李雪松，孫 悅，石曉娜，宿 鑫，閆大為，王思琪，劉金華，李澤君

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

目前，呼腸孤病毒病已成為危害我國(guó)水禽養(yǎng)殖業(yè)的主要疫病之一，該病毒可以感染番鴨、半番鴨、櫻桃谷肉鴨、麻鴨和鵝等水禽。引起水禽發(fā)病或者死亡，或者引起繼發(fā)感染造成更大的經(jīng)濟(jì)損失。該病首次在南非報(bào)道被發(fā)現(xiàn)，1997年傳入中國(guó)，大多在我國(guó)福建、浙江等南方地區(qū)鴨群發(fā)病傳播，是一種以肝臟、脾臟表面有多量白點(diǎn)，腎腫大、出血為主要病理變化的傳染病，因其最易感染番鴨，被稱之為番鴨呼腸孤病毒病[1]。

2005年開(kāi)始，在我國(guó)廣東省、四川省等地發(fā)現(xiàn)可感染麻鴨、番鴨、半番鴨和櫻桃谷鴨等各種商品鴨的新毒株，后被學(xué)者稱為鴨呼腸孤病毒，該病毒引起的鴨呼腸孤病毒病死亡率為5%～20%[2-6]。2017年，在我國(guó)山東、河南、江蘇等地區(qū)的養(yǎng)鴨場(chǎng)中暴發(fā)了一種以脾臟腫大、出血、壞死為主要特征的新的鴨呼腸孤病毒病，因其致病性不同于先前描述的鴨呼腸孤病毒病，被稱為新型鴨呼腸孤病毒病。該病毒對(duì)雛鴨的危害特點(diǎn)尤為嚴(yán)重，番鴨、半番鴨的發(fā)病日齡主要為6～25日齡，其中以7日齡居多，病程5～7 d；櫻桃谷鴨發(fā)病日齡主要為10～30日齡。新型呼腸孤病毒發(fā)病率為5%～32.5%，病死率達(dá)4%～20%[7-10]。

2018年8月初，山東省某肉鴨場(chǎng)1日齡的櫻桃谷雛鴨出現(xiàn)了一種以雛鴨脾壞死為主要特征的疫病，初期鴨只精神萎靡、食欲降低，發(fā)病后很快出現(xiàn)急性傳播感染并引發(fā)較高死淘率。本研究從臨床采集發(fā)病鴨的肝臟、脾臟等組織病料中分離到1株病毒，并對(duì)分離到的病毒株進(jìn)行PCR鑒定和測(cè)序分析，確定該毒株為新型鴨呼腸孤病毒。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源 山東省某肉鴨場(chǎng)送檢的疑似新型鴨呼腸孤病毒感染的櫻桃谷肉鴨。

1.2 主要材料與試劑 GreenTaqTMMix和2× AceQ Universal U+ Probe Master Mix V2 （Probe qPCR）試劑購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；病毒RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；SPF鴨胚購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所。根據(jù)GenBank中已有的DRV S1基因序列，利用Oligo軟件設(shè)計(jì)合成了一對(duì)DRV特異性引物，擴(kuò)增目的基因大小為566 bp，其他鴨常見(jiàn)疫病擴(kuò)增引物為本實(shí)驗(yàn)室保存，鴨呼腸孤病毒熒光定量PCR上游引物EF為5'-CGCCTGATACTTTCCCTCCT-3'，下游引物ER為5'-TAAGTCCTGCCACCTGTGAG-3'，探針EP為FAM-ATCAAATCCCTCCAAAGCGCTAMRA，擴(kuò)增片段總長(zhǎng)為199 bp。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 病料的剖檢及樣品處理 剖檢觀察患病雛鴨臟器的病理變化，并取病變明顯的病鴨肝臟。剪碎后以1∶4的比例加入含1000 U/mL雙抗的PBS，研磨后于-40℃反復(fù)凍融3次，4℃、7000×g離心l0 min，取上清液無(wú)菌過(guò)濾后備用。

