蘇莉花，陳寶玲，舒 杰，龔建英，楊開(kāi)太，周千淞，汪小玉，陶夢(mèng)華

（1.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，廣西南寧 530002；2.廣西壯族自治區(qū)國(guó)有七坡林場(chǎng)，廣西南寧 530225）

蘭科（Orchidaceae）兜蘭屬（Paphiopedilum）植物在自然條件下繁殖力低，種群更新緩慢，野生資源瀕危；其人工繁殖近年來(lái)發(fā)展較快，但存在人工繁殖系數(shù)低、成苗慢、成本高和產(chǎn)出少等問(wèn)題，導(dǎo)致兜蘭屬植物產(chǎn)業(yè)發(fā)展遭遇瓶頸[1-3]。

蘭科菌根真菌是指能與蘭科植物的根（或根狀器官）形成內(nèi)共生關(guān)系或與蘭科植物形成單向有利關(guān)系的真菌類(lèi)群，有明顯的專(zhuān)一性，并與共生蘭科植物的稀有性和瀕危性顯著相關(guān)[1]。蘭科菌根真菌具有獨(dú)特的生態(tài)功能，可促進(jìn)種子萌發(fā)和幼苗形態(tài)發(fā)生，有助于蘭科植物的遷地保護(hù)、就地保護(hù)和離體保存與再引入，影響生物群落組成，有利于生態(tài)系統(tǒng)的保護(hù)、恢復(fù)與重建[4-5]。蘭科菌根真菌有豐富的多樣性，與宿主蘭科植物在植株不同的生長(zhǎng)階段有不同的營(yíng)養(yǎng)關(guān)系和作用方式，即蘭科植物在每個(gè)生長(zhǎng)階段都有對(duì)其最有效的菌根真菌，菌苗始終保持共生關(guān)系[4-6]。在蘭科植物的人工栽培中引入菌根化育苗技術(shù)，幼苗移栽成活率、鮮質(zhì)量增長(zhǎng)率、干物質(zhì)積累及礦質(zhì)元素吸收等均顯著提高[7-8]。一些菌根真菌的代謝產(chǎn)物能分泌赤霉素和IAA 等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[9-10]，這些真菌可構(gòu)成有益真菌群落。與大花蕙蘭（Cymbidium faberi×hybridum）形成有益共生體的黃絲菌科（Cephalothecaceae）Cephalotheca屬真菌通過(guò)侵染大花蕙蘭的根被細(xì)胞，可極大地促進(jìn)植株對(duì)鈣、鎂和鋅等礦質(zhì)元素的吸收，提高幼苗抗性，促進(jìn)生長(zhǎng)素和葉綠素的合成，減少葉綠素降解和碳水化合物的形成[10-12]。分離自野生石斛（Dendrobium nobile）根部的3 株優(yōu)勢(shì)真菌與兩種石斛組培苗共生培養(yǎng)16 天后，可顯著提高鮮重、酶活性及光效應(yīng)，使植物保持較高的葉綠素a/b值[13]。目前，對(duì)蘭科菌根真菌與兜蘭屬植物共生作用的深入研究較少。

本研究將分離篩選得到的有益菌根真菌與不同生長(zhǎng)階段的帶葉兜蘭（P.hirsutissimum）馴化苗分別進(jìn)行共生培養(yǎng)，分析5 個(gè)月后馴化苗生長(zhǎng)指標(biāo)的變化，對(duì)比不同生長(zhǎng)階段馴化苗生長(zhǎng)指標(biāo)的差異，驗(yàn)證蘭科菌根真菌的功效，探討菌根真菌與帶葉兜蘭共生關(guān)系建立的最佳時(shí)期與不同菌根真菌的適用范圍。將菌根真菌應(yīng)用于菌根育苗實(shí)踐，促進(jìn)兜蘭屬植物幼苗的快速繁殖，縮短苗期，可為珍稀瀕危植物的保護(hù)提供理論依據(jù)，為兜蘭產(chǎn)業(yè)的規(guī)?；l(fā)展提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試植株

