮提取率呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)，且都在20 min 的時(shí)間點(diǎn)達(dá)到最高值，且超聲波輔助提取所得提取物的黃酮提取率高于恒溫提取所得黃酮提取率。

由圖2可知，隨乙醇濃度的升高，黃酮提取率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在乙醇濃度為60%時(shí)，黃酮提取率達(dá)到最高。譚春遠(yuǎn)等[12]研究同樣發(fā)現(xiàn)特納草黃酮的提取率隨著乙醇濃度升高出現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。

由圖3 可知，隨提取溫度的升高，黃酮提取率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在提取溫度為60 ℃時(shí)，黃酮提取率達(dá)到最高為3.02%。溫度升高，分子的運(yùn)動(dòng)速率加快，有利于黃酮的溶解與溶出，可以增加提取率；但當(dāng)溫度繼續(xù)升高，會(huì)降低溶劑密度，從而降低產(chǎn)率，而且過(guò)高的溫度可能會(huì)導(dǎo)致部分黃酮類化合物降解，使得提取率降低[13]。

由圖4 可知，隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)，黃酮提取率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在提取時(shí)間為20 min 時(shí)，黃酮提取率達(dá)到最高為2.91%。

由圖5 可知，隨料液比的降低，黃酮提取率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在料液比為1∶30（g/mL）時(shí)，黃酮提取率達(dá)到最高為2.82%。可能是由于在較高的料液比下，萃取過(guò)程中溶劑很快達(dá)到飽和，較低的料液比條件下，進(jìn)入細(xì)胞的溶劑較多，滲透到溶劑中的化合物較多，黃酮提取更加徹底，但是當(dāng)料液比太低的時(shí)候，可能會(huì)削弱超聲波的輔助作用，影響總黃酮的溶出，反而使得總黃酮提取率下降。黃瓊等[14]在洛神花總黃酮提取工藝中的研究同樣發(fā)現(xiàn)隨著液固比的升高，黃酮提取率出現(xiàn)先升高后降低的變化。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化桑葉提取物黃酮提取工藝（見(jiàn)表2）

由表2 可知，中心試驗(yàn)設(shè)計(jì)共進(jìn)行29 組試驗(yàn)，為減少誤差零點(diǎn)共測(cè)定5 次，其中黃酮提取率最低為1.63%，最高為3.42%。

表2 桑葉提取試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果

2.3 桑葉提取物黃酮提取率響應(yīng)面回歸模型的擬合程度（見(jiàn)表3）

由表3 可知提取因素對(duì)桑葉黃酮提取率的響應(yīng)面模型顯著（P<0.05），說(shuō)明自變量與因變量與響應(yīng)面模型擬合程度良好，其中時(shí)間和料液比因素的交互項(xiàng)顯著影響桑葉黃酮提取率（P<0.05），時(shí)間因素的二次項(xiàng)極顯著影響桑葉黃酮提取率（P<0.01），其他的交互項(xiàng)對(duì)黃酮的提取率沒(méi)有顯著影響（P>0.05）。

2.4 雙因素交互項(xiàng)對(duì)桑葉提取物黃酮提取率的影響（見(jiàn)圖6～圖11）

三維響應(yīng)面圖和等高線圖解釋了黃酮提取率與所涉及的4 個(gè)提取參數(shù)之間的關(guān)系。在交互項(xiàng)對(duì)桑葉黃酮提取率的影響中，時(shí)間與料液比之間交互作用明顯，表現(xiàn)為曲線最陡，響應(yīng)值變化較大（圖6）；溫度和料液比之間交互有一定的效應(yīng)，曲線有一定坡度（圖7）；乙醇濃度與料液比（圖8）、溫度和時(shí)間（圖9）、乙醇濃度與溫度（圖10）以及乙醇濃度與時(shí)間（圖11）的交互作用較小，曲線較為平滑，響應(yīng)值變化較小，結(jié)果與表3模型分析結(jié)果相吻合。

圖6 料液比與提取時(shí)間對(duì)桑葉黃酮提取率的影響

圖7 溫度與料液比對(duì)桑葉黃酮提取率的影響

圖8 乙醇濃度與料液比對(duì)桑葉黃酮提取率的影響

圖9 時(shí)間與溫度對(duì)桑葉黃酮提取率的影響

圖10 溫度與乙醇濃度對(duì)桑葉黃酮提取率的影響

圖11 時(shí)間與乙醇濃度對(duì)桑葉黃酮提取率的影響

表3 桑葉提取物黃酮提取率回歸模型的方差分析結(jié)果

2.5 桑葉提取物DPPH自由基清除活性（見(jiàn)表4）

由表4 可知，在3×10-4mol/L DPPH 濃度下，第17試驗(yàn)組的DPPH 自由基清除活性最高，為99.09%；第14 試驗(yàn)組最低，為43.13%。DPPH 自由基清除活性可以良好地體現(xiàn)樣品的抗氧化性能，DPPH 自由基清除活性隨著料液比的減少呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)。DPPH 自由基清除活性隨著乙醇濃度增加呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)，與Radojkovic 等[15]的研究有相同的結(jié)果。在Prasad 等[16]的研究認(rèn)為更高的乙醇濃度可以使蛋白質(zhì)被凝固，和一些脂質(zhì)化合物也可能被提取，所以過(guò)高的乙醇濃度可能會(huì)降低抗氧化分子得率的降低，造成DPPH自由基清除活性在升高的情況下降低。DPPH自由基清除活性隨著提取溫度增加呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)。DPPH自由基清除活性隨著提取時(shí)間增加同樣呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)。提取時(shí)間的增長(zhǎng)增加了植物與溶劑的接觸時(shí)間，能夠讓抗氧化分子更高效率地從植物內(nèi)部釋放到溶劑中，增加提取物的抗氧化性能，但是過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的高溫環(huán)境，會(huì)影響植物細(xì)胞膜上受體蛋白的變性，降低其通透性，減少分子進(jìn)出細(xì)胞膜的效率，導(dǎo)致溶劑中抗氧化分子含量的降低、DPPH自由基清除活性的降低[17]。

表4 桑葉提取物DPPH自由基清除活性的試驗(yàn)結(jié)果

2.6 響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷尿?yàn)證

響應(yīng)面模型優(yōu)化桑葉黃酮提取條件為乙醇濃度54.75%、提取時(shí)間17.61 min、料液比1∶30.24（g/mL）、提取溫度50.27 ℃時(shí)桑樹(shù)黃酮最高得率為3.64%。選擇提取時(shí)間17 min、提取溫度為50 ℃、料液比1∶30（g/mL）、乙醇濃度55%條件進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果黃酮提取率為3.62%、提取物DPPH 自由基清除活性為99.12%，黃酮提取率與理論值相對(duì)偏差為0.55%。

3結(jié)論

超聲波輔助能夠有效的提高桑葉黃酮提取率，乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比和提取溫度均影響桑葉黃酮的提取率。響應(yīng)面模型優(yōu)化的提取條件為乙醇濃度54.75%、提取時(shí)間17.61 min、料液比1∶30.24（g/mL）和溫度50.27 ℃，此條件下桑葉黃酮的提取率最高，為3.64%。考慮到生產(chǎn)的實(shí)用性和方便性，選擇提取條件為，時(shí)間17 min、溫度50 ℃、料液比1∶30（g/mL）、乙醇濃度55%，此條件下桑葉黃酮提取率為3.62%、提取物DPPH自由基清除活性為99.12%，與理論桑葉黃酮提取率相對(duì)偏差為0.55%，可以作為桑葉黃酮作為抗氧化劑開(kāi)發(fā)利用的提取工藝。