康文瀚，張九凱，邢冉冉，孫秀蘭，陳 穎,

（1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

近年來(lái)，食物引起的過(guò)敏現(xiàn)象受到越來(lái)越多的重視。迄今為止全球約有22%～25%的人對(duì)食物產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)，其中兒童發(fā)病數(shù)量最多，并以每10年2～3 倍的速率不斷增加，一些原來(lái)不是過(guò)敏體質(zhì)的人也逐漸演變成過(guò)敏性體質(zhì)[1]。

桃（Prunus persica L. Batsch）是我國(guó)食物過(guò)敏中較常見(jiàn)的致敏食物之一。有研究表明，由進(jìn)食蔬菜、水果導(dǎo)致的嚴(yán)重變態(tài)反應(yīng)中桃是最常見(jiàn)的致敏食物[2]。桃過(guò)敏原蛋白主要分為4 類蛋白家族：病程相關(guān)蛋白第10家族（Pru p 1）、類甜蛋白家族（Pru p 2）、非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白家族（Pru p 3）和抑制蛋白家族（Pru p 4）[3]。

國(guó)內(nèi)外已經(jīng)圍繞桃過(guò)敏原進(jìn)行了不同程度的研究。在地中海地區(qū)，由桃引起的過(guò)敏現(xiàn)象在水果過(guò)敏中的比例最高。在中國(guó)，桃過(guò)敏在全部食物過(guò)敏中位居第二（依次是豆科植物、桃、葵花籽和花生等）[3-4]。桃過(guò)敏現(xiàn)象的發(fā)生存在明顯的地域分布差異，不同國(guó)家和地區(qū)引起桃過(guò)敏的主要過(guò)敏原蛋白不同，同時(shí)由過(guò)敏原蛋白激發(fā)的過(guò)敏癥狀也存在差異。比如，在歐洲中部地區(qū)，桃過(guò)敏主要是由過(guò)敏原蛋白Pru p 1和Pru p 2引起，其過(guò)敏癥狀比較輕微，一般僅表現(xiàn)為口腔過(guò)敏綜合癥；而在歐洲南部地中海地區(qū)，引起桃過(guò)敏的主要過(guò)敏原蛋白是 Pru p 3[4]，該過(guò)敏原蛋白能抵抗胃蛋白酶的消化，產(chǎn)生全身系統(tǒng)性過(guò)敏或接觸性蕁麻疹等嚴(yán)重癥狀。在中國(guó)桃過(guò)敏的發(fā)生往往伴隨著蒿屬花粉過(guò)敏，其主要過(guò)敏原蛋白同樣是Pru p 3[5]。

Pru p 3作為桃過(guò)敏原蛋白中的主要致敏蛋白，需要進(jìn)行更深入的研究。而純化制備大量Pru p 3過(guò)敏原蛋白是深入研究的基礎(chǔ)，目前報(bào)道的蛋白純化方法主要包括鹽析法、等電點(diǎn)沉淀法、有機(jī)溶劑沉淀法、離子交換層析法等[6]。其中鹽析法、等電點(diǎn)沉淀法及有機(jī)溶劑沉淀法雖然操作簡(jiǎn)單，節(jié)約成本，但是蛋白純化濃度較低，不能有效分離目標(biāo)蛋白。離子交換層析法對(duì)目標(biāo)蛋白分離效果較好，但實(shí)驗(yàn)成本較高，操作復(fù)雜[7]。國(guó)內(nèi)外已經(jīng)圍繞著桃過(guò)敏原蛋白Pru p 3純化進(jìn)行了不同程度的研究。Mori等[8]使用親和層析預(yù)裝色譜柱從桃蛋白粗提物中分離出了桃過(guò)敏原蛋白Pru p 3，該方法雖然得到的蛋白純度較高，但是需要大型儀器支撐，操作較為復(fù)雜。鄧珊等[9]利用多肽合成儀結(jié)合固相合成法合成8 條覆蓋Pru p 3全部氨基酸序列的肽段，之后將每條肽段之間重疊5 個(gè)氨基酸，利用重疊肽段法最后得到桃過(guò)敏原蛋白Pru p 3。該方法雖然得到的蛋白純度較高但是需要大量成本，且需要大量驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)佐證。翟康樂(lè)等[10]利用AKTA avant柱層析對(duì)過(guò)敏原蛋白Pru p 3進(jìn)行純化，以不同紫外吸收波長(zhǎng)區(qū)分并純化收集桃過(guò)敏原蛋白Pru p 3。該方法雖然得到的目標(biāo)蛋白純度較高，但是操作較為復(fù)雜，成本較高，且對(duì)純化的目標(biāo)蛋白浪費(fèi)較多。因此在節(jié)約成本、減少繁瑣操作的同時(shí)盡可能多地得到純度較高的目標(biāo)蛋白是桃過(guò)敏原蛋白Pru p 3純化的關(guān)鍵。