供試的帶葉兜蘭馴化苗分別為試管苗出瓶移栽后的1年生和2年生苗，長(zhǎng)勢(shì)基本一致；1年生苗有4～6 條根，4～5 片葉，葉幅5～6 cm；2年生苗有7～8條根，6～7片葉，葉幅8～10 cm。

1.1.2 供試菌株

菌株為PF01、PF02、PF06 和PF07，其中PF01、PF06 和PF07 分離自廣西天峨縣野生帶葉兜蘭新鮮營(yíng)養(yǎng)根，PF02 分離自廣西那坡縣野生紫紋兜蘭（P.purpuratum）新鮮營(yíng)養(yǎng)根，經(jīng)篩選和驗(yàn)證均為帶葉兜蘭的菌根真菌。經(jīng)16S rDNA序列測(cè)定與分析，PF01為Cladosporium perangustum，PF02 為Kirschsteinio?thelia tectonae，PF06 為Phialophorasp.,PF07 為Cy?phellophorasp.。

1.1.3 基質(zhì)及容器

栽培基質(zhì)為松樹(shù)皮、火山巖和木炭的混合基質(zhì)（4∶2∶1），高溫滅菌后裝入容器中。容器為塑料透明軟杯；1年生苗的栽培容器為1.5 寸杯（口徑5 cm、高5 cm、底徑3.5 cm），基質(zhì)粒徑0.7～1.0 cm；2年生苗的栽培容器為2.5 寸杯（口徑8 cm、高8 cm、底徑5 cm），基質(zhì)粒徑1.5～2.0 cm；2株/杯。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化

將供試的4 個(gè)菌株接種至PDA 培養(yǎng)基平板上，在光照培養(yǎng)箱中28 ℃恒溫暗培養(yǎng)5～7天。

1.2.2 液體菌劑制備

用打孔器（直徑5 mm）在活化的4 個(gè)菌株菌落邊緣打孔，制成菌餅；將菌餅分別移入裝有150 mL PDB 培養(yǎng)基的三角瓶中，每個(gè)三角瓶接種2～3個(gè)菌餅。接種后，將三角瓶置于28 ℃、140 r/min 的搖床上連續(xù)培養(yǎng)10 天，收獲并過(guò)濾菌絲體；將菌絲體用無(wú)菌水沖洗3～5 次，置于研缽中研磨成勻漿；稱(chēng)取2.0 g 勻漿置于試管中，加入10 mL 無(wú)菌水，制成菌懸液備用。

1.2.3 接種方法

在離馴化苗莖基部2 cm 處，刨開(kāi)表面基質(zhì)，用10 mL 一次性注射器吸取菌懸液注入，用量為10 mL/杯。每處理30杯，重復(fù)3次。每20天澆施1次菌懸液，連續(xù)進(jìn)行3～4 次，期間停止施肥及施藥。以無(wú)菌水等量澆施為對(duì)照（CK）。

1.2.4 蘭科菌根真菌重分離

共生培養(yǎng)150 天后，取帶葉兜蘭接種菌株的1年生和2年生馴化苗植株和CK 植株若干，挑選新生根系，經(jīng)0.1% HgCl2溶液表面消毒1 min 后，用無(wú)菌水清洗4 次。采用組織塊分離法[14]進(jìn)行菌根真菌重分離，將新生根系置于含1 μL/mL 慶大霉素的PDA培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫暗培養(yǎng)7～10天，觀(guān)察各處理根系長(zhǎng)菌的情況。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

2021年2月，共生培養(yǎng)150 天后，采用電子天平（精度為0.000 1 g）測(cè)定幼苗鮮重；采用游標(biāo)卡尺（精度為0.1 mm）測(cè)量根系長(zhǎng)度、葉幅、葉長(zhǎng)和葉寬等指標(biāo)，記錄新根數(shù)和萌芽數(shù)；晴天上午9 點(diǎn)，采用便攜式葉綠素儀（SPAD-502）測(cè)定葉綠素的相對(duì)含量；取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；采用DPS7.05 軟件進(jìn)行Duncan's新復(fù)極差檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 共生關(guān)系的建立

