付 強(qiáng)，陳 偉，李 江，馮 弦，史富強(qiáng)，陳紹安

（1.云南省林業(yè)和草原科學(xué)院，云南昆明 650201；2.普洱市林業(yè)和草原種苗工作站，云南普洱 665000；3.普洱市林業(yè)科學(xué)研究所，云南普洱 665000）

思茅松（Pinus kesiyavar.langbianensis）是一種鄉(xiāng)土材脂兼用樹種，主要分布在云南省哀牢山以西的南亞熱帶山區(qū)，具有生長快、耐貧瘠、材質(zhì)優(yōu)和產(chǎn)脂高等特點(diǎn)，是云南林產(chǎn)業(yè)的明星樹種[1]。圍繞思茅松已形成林化、林板及林槳紙等產(chǎn)業(yè)[2]。目前，思茅松的研究主要集中在人工林培育[2]、生態(tài)學(xué)[3]、碳匯計量[4]和功能基因的克隆與分析[5]等方面，在良種選育方面較為滯后，仍處于一代種子園階段，與馬尾松（Pinus masonnianna）、杉木（Cunninghamia lan?ceolata）等全面進(jìn)入高世代育種的針葉樹種相比，差距較大，不能有效地支撐思茅松下游相關(guān)產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。

雜交育種是培育新品種最有效和最常用的手段之一[6]，是思茅松種質(zhì)創(chuàng)新的一條重要途徑，也是高世代育種的基礎(chǔ)。花粉是種子植物在自然條件下遺傳信息交流的載體[7-9]，花粉受精過程能否順利完成是植物雜交育種的關(guān)鍵。在實踐過程中，計劃進(jìn)行的交配經(jīng)常會遇到花期不遇的問題，或需要在異地開展雜交工作，對花粉進(jìn)行有效的保存至關(guān)重要，花粉的研究也成為遺傳改良的重要研究內(nèi)容之一。評價花粉保存成效的最有效手段是測定花粉活力。目前，對于思茅松花粉的研究，僅見陳偉等[10]對思茅松花粉離體萌發(fā)條件的研究，以及付強(qiáng)等[11]對思茅松花粉快速測定方法的比較，尚未見有關(guān)思茅松花粉貯藏方法的研究報道。本研究在優(yōu)化思茅松花粉活力測定方法的基礎(chǔ)上，對思茅松花粉貯藏條件進(jìn)行探索，旨在為思茅松雜交育種工作的順利開展提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

思茅松花粉來源于云南省景谷縣文郎林場思茅松無性系種子園（100°29′E，23°29′N），于2003年7月建成，海拔1 600 m?；ǚ鄢墒旌髸男矍蚧ㄉ献匀簧⒙洌来伺袛嗷ǚ鄣某墒於炔⒉杉牧?。2019年2月，從同一植株4 個方位枝條上采集頂端開始散粉的雄球花，將雄球花放入大號紙袋中帶回實驗室，在硫酸紙上攤開，自然陰干散粉，過篩后的花粉經(jīng)硅膠干燥72 h后儲存于密封瓶中備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 花粉萌發(fā)率測定時間的確定

采用離體培養(yǎng)法測定萌發(fā)率，培養(yǎng)基為100 mg/L H3BO3溶液。以當(dāng)年新鮮的思茅松花粉為材料，在2 mL 的離心管中加入1 mL 的培養(yǎng)基，再加入10 mg花粉，震蕩離心管，讓花粉粒與培養(yǎng)液充分混合，隨后將離心管置于28 ℃的培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)12、24、36、48、60 和72 h 后取樣，震蕩離心管，用吸管吸取樣品置于載玻片上，蓋上蓋玻片進(jìn)行鏡檢[10]。觀測花粉的萌發(fā)過程，統(tǒng)計萌發(fā)率，測量花粉管長度，確定測定的最佳時間。每處理設(shè)4個重復(fù)。

1.2.2 貯藏條件對花粉萌發(fā)率的影響

將新鮮制備好的花粉分裝于底部放有變色硅膠的密封瓶中，標(biāo)記后分別置于常溫（室溫）、4、-18和-80 ℃條件下保存，0.5年和1年后分別取樣，于28 ℃恒溫箱暗培養(yǎng)48 h，統(tǒng)計花粉的萌發(fā)情況。每處理設(shè)4個重復(fù)。以貯藏前的花粉萌發(fā)率測定值為對照（CK）。