本研究將水蜜桃、油桃、蟠桃及黃桃作為研究對(duì)象，以ZipTipC18微量層析柱作為純化工具一步純化桃過(guò)敏原蛋白Pru p 3，并在篩選出桃過(guò)敏原蛋白Pru p 3特征肽段的基礎(chǔ)上利用利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）檢測(cè)特征肽段的方法對(duì)純化后的桃過(guò)敏原蛋白Pru p 3進(jìn)行定性。旨在建立一種快速高效的過(guò)敏原蛋白Pru p 3純化方法，為開展桃過(guò)敏原后續(xù)研究提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

李子、杏、櫻桃、草莓購(gòu)自當(dāng)?shù)爻?，貯存于 －80 ℃冰箱。

水蜜桃（浙江奉化玉露水蜜桃）、油桃（北京瑞光5號(hào)油桃）、黃桃（湖南錦繡黃桃）、蟠桃（新疆石河子143蟠桃），于2019年6—10月分別采收于浙江、北京、湖南、新疆，貯存于－80 ℃冰箱。

甲醇、水（均為質(zhì)譜級(jí)） 美國(guó)Honeywell公司；甲酸（質(zhì)譜級(jí)） 美國(guó)Sigma公司；碳酸氫銨、氯化鈉、尿素、硫脲、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、鹽酸、乙醇、冰乙酸、稀鹽酸、磷酸、異丙醇 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；98%牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)R250、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris堿（pH 8.8）、Tris堿（pH 6.8）、10%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、10%過(guò)硫酸銨、四甲基乙二胺、甘氨酸、甘油、Marker、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA） 美國(guó) Bio-Rad公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Q-Trap 5500質(zhì)譜儀 美國(guó)AB SCIEX公司；LC-20 XR高效液相色譜系統(tǒng) 日本島津公司；5920 R型冷凍高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；渦旋振蕩器 德國(guó)IKA公司；UM 5破碎機(jī) 德國(guó)Stephan公司；R3088旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、冷凍干燥機(jī) 上海申生科技有限公司；1083型恒溫振蕩水浴 德國(guó)GFL公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）儀 美國(guó)Bio-Rad公司；ZipTipC18微量層析柱 美國(guó)Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

將保存于－80 ℃冰箱中的桃樣品取出，去皮，將桃肉及桃皮分別用組織研磨機(jī)打磨成漿，平鋪于研缽中并加入液氮不斷研磨后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿，之后在冷凍干燥機(jī)中凍干3 d。將桃凍干物研磨成粉，過(guò)80 目篩，裝袋密封保存于干燥器中。