培養(yǎng)150 天后，接種菌株的馴化苗植株在重分離中均能分離出對(duì)應(yīng)的原接種菌株，在CK 植株中主要分離出鐮刀菌（Fusarium）菌株（表1）。說(shuō)明原接種菌株與帶葉兜蘭幼苗形成了共生關(guān)系，確定為帶葉兜蘭的蘭科菌根真菌。

表1 菌根真菌重分離情況Tab.1 Re-isolation of mycorrhizal fungi

2.2 蘭科菌根真菌對(duì)1年生馴化苗生長(zhǎng)的影響

各處理間1年生馴化苗的生長(zhǎng)差異較大，接種菌株馴化苗的整體長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)于不接種（圖1a）。PF06處理的1年生馴化苗生長(zhǎng)最好，各指標(biāo)均表現(xiàn)較好；鮮重、葉幅和葉長(zhǎng)均極顯著優(yōu)于其他處理（P<0.01）（表2）。PF06 處理的新根數(shù)最多（2.2 條），與PF07處理差異顯著（P< 0.05），與CK 處理差異極顯著（P<0.01）；其次為PF01 和PF02 處理，分別為1.5 和1.4條。PF06處理的根最長(zhǎng)（17.5 cm），與CK 處理差異顯著（P<0.05）；其次為PF07、PF01和PF02處理，分別為16.3、16.1 和13.5 cm，三者間差異不顯著。PF06處理的葉最寬（1.6 cm），與CK處理差異極顯著（P< 0.01）。PF01 處理的相對(duì)葉綠素含量最高（31.6%），與PF02 處理差異極顯著（P<0.01）。在1年生階段，最佳的菌根真菌為PF06，接種后，幼苗生長(zhǎng)迅速，根系活力提高，新葉生長(zhǎng)較快，平均萌芽數(shù)0.4 個(gè)，體現(xiàn)了良好的菌-苗共生關(guān)系，促生效果好；PF01 和PF02 有利于植株根的生長(zhǎng)發(fā)育；PF01 有利于增強(qiáng)光合作用。

表2 菌根真菌對(duì)1年生馴化苗生長(zhǎng)的影響Tab.2 Effects of mycorrhizal fungi on growth of 1-year-old seedlings

2.3 蘭科菌根真菌對(duì)2年生馴化苗生長(zhǎng)的影響

各處理間2年生馴化苗的生長(zhǎng)差異也較大，接種菌株馴化苗的整體長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)于不接種（圖1b）。PF06 處理的2年生馴化苗生長(zhǎng)最好，除根長(zhǎng)和相對(duì)葉綠素含量外，其他生長(zhǎng)指標(biāo)均表現(xiàn)最好，平均鮮重14.4 g，平均萌芽數(shù)1.5 個(gè)，新根數(shù)3.1 條，葉幅28.3 cm，葉長(zhǎng)19.4 cm，葉寬1.9 cm，均極顯著優(yōu)于CK 處理（P< 0.01）（表3）。PF01 處理的根最長(zhǎng)（28.4 cm）；除葉幅與PF06 處理差異極顯著（P<0.01）外，其他生長(zhǎng)指標(biāo)均與PF06 處理差異不顯著。PF02 處理的相對(duì)葉綠素含量最高（31.5%）；除鮮重與PF06 處理差異顯著（P< 0.05）外，其他生長(zhǎng)指標(biāo)均與PF06 處理差異不顯著。PF07 處理的葉片生長(zhǎng)較好，葉幅、葉長(zhǎng)和葉寬均顯著或極顯著優(yōu)于CK 處理（P<0.05，P<0.01）。真菌PF06 為對(duì)2年生帶葉兜蘭馴化苗整體生長(zhǎng)最好的菌株，PF01可較好地促進(jìn)植株根系的生長(zhǎng)發(fā)育，PF02可促進(jìn)植株地上和地下部分的生長(zhǎng)，PF07有利于植株葉片生長(zhǎng)。