1.2.3 指標(biāo)測定

采用Leica顯微鏡（DM2500，德國）進(jìn)行鏡檢，使用其自帶的數(shù)碼成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，每張樣片隨機(jī)觀察4 個視野，單個視野花粉數(shù)量大于50 粒。當(dāng)花粉管長度大于花粉粒直徑時為花粉萌發(fā)，花粉管長度是花粉萌發(fā)的判斷依據(jù)，也是判斷花粉活力大小的重要指標(biāo)。利用成像系統(tǒng)自帶的測量工具測量萌發(fā)花粉粒的花粉管長度。

花粉萌發(fā)率= 觀察視野萌發(fā)的花粉數(shù)/觀察視野花粉總數(shù)×100%

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 軟件進(jìn)行處理與分析，采用DPS 18.10軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 思茅松花粉萌發(fā)率測定時間

12 h可觀測到思茅松花粉萌發(fā)，萌發(fā)率為4.8%；隨著培養(yǎng)時間的延長，萌發(fā)率逐漸升高，36～48 h 急劇升高，48 h 后趨于平穩(wěn)，48、60 和72 h 的萌發(fā)率差異不顯著（表1）。12 h 萌發(fā)花粉?；ǚ酃艿钠骄L度為55.1 μm（花粉粒的平均直徑為49.8 μm）；隨著培養(yǎng)時間的延長，花粉管的長度不斷伸長，48 h 萌發(fā)花粉?；ǚ酃艿钠骄L度為98.1 μm，約為花粉粒直徑的2 倍；72 h 萌發(fā)花粉?；ǚ酃艿钠骄L度為182.8 μm；48 h后萌動的花粉粒，花粉管長度較少能達(dá)到萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)。

表1 思茅松花粉在不同培養(yǎng)時間的萌發(fā)情況Tab.1 Pollen germination of P.kesiya var.langbianensis in different culture time

2.2 貯藏條件對花粉萌發(fā)率的影響

0.5年時，4 種貯藏方式的花粉萌發(fā)率均有不同程度的降低（表2）。其中，常溫干燥貯藏的花粉萌發(fā)率最低（19.2%），比CK（圖1a）降低69.7%；隨著溫度的降低，花粉萌發(fā)率逐漸升高，超低溫（-80 ℃）干燥保存的花粉相對不容易失活，與CK 相比降低29.8%～36.1%（圖1b～e）。方差分析和多重比較表明，不同貯藏方式間的花粉萌發(fā)率差異極顯著（P＜0.01），3 種低溫干燥貯藏方式間的花粉萌發(fā)率差異不顯著。

表2 不同貯藏方式花粉萌發(fā)率（0.5年）Tab.2 Pollen germination rate of different storage methods(0.5 years)(%)

1年時，4 種貯藏方式的花粉萌發(fā)率大幅降低（表3）。其中，常溫干燥貯藏的花粉萌發(fā)率僅為2.3%，與0.5年時相比降低88.0%，與CK 相比降低96.4%，絕大多數(shù)花粉已經(jīng)失去活力；超低溫干燥貯藏的花粉萌發(fā)率僅為25.5%，3種低溫干燥貯藏的花粉萌發(fā)率與CK 相比分別降低了63.7%、63.7%和59.7%（圖1f～i）。方差分析和多重比較顯示，各處理間差異極顯著（P<0.01），3 種低溫干燥貯藏方式間的花粉萌發(fā)率差異不顯著。

表3 不同貯藏方式花粉萌發(fā)率（1年）Tab.3 Pollen germination rate of different storage methods(1 year)(%)

圖1 不同貯藏方式思茅松花粉萌發(fā)情況（28 ℃，48 h）Fig.1 Pollen germination of P.kesiya var.langbianensis in different storage methods(28℃,48 h)