1.3.2 桃過(guò)敏原蛋白提取

分別準(zhǔn)確稱量1 g桃凍干粉粉末加入到4 種提取液中：碳酸氫銨（ammonium bicarbonate，ABC）溶液（50 mmol/L）、磷酸緩沖溶液（10 mmol/L）、低鹽（0.1 mol/L）溶液、2% SDS溶液各10 mL）。其中ABC溶液、磷酸緩沖溶液、低鹽溶液以0 ℃對(duì)桃蛋白進(jìn)行冰浴提取，提取時(shí)間為1 h；SDS溶液以80 ℃對(duì)桃蛋白進(jìn)行熱提取，提取時(shí)間為1 h。蛋白提取后渦旋振蕩，超聲30 min（溫度不高于37 ℃）后取出，于4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，取上清液過(guò)0.22 μm聚四氯乙烯膜得到桃蛋白提取液，將過(guò)膜后的蛋白提取液以旋干復(fù)溶進(jìn)行濃縮，通過(guò)Q-Bit方法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，確保蛋白質(zhì)量濃度達(dá)到1 μg/μL以上，并于－80 ℃保存?zhèn)溆肹11]。

1.3.3 Pru p 3蛋白純化

以ZipTipC18微量層析柱作為純化工具對(duì)過(guò)敏原蛋白Pru p 3進(jìn)行一步純化，ZipTipC18微量層析柱首先在乙腈中平衡，然后在Milli-Q級(jí)水中與0.1%三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）平衡。吸取桃蛋白濃縮提取液，反復(fù)抽吸8 次。用0.1% TFA洗滌ZipTipC18微量層析柱，反復(fù)抽吸5 次，用4 μL 0.1% TFA-50%乙腈洗脫ZipTipC18微量層析柱吸附的蛋白，將收集的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，進(jìn)行比較對(duì)照，鑒定回收結(jié)果。其余于－80 ℃冰箱保存。

1.3.4 SDS-PAGE分析

采用15%分離膠與5%濃縮膠進(jìn)行桃蛋白SDS-PAGE分析，上樣量為20 μL，恒壓80 V進(jìn)行電泳120 min。電泳結(jié)束后，染色液染色90 min，脫色液脫色4 h后取膠塊進(jìn)行凝膠成像。

1.3.5 Pru p 3特征肽段篩選

在過(guò)敏原網(wǎng)站Allergen Search Results搜索“Pru p 3”，獲得該蛋白肽段信息，運(yùn)用PeptideCutter軟件對(duì)桃過(guò)敏原蛋白Pru p 3進(jìn)行模擬酶切，將酶切肽段在UniProtkB網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對(duì)，通過(guò)打分獲得特征肽段，之后通過(guò)Skyline軟件獲得特征肽段離子對(duì)信息[12]。特征肽段篩選原則如下：以7～20 個(gè)氨基酸為宜；不含錯(cuò)切或漏切的酶切位點(diǎn)；最好不含甲硫氨酸；具有穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì)；進(jìn)行定性定量分析時(shí)，具有較好的靈敏度和峰形。最終篩選出段響應(yīng)值較好、靈敏度較高的特征肽段[13]。

1.3.6 LC-MS/MS分析條件

色譜條件：色譜柱使用美國(guó)Phenomenex公司的Kinetex C18反相色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；流動(dòng)相A為0.1%甲酸-2%乙腈-98%水，流動(dòng)相B為0.1%甲酸-2%水-98%乙腈；梯度洗脫程序：0.1～0.5 min，98% A、2% B；0.5～25 min，92% A、8% B；25～31 min，78% A、22% B；31～33 min，65% A、35% B；33～36.5 min，20% A、80% B；36.5～39.9 min，98% A、2% B；柱溫40 ℃，進(jìn)樣量2 μL，流速0.4 mL/min。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離正離子模式；氣簾氣壓力30 psi；霧化氣壓力50 psi；輔助氣壓力50 psi；碰撞氣壓力6 psi；噴霧電壓5 500 V；電噴霧離子源溫度550 ℃；掃描方式：多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）[14]。