1.4 常見(jiàn)鴨病毒傳染病檢測(cè) 用實(shí)驗(yàn)室禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）、新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）、1型鴨甲型肝炎病毒（Duck hepatitis A Virus type 1，DHAV-1）、3型鴨甲型肝炎病毒（Duck hepatitis A Virus type 3，DHAV-3）、鴨呼腸孤病毒（Duck reovirus，DRV）、鴨星狀病毒（Duck astrovirus，DAstV）、鴨細(xì)小病毒（Duckling parvovirusis，DPV）、鴨瘟病毒（Duck enteritis virus，DEV）、鴨圓環(huán)病毒（Duck circovirus，DuCV）和鴨腺病毒（Duck adenovirus，DAdV）的引物，對(duì)1.3處理好的樣品進(jìn)行PCR或RT-PCR，確定引起該病的病原體。

1.5 病毒分離和檢測(cè) 上述1.2脾臟和肝臟樣品經(jīng)尿囊腔各接種12日齡SPF鴨胚5枚，0.2 mL/枚。置于37℃孵育，每12 h照胚1次，觀察7 d。棄除24 h內(nèi)死亡的鴨胚，對(duì)24 h后死亡的鴨胚進(jìn)行解剖，觀察病變。收取死亡鴨胚的尿囊液、尿囊膜和胚體，其中尿囊膜和胚體以1∶10的比例加入10倍雙抗PBS后研磨。-20℃反復(fù)凍融3次，4℃、10 000×g離心10 min，取上清液后備用，將其命名為SDHZ。并利用實(shí)驗(yàn)室建立的NDRV定量RT-PCR方法對(duì)提取的尿囊液、尿囊膜和胚體對(duì)病毒增殖的拷貝數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 血凝（Hemagglutination，HA）試驗(yàn) 分別取上述1.5中的上清液SDHZ，按照《中國(guó)獸藥典》附錄中的“血凝（HA）試驗(yàn)”，分別對(duì)1%的雞紅細(xì)胞懸液進(jìn)行血凝（HA）試驗(yàn)，觀察分離株是否對(duì)雞血紅細(xì)胞產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。

1.7 病毒S1基因擴(kuò)增 用病毒RNA提取試劑盒提取分離毒SDHZ的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，對(duì)S1基因進(jìn)行分段擴(kuò)增。S1-1F：5'-GCTTTTTT CTTCTCTGCCCAT-3'，S1-1R：5'-TTGTAGATCT GCCACCGTCGA-3'；S1-2F：5'-ACTTTCCCTCC TCCCCTACCA-3'，S1-2R：5'-GATGAATAGCTC TTCTCAT-3'，其中S1-1擴(kuò)增750 bp，S1-2擴(kuò)增片段為969 bp。按GreenTaqTMMix試劑說(shuō)明書進(jìn)行PCR，取10 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.8 目的基因同源性比對(duì)及分析 對(duì)SDHZ株S1基因及其編碼的Sigma C氨基酸測(cè)序結(jié)果利用MEGA6和DNAStar軟件進(jìn)行比對(duì)分析，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，并對(duì)Sigma C蛋白氨基酸進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié)果

2.1 解剖病理和鴨常見(jiàn)病毒性疾病PCR鑒定 患病鴨剖檢可見(jiàn)脾臟出現(xiàn)腫大、出血、壞死（圖1A），肝臟大面積出血。用AIV、NDV、DHAV-1、DHAV-3、DRV、DAstV、DPV、DEV、DuCV、DAdV的實(shí)驗(yàn)室鑒定引物，經(jīng)PCR或RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，樣品PCR鑒定為DRV陽(yáng)性，鴨其他主要常見(jiàn)病毒PCR均為陰性（圖1B）

圖1 臨床患病雛鴨剖檢脾臟病變（A）和PCR鑒定（B）Fig.1 Spleen lesions (A) and PCR identification (B) of clinical ducklings

