汪 濤，李雨琦，陳 浩

（1.蘇州大學(xué) 紡織與服裝工程學(xué)院，江蘇 蘇州 215123；2.現(xiàn)代絲綢國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 蘇州 215123）

1 絲素蛋白簡(jiǎn)介

蠶絲蛋白是一種基于蛋白質(zhì)的天然聚合物，憑借生物相容性、出色的機(jī)械性能以及遺傳序列的可控性等優(yōu)勢(shì)在物理、化學(xué)領(lǐng)域占有重要地位。脫膠蠶絲及再生絲素蛋白（Silk Fibroin）產(chǎn)品獲得美國(guó)食品和藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）的批準(zhǔn)以來(lái)，大大促進(jìn)了絲素蛋白生物材料及其醫(yī)療器械產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。絲素蛋白的主要構(gòu)型是Silk I、Silk Ⅱ與Silk Ⅲ結(jié)構(gòu)[1]。Silk I是具有鋸齒形的無(wú)定形構(gòu)象的亞穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)，屬于正交晶系，由于存在大量隨機(jī)線圈和α-螺旋，Silk I的結(jié)晶度最低，具有不穩(wěn)定性和水溶性。Silk Ⅱ（β-折疊與β-轉(zhuǎn)角）作為反平行的β-折疊構(gòu)象，屬于單斜晶系，且具有最高的結(jié)晶度，因此具有穩(wěn)定性、水不溶性、耐熱性和機(jī)械性。Silk Ⅲ是具有三重螺旋晶體的獨(dú)特多晶型結(jié)構(gòu)，即具有亞穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)，結(jié)晶度介于Silk I和Silk Ⅱ之間。絲素蛋白分子具有交替排列的親水鏈（Tyr、Ser）和疏水鏈（Gly、Ala），晶體區(qū)域主要由甘氨酸-X重復(fù)組成，其中，X是丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或纈氨酸，在這些域中，存在富含甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和酪氨酸的亞域[2]，如圖1所示。雖然絲素蛋白黏度低、缺少RGD序列，但具有可控制的降解性、多種膠凝過(guò)程、可自組裝、細(xì)胞友好性與體內(nèi)生物相容性等優(yōu)點(diǎn)，絲素蛋白水凝膠可以模仿組織和器官細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix，ECM）。

圖1 絲素蛋白分子鏈?zhǔn)疽?/p>

基于蛋白纖維的可延展性和韌性，蠶絲有著優(yōu)異的力學(xué)性能，甚至優(yōu)于彈性蛋白和凱夫拉爾纖維。這種優(yōu)越的特性賦予了蠶絲制備的絲素蛋白水凝膠出色的機(jī)械強(qiáng)度，因此，可以克服其他天然聚合物制備水凝膠時(shí)經(jīng)常遇到的一些局限性問(wèn)題。另外，對(duì)基于絲素蛋白的水凝膠進(jìn)行改性，通過(guò)化學(xué)序列和嵌段長(zhǎng)度修飾調(diào)整結(jié)晶度，并與不同的材料進(jìn)行物理混合，可以控制其功能和性能，使其成為特定生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的良好選擇[3]。絲素蛋白的應(yīng)用很廣泛，如凝膠、海綿、導(dǎo)管、微球、薄膜、纖維等[4]，如圖2所示。

圖2 絲素蛋白的材料應(yīng)用形式

和其他生物材料（例如膠原蛋白和聚乳酸）相比，絲素蛋白在組織中的炎癥反應(yīng)更弱。在強(qiáng)度方面，蠶絲優(yōu)于常用的聚合物可降解生物材料，例如膠原蛋白和聚(L-乳酸)（PLA）：蠶絲纖維的極限拉伸強(qiáng)度（Ultimate Tensile Strength，UTS）為740.0 MPa，膠原蛋白的UTS為0.9～7.4 MPa，PLA的UTS為28.0～50.0 MPa。這也是絲素蛋白水凝膠得以廣泛應(yīng)用的原因。目前，絲素蛋白已被用于腦部軟組織、皮下組織和骨骼組織等多項(xiàng)體內(nèi)研究，具有能適應(yīng)各種生物組織機(jī)械強(qiáng)度的靈活性。

2 絲素蛋白水凝膠的交聯(lián)方式

絲素蛋白水凝膠結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的完整性取決于聚合物鏈之間通過(guò)各種物理相互作用和化學(xué)鍵形成的交聯(lián)，成為適合特定生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的產(chǎn)品。有多種方法可以幫助塑造聚合物網(wǎng)絡(luò)，通常分為物理方法和化學(xué)方法。對(duì)于物理水凝膠而言，次級(jí)力（氫鍵、離子鍵和疏水相互作用）將聚合物網(wǎng)絡(luò)結(jié)合在一起。聚合物鏈之間存在的共價(jià)鍵會(huì)形成網(wǎng)絡(luò)，從而形成化學(xué)水凝膠，這些條件對(duì)防止水凝膠聚合物鏈溶解到液體生物環(huán)境中、控制其降解速率起到一定的作用。與其他水凝膠一樣，絲素蛋白水凝膠的類型取決于聚合物鏈之間鍵的類型，分為物理交聯(lián)制備的絲素蛋白水凝膠與化學(xué)交聯(lián)制備的絲素蛋白水凝膠[5]（見(jiàn)表1）。