3 討論與結(jié)論

花粉活力測定常用的方法有染色法和離體萌發(fā)法。染色法具有簡便快速的特點(diǎn)，但準(zhǔn)確性差[12]；離體萌發(fā)法根據(jù)花粉離體培養(yǎng)時的萌發(fā)率判斷其生活力[13]，被認(rèn)為是花粉活力測定最可靠和穩(wěn)定的方法[14]。離體萌發(fā)法中，影響花粉萌發(fā)的因子較多，如培養(yǎng)基成分、pH值、培養(yǎng)溫度和時間等，篩選出最優(yōu)的培養(yǎng)條件需進(jìn)行大量試驗；其次，離體萌發(fā)法進(jìn)行花粉測定所需時間較長，在確保準(zhǔn)確性的前提下，盡可能地縮短測定時間，是離體萌發(fā)法需要優(yōu)化的方向。本研究在初步優(yōu)化出最適培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，探討測定萌發(fā)率的最佳時間。48 h 前花粉的萌發(fā)率持續(xù)增加，48 h后花粉萌發(fā)率無顯著變化，說明花粉粒萌發(fā)高峰已過。繼續(xù)觀察48 h 后花粉的萌發(fā)形態(tài)，發(fā)現(xiàn)新萌動的花粉粒極少，且花粉管長度未達(dá)到萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，說明新萌發(fā)的花粉粒較少；48 h后花粉管開叉生長且交錯的幾率增加，導(dǎo)致無法測量花粉管長度。從另一方面說明48 h 為統(tǒng)計花粉萌發(fā)率的重要時間節(jié)點(diǎn)。48 h時花粉管長度接近花粉粒直徑的兩倍，能直觀地從花粉管長度判定花粉萌發(fā)情況，也能準(zhǔn)確測量花粉管長度，所以48 h 是本試驗最佳的花粉活力測定時間。

花粉活力的保持一方面由遺傳因素所決定，另一方面受環(huán)境因素的影響[15]。有些物種的花粉在適當(dāng)?shù)臏囟群透稍飾l件下可以保存數(shù)年[16]，如細(xì)葉按（Eucalyptus tereticornis）花粉經(jīng)干燥和抽真空處理，在-18～-20 ℃條件下貯藏42 個月后萌發(fā)率仍能達(dá)到66.4%[17]；松屬的班克松（P.banksiana）在2 ℃和25.75%相對濕度條件下貯藏1年后，其花粉萌發(fā)率幾乎無變化[16]；汪企明等[18]對松屬6種松樹花粉的研究表明，干燥后的花粉在低溫、真空條件下貯藏6個月后，花粉萌發(fā)率的降幅均低于5%，16 個月后花粉萌發(fā)率降幅達(dá)11%～55%，說明條件適宜時，松樹花粉可長時間貯藏。本研究的思茅松花粉在低溫干燥條件下貯藏6 個月后，花粉萌發(fā)率降低29.8% ～36.1%，遠(yuǎn)高于汪企明等[18]的研究結(jié)果，可能是因為樹種的差異，也可能是貯藏條件中氧氣含量的差異所致。本研究的所有貯藏方式均未進(jìn)行抽真空處理，呼吸作用是細(xì)胞有活性的一個特征，氧氣含量的降低會抑制花粉粒的呼吸作用，能延長花粉壽命，推測低溫、干燥和低氧環(huán)境可能是延長思茅松花粉貯藏時間的關(guān)鍵因子。

思茅松花粉在低溫干燥條件下貯藏1年后，花粉萌發(fā)率可保留25%左右，相較于貯藏前，雖然花粉萌發(fā)率降低達(dá)63.7%，但仍然具有一定的應(yīng)用前景。松屬植物在開展人工輔助授粉時，鮮花粉常添加填充劑，花粉與填充劑的比例為2∶8 或3∶7[16]，保存的松屬植物花粉萌發(fā)率與思茅松低溫干燥保存1年后花粉萌發(fā)率相近，說明低溫干燥保存方式已能滿足生產(chǎn)上的使用，當(dāng)花粉需要隔年使用時，可使用該簡易方法進(jìn)行花粉貯藏。

以100 mg/L H3BO3溶液為萌發(fā)培養(yǎng)基，在28 ℃恒溫條件下暗培養(yǎng)，12 h 可觀測到思茅松花粉粒萌發(fā)，48 h后花粉萌發(fā)率趨于平穩(wěn)，且具有較好的花粉萌發(fā)識別度，48 h 是該試驗條件下花粉活力測定的最佳時間。4 種方式貯藏1年后，花粉活力降低59.8%～96.4%，低溫干燥相較于常溫干燥更有利于思茅松花粉萌發(fā)率的保持，3 種低溫干燥貯藏方式間花粉萌發(fā)率的差異不顯著，低溫干燥保存1年的思茅松花粉萌發(fā)率能滿足生產(chǎn)的要求。