2.2 病毒分離 將病料樣品離心過(guò)濾后，經(jīng)尿囊腔接種12日齡鴨胚，接種48～120 h后鴨胚開(kāi)始死亡，死亡鴨胚的病變主要表現(xiàn)為活力減弱，胚體發(fā)育不良，水腫和出血（圖2）。DRV定量PCR檢測(cè)收集的鴨胚病毒拷貝數(shù)為：鴨胚胚體研磨液（病毒拷貝數(shù)為19492）＞鴨胚尿囊液（病毒拷貝數(shù)為1108）＞鴨胚尿囊膜（病毒拷貝數(shù)為572），將該分離株命名為鴨呼腸孤病毒SDHZ分離株。

圖2 病料接種鴨胚的病變Fig.2 Lesion of duck embryo inoculated with the sample

2.3 血凝（HA）試驗(yàn) 對(duì)樣品進(jìn)行血凝（HA）試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果顯示該分離株SDHZ對(duì)1%雞血紅細(xì)胞無(wú)血凝活性（圖3）。

圖3 樣品血凝試驗(yàn)測(cè)定Fig.3 The hemagglutination test of the clinical sample

2.4 S1基因PCR結(jié)果 以病毒分離株SDHZ基因組為模板，提取病毒RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄對(duì)病毒S1基因進(jìn)行分段PCR擴(kuò)增后，經(jīng)1%瓊脂糖電泳分析，得到S1基因約為750 bp和S2基因約為969 bp，與預(yù)期結(jié)果一致（圖4）。

圖4 病毒分離株的S1基因分段PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 PCR amplification of the isolate S1 gene

2.5 S1基因進(jìn)化樹(shù)和sigma C蛋白氨基酸同源性分析 將測(cè)序得到的S1基因序列與GenBank中的DRV、MDRV和ARV的參考毒株序列進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析，分離株SDHZ與我國(guó)流行的DRV處于同一分支（圖5A），且其sigma C蛋白氨基酸與參考毒株的同源性達(dá)到了94.5%～98.7%（圖5B）。

圖5 鴨呼腸孤病毒SDHZ分離株S1基因核苷酸序列進(jìn)化樹(shù)（A）和SigmaC氨基酸同源性（B）Fig.5 Phylogenetic tree analysis based on S1 gene (A) and homology analysis of amino acid of protein Sigma C (B) of DRVs

3 討論

近幾年，在我國(guó)肉鴨養(yǎng)殖地區(qū)出現(xiàn)一種以脾臟壞死為主要特征的疾病，該病主要造成病患雛鴨精神狀態(tài)差，飲水和采食量均下降，并伴有脾臟壞死后的機(jī)體免疫力下降引起的繼發(fā)感染，造成更高的死亡率；耐過(guò)鴨出現(xiàn)發(fā)育受阻、生長(zhǎng)緩慢，成為僵鴨，經(jīng)研究證實(shí)新型鴨呼腸孤病毒是造成該病的主要病原[6-8]。該新型鴨呼腸孤病毒病具有發(fā)病日齡小、病情發(fā)展快、容易快速傳播的特點(diǎn)，是以脾臟腫大、出血、壞死為主要臨床特征的疾病，給我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[9-10]。

本研究通過(guò)SPF鴨胚從病料中分離得到1株DRV山東分離株，進(jìn)化樹(shù)和同源性分析發(fā)現(xiàn)，分離株SDHZ與我國(guó)流行的DRV處于同一分支，且其Sigma C蛋白氨基酸與參考毒株的同源性達(dá)到了94.5%～98.7%，是我國(guó)流行的DRV分離株，并且通過(guò)DRV熒光定量PCR方法發(fā)現(xiàn)該病毒感染鴨胚后病毒主要在胚體中增殖，其次是尿囊液和尿囊膜。該病毒主要采用SPF鴨胚進(jìn)行分離，避免了因?yàn)榉潜驹此拗鳎ㄈ珉u胚、LMH細(xì)胞或者BHK細(xì)胞）對(duì)病毒毒力和序列的影響，該研究結(jié)果也為今后鴨呼腸孤病毒病疫苗及其防制技術(shù)研究提供了理論參考。