表1 絲素蛋白水凝膠的成膠方式

2.1 物理交聯(lián)絲素蛋白水凝膠

物理交聯(lián)絲素蛋白水凝膠是由絲素蛋白分子的構(gòu)象變化產(chǎn)生的，從無(wú)規(guī)卷曲到β-折疊，意味著疏水鏈段的自組裝。這種穩(wěn)定在正常情況下是不可逆的，但是酶或氧化反應(yīng)可降解這些水凝膠，通過(guò)物理誘導(dǎo)制備的絲素蛋白水凝膠的影響因素包括溫度、pH、超聲處理、剪切力、表面活性劑以及使用的陰離子試劑（例如Ca2+和K+）。

有學(xué)者通過(guò)向纖維蛋白溶液中添加檸檬酸來(lái)獲得絲素蛋白水凝膠。檸檬酸凝膠制成后，在50 ℃下處理12 h。體外和體內(nèi)結(jié)果證明其擁有較高的生物相容性和骨缺損修復(fù)性。酸性pH不利于細(xì)胞存活，因此，通過(guò)改變pH制備的絲素蛋白水凝膠不適合直接作為細(xì)胞載體材料。還有學(xué)者將超聲處理的溶液添加到小培養(yǎng)皿中，并保存在37 ℃的培養(yǎng)箱中，目測(cè)凝膠化過(guò)程，直到凝膠呈現(xiàn)不透明外觀并形成凝結(jié)表面。他們制備的凝膠的絲素蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4%、8%和12%時(shí)，壓縮強(qiáng)度約為30、100和200 kPa。此外，使用4%、8%和12%絲素蛋白水凝膠封裝包埋人間充質(zhì)干細(xì)胞（Human Mesenchymal Stem Cells，hMSC）。在整個(gè)研究過(guò)程中，hMSC在4%的凝膠中呈圓形，沒(méi)有聚集。通過(guò)電流作用制備黏性水凝膠，切換電壓正負(fù)極，成膠過(guò)程可逆，有利于形成可調(diào)黏合力。

物理交聯(lián)絲素蛋白水凝膠是細(xì)胞封裝的潛在候選者，因?yàn)檫@類水凝膠通常具有更好的細(xì)胞相容性。物理交聯(lián)是一種生態(tài)友好的過(guò)程，決定了物理交聯(lián)絲素蛋白水凝膠的細(xì)胞毒性較低，但物理交聯(lián)水凝膠的弱力學(xué)性能和可調(diào)控性限制了其在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域的應(yīng)用。

2.2 化學(xué)交聯(lián)絲素蛋白水凝膠

絲素蛋白的化學(xué)交聯(lián)可以通過(guò)非酶或酶交聯(lián)劑促進(jìn)官能團(tuán)（例如—OH，—NH2和—COOH）之間的化學(xué)反應(yīng)，在分子內(nèi)和分子間形成共價(jià)鍵來(lái)實(shí)現(xiàn)。

戊二醛（GTA）是應(yīng)用最廣泛的化學(xué)交聯(lián)劑，可以促進(jìn)賴氨酸的氨基和酪氨酸的酚羥基與絲素蛋白分子的反應(yīng)。但GTA的應(yīng)用因細(xì)胞毒性而受到限制，特別是與天然化學(xué)交聯(lián)劑[如京尼平（Genipin）和聚環(huán)氧化合物]相比。

Genipin是一種天然的交聯(lián)劑，相比于GTA，Genipin的細(xì)胞毒性低得多（幾乎是10 000倍），細(xì)胞增殖能力強(qiáng)得多（大約5 000倍）。這些特性使Genipin成為制備水凝膠的理想化學(xué)交聯(lián)劑。但Genipin造價(jià)昂貴，且絲素蛋白與Genipin的反應(yīng)主要與賴氨酸和精氨酸（基于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)）的反應(yīng)有關(guān)，而賴氨酸和精氨酸的氨基酸在絲素蛋白的組成中占比較小，每種氨基酸約為0.6%，導(dǎo)致凝膠交聯(lián)效率與穩(wěn)定性不高。

辣根過(guò)氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）是一種可以催化過(guò)氧化氫（H2O2）形成超氧自由基的酶，而超氧自由基可以催化絲素蛋白分子內(nèi)酪氨酸之間形成雙亮氨酸和三酪氨酸結(jié)合體，從而交聯(lián)絲素蛋白分子，已被用作酶催化的交聯(lián)劑，以促進(jìn)絲素蛋白中共價(jià)交聯(lián)的形成，制備絲素蛋白水凝膠。這種方法所得水凝膠顯示出高彈性和可調(diào)的剛度，但HRP作為外源性活性酶制劑，進(jìn)入體內(nèi)引起的生理反應(yīng)并沒(méi)有研究透徹，因此暫時(shí)未被FDA批準(zhǔn)。

3 展望

如果能找到一種可以穩(wěn)定交聯(lián)絲素蛋白的交聯(lián)劑，得到一種交聯(lián)效率高、機(jī)械性能良好且有一定生物相容性的絲素蛋白水凝膠，就能為絲素蛋白水凝膠在組織填充劑領(lǐng)域的研究和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供理論方法和實(shí)驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)。