1.3.7 桃蛋白膜上酶切

將桃蛋白提取液從－80 ℃冰箱取出，置于4 ℃冰箱進(jìn)行解凍。通過(guò)Q-Bit進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定后進(jìn)行膜上酶切。加入10 μL IAA，室溫條件下避光放置15 min。將處理液全部轉(zhuǎn)移至5 kDa超濾離心管內(nèi)，12 000 r/min離心10 min后加入50 μL 50 mmol/L ABC溶液，12 000 r/min 離心10 min。之后加入100 μL 50 mmol/L的ABC溶液，12 000 r/min離心10 min，重復(fù)3 次。倒掉收集管中的廢液，用100 μL 質(zhì)譜水清洗2 次。膜上各加入100 μL 50 mmol/L的ABC溶液及4 μL 胰蛋白酶溶液，渦旋混勻后用封口膜封住，37 ℃條件下水浴酶切4 h。將酶切后的樣品取出，12 000 r/min離心10 min后加入100 μL 25 mmol/L的ABC溶液，12 000 r/min離心5 min，重復(fù)2 次[15]，合并收集液。

1.3.8 Pru p 3切膠回收鑒定

將SDS-PAGE膠片用刀片割下Pru p 3的條帶后水洗膠塊2 次，吸走液體。之后對(duì)較快膠塊脫色處理：加入考染脫色液100 μL（溶液的量視膠塊具體大小而定），室溫脫色1 h左右，直至膠塊顏色完全褪去，吸走液體。水洗膠塊，將脫色后的染料洗去，吸走液體。加入50%乙腈溶液讓膠塊脫水，棄去ACN后再加入100% ACN溶液，直至膠塊變白完全脫水，分別吸走液體。加入50 μL 10 mmol/L DTT溶液（溶于25 mmol/L ABC溶液），56 ℃水浴50 min，離心，吸走液體。之后加入50 μL 55 mmol/L IAA溶液（溶于25 mmol/L ABC溶液），避光反應(yīng)15 min，吸走液體。以100 μL超純水水洗膠塊，將反應(yīng)剩余液體吸走。加入胰酶5～20 μL（具體視膠塊大小而定），讓膠塊充分吸脹，變透明20 min，再剩余1～3 μL的酶液。37 ℃水浴過(guò)夜酶切16 h。－20 ℃冰箱保存待測(cè)樣品，用于LC-MS/MS-MRM鑒定[16-17]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

每組數(shù)據(jù)平行測(cè)定3 次。運(yùn)用SPSS 25.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均值的多重比較采用Duncan法，并進(jìn)行One-Way ANOVA檢驗(yàn)，P＜0.05，差異顯著。表格由Excel軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 桃蛋白提取液SDS-PAGE分析

經(jīng)Q-bit法定量總蛋白質(zhì)濃度，上述4 種緩沖液的蛋白提取質(zhì)量濃度分別為0、0.251、0.485 mg/mL和0.845 mg/mL，可以看出，ABC提取液對(duì)桃蛋白的提取濃度幾乎為0，SDS熱提取效果最好，因此選取SDS熱提取法對(duì)不同樣本的桃皮及桃肉中蛋白進(jìn)行提取，結(jié)果如圖1所示。桃過(guò)敏原蛋白Pru p 3的分子質(zhì)量為9 kDa，4 種桃類提取液中均含有桃過(guò)敏原蛋白Pru p 3，而桃皮中Pru p 3質(zhì)量濃度高于桃肉，與其他相關(guān)報(bào)道相符[18-20]。由圖1還可以看出，油桃的桃皮中Pru p 3含量較高，而蟠桃桃肉中Pru p 3含量較高。

圖1 SDS熱提取法對(duì)4 種桃蛋白提取SDS-PAGE圖Fig. 1 SDS-PAGE electrophoretograms of proteins extracted from four species of P. persica using hot SDS

2.2 桃過(guò)敏原蛋白Pru p 3純化

以ZipTipC18微量層析柱作為純化工具一步純化桃過(guò)敏原蛋白Pru p 3，將純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析。由圖2可以看出，該純化方法對(duì)4 種桃類桃皮及桃肉中的過(guò)敏原蛋白Pru p 3的純化效果明顯，由于桃肉中仍然含有部分雜蛋白，因此該方法對(duì)桃皮的純化效果優(yōu)于桃肉。通過(guò)比較條帶灰度值，桃皮及桃肉中Pru p 3純度均在95%以上，因此該純化方法高效且得率高。

圖2 桃過(guò)敏原蛋白Pru p 3純化SDS-PAGE圖Fig. 2 SDS-PAGE profiles of purified peach Pru p 3

2.3 Pru p 3特征肽段篩選與驗(yàn)證

圖3為Pru p 3的胰蛋白酶酶切肽段信息，由于胰蛋白酶酶切位點(diǎn)為K與R，因此將模擬酶切后的肽段ITCGQVSSALAPCIPYVR、GGGAVPPACCNGIR、NVNNLAR、TTPDR、QAACNCLK、QLSASVPGVNPNNAAALPGK、CGVHIPYK、ISASTNCATVK在UniProtkB網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對(duì)打分，除ITCGQVSSALAPCIPYVR與CGVHIPYK打分為100 分且只存在于桃中之外（100 分合格），其他肽段均不符合條件（肽段GGGAVPPACCNGIR、QAACNCLK、QLSASVPGVNPNNAAALPGK、ISASTNCATVK得分為100，但其不僅存在于桃中還分別存在于山荊子、豌豆、杏子、李子中，不具備特異性。肽段NVNNLAR、TTPDR得分未到100不合格），因此篩選出肽段ITCGQVSSALAPCIPYVR與CGVHIPYK作為桃過(guò)敏原蛋白Pru p 3的特征肽段[21]。表1為特征肽段ITCGQVSSALAPCIPYVR與CGVHIPYK的MRM參數(shù)。該參數(shù)所提供的母子離子對(duì)信息及保留時(shí)間等，有助于質(zhì)譜信號(hào)采集。圖4為桃過(guò)敏原蛋白Pru p 3特征肽段ITCGQVSSALAPCIPYVR與CGVHIPYK提取離子流圖。

圖3 桃過(guò)敏原蛋白Pru p 3胰蛋白酶酶切肽段信息Fig. 3 Trypsin cleavage of peach Pru p 3

表1 桃過(guò)敏原蛋白Pru p 3各肽段MRM參數(shù)Table 1 MRM parameters of peptides derived from peach Pru p 3

圖4 桃過(guò)敏原蛋白Pru p 3特征肽段ITCGQVSSALAPCIPYVR與CGVHIPYK提取離子流圖Fig. 4 Extracted ion current chromatograms of signature peptides ITCGQVSSALAPCIPYVR and CGVHIPYK from peach Pru p 3

由于桃屬于薔薇科水果，因此以篩選出的肽段ITCGQVSSALAPCIPYVR與CGVHIPYK為特征肽段，對(duì)李、杏、櫻桃、草莓4 種薔薇科陰性樣品的酶切肽段進(jìn)行LC-MS/MS分析，提取特征肽段的特征離子對(duì)，未發(fā)現(xiàn)陰性樣品中產(chǎn)生離子流峰響應(yīng)。由圖5可以看出，在保留時(shí)間為10 min及12 min時(shí)，并沒(méi)有響應(yīng)峰出現(xiàn)，說(shuō)明在李、杏、櫻桃、草莓4 種薔薇科水果中均不存在特征肽段ITCGQVSSALAPCIPYVR與CGVHIPYK，所篩選的肽段為特異性肽段[22-25]。

圖5 4 種陰性樣品薔薇科水果中Pru p 3特征肽段提取離子流圖Fig. 5 Extracted ion current chromatograms of signature peptides from Pru p 3 in negative samples of four Rosaceae fruits

熱殺菌是桃汁、桃果脯等桃制品最常用的殺菌方式之一，熱加工處理會(huì)對(duì)某些肽段產(chǎn)生降解作用，因此一條肽段是否具有熱穩(wěn)定性也是衡量其能否作為特征肽段的重要標(biāo)準(zhǔn)[26]。為此對(duì)篩選出的特征肽段進(jìn)行熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的考察，將桃蛋白提取液進(jìn)行煮沸處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)加熱煮沸后的桃蛋白提取液中特征肽段響應(yīng)值并沒(méi)有明顯變化（圖6），因此所篩選的特征肽段具有一定的熱穩(wěn)定性，經(jīng)過(guò)熱加工之后不會(huì)降解。

圖6 熱加工條件下桃過(guò)敏原蛋白Pru p 3特征肽段ITCGQVSSALAPCIPYVR與CGVHIPYK提取離子流圖Fig. 6 Extracted ion current chromatograms of signature peptides ITCGQVSSALAPCIPYVR and CGVHIPYK from boiled and unboiled peach Pru p 3

2.4 桃過(guò)敏原蛋白Pru p 3切膠回收鑒定

以之前篩選出的兩條肽段ITCGQVSSALAPCIPYVR與CGVHIPYK為特征肽段，通過(guò)質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)Pru p 3進(jìn)行切膠回收后的酶解液中均能提取出2 條特征肽段的離子對(duì)（圖7），因此可證明以ZipTipC18微量層析柱作為純化工具的一步純化法純化蛋白為桃過(guò)敏原蛋白Pru p 3。

圖7 桃過(guò)敏原蛋白Pru p 3切膠回收質(zhì)譜鑒定Fig. 7 Identification of peach Pru p 3 by mass spectrometry

3 討論與結(jié)論

目前桃過(guò)敏原蛋白Pru p 3的純化方法較多，但是不同的純化方法均存在其弊端，普遍存在著蛋白純化純度與操作難易程度呈反比的現(xiàn)狀[27]。相比較其他的純化方法而言，以ZipTipC18微量層析柱為純化工具一步純化出的桃過(guò)敏原蛋白Pru p 3不僅得率高，而且操作過(guò)程簡(jiǎn)單、節(jié)約成本，可以作為一種新型的桃過(guò)敏原蛋白Pru p 3的純化方法。但是由于植物基質(zhì)中存在幾種非蛋白質(zhì)化合物，如酚、脂、色素和碳水化合物，它們可能干擾蛋白分析過(guò)程，因此在進(jìn)行Pru p3蛋白純化之前，應(yīng)用乙醇有效分離脂質(zhì)和其他疏水物質(zhì)，防止污染ZipTipC18微量層析柱。Pru p 3屬于小分子蛋白，甚至分子質(zhì)量小于很多肽段，ZipTipC18微量層析柱不僅能對(duì)桃過(guò)敏原蛋白Pru p 3進(jìn)行分離純化，同時(shí)同樣適用于其他小分子疏水性蛋白的純化。在Pru p 3純化過(guò)程中發(fā)現(xiàn)在雖然桃果皮中Pru p 3的含量遠(yuǎn)高于果肉，但這種過(guò)敏原蛋白仍然存在于果肉當(dāng)中，這與其他研究相符[28-30]。因此對(duì)桃進(jìn)行去皮處理只能降低桃的致敏性，并不能達(dá)到脫敏的目的。

本研究描述了一種簡(jiǎn)單、高效、經(jīng)濟(jì)的提取和純化方法對(duì)桃過(guò)敏原蛋白Pru p3進(jìn)行純化，并且通過(guò)LC-MS/MS-MRM對(duì)該方法純化出的蛋白進(jìn)行鑒定，結(jié)果證明該方法能夠有效純化桃過(guò)敏原蛋白Pru p 3，且純度高達(dá)95%以上。