圖1 菌根化育苗Fig.1 Mycorrhizal seedling

表3 菌根真菌對(duì)2年生馴化苗生長(zhǎng)的影響Tab.3 Effects of mycorrhizal fungi on growth of 2-year-old seedlings

2.4 蘭科菌根真菌對(duì)1年生和2年生馴化苗各生長(zhǎng)指標(biāo)增長(zhǎng)的影響

對(duì)比分析共生150 天后接種PF06 與CK 處理的1年生和2年生馴化苗的各項(xiàng)指標(biāo)（圖2）。接種菌株植株在兩個(gè)生長(zhǎng)階段的主要生長(zhǎng)指標(biāo)增幅基本一致，即PF06對(duì)兩個(gè)生長(zhǎng)階段的植株均能產(chǎn)生較好的促生作用。接種PF06 處理兩個(gè)階段馴化苗的各生長(zhǎng)指標(biāo)增量（除1年生相對(duì)葉綠素含量）均高于CK處理，體現(xiàn)了菌根真菌較好的促生效果。

圖2 PF06對(duì)帶葉兜蘭兩個(gè)生長(zhǎng)階段馴化苗生長(zhǎng)指標(biāo)增長(zhǎng)的影響Fig.2 Effects of PF06 on increments of growth indexes in two growth stages of P.hirsutissimum seedlings

3 討論與結(jié)論

蘭科植物是一種典型的菌根植物，要完成整個(gè)生命史并在生態(tài)系統(tǒng)中生存，離不開(kāi)菌根真菌和微生物的促進(jìn)作用。在同一蘭科植物不同的生長(zhǎng)階段，適宜其生長(zhǎng)的菌根真菌種類(lèi)及真菌發(fā)揮的功能有所不同，菌苗間的營(yíng)養(yǎng)關(guān)系表現(xiàn)各異[12,15-16]。苗期是蘭科植物生長(zhǎng)的瓶頸期，此時(shí)植株對(duì)不適宜共生病原菌的抗性最低[17]。五唇蘭（Doritis pulcherrima）與內(nèi)生真菌建立共生的專(zhuān)一性隨生長(zhǎng)形態(tài)（生理階段）的不同而顯著不同，種子共生萌發(fā)率低，但原球莖和幼嫩植株能與多種真菌有效共生，移栽后粗放管理的菌根苗成活率可達(dá)100%，成株后共生真菌的分布范圍相對(duì)寬松，體現(xiàn)了蘭科菌根體系的生存適應(yīng)性[18-19]。根據(jù)植物的生長(zhǎng)階段，現(xiàn)有的蘭科植物菌根化育苗技術(shù)可分為播種菌根化育苗、瓶?jī)?nèi)菌根化育苗和移栽菌根化育苗3 種[20]，這些育苗技術(shù)在蘭科植物栽培和保育中均有報(bào)道。

兜蘭屬植物為較原始的蘭科植物種類(lèi)之一，自然繁殖慢，人工繁殖難度比其他蘭科植物大，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)。將菌根真菌應(yīng)用于帶葉兜蘭的人工育苗實(shí)踐，可促進(jìn)馴化苗生長(zhǎng)，不同菌株在馴化苗的不同生長(zhǎng)階段促生效果不同。PF06 對(duì)帶葉兜蘭1年生和2年生馴化苗的整體生長(zhǎng)均有較好的促生作用，體現(xiàn)了該菌對(duì)帶葉兜蘭幼苗促生的廣譜性；PF01 有利于1年生與2年生植株根的生長(zhǎng)發(fā)育，可增強(qiáng)植株葉片的光合作用；PF02 有利于1年生植株根的生長(zhǎng)發(fā)育，可促進(jìn)2年生植株地上和地下部分的生長(zhǎng)；PF07 有利于2年生植株葉片的生長(zhǎng)。在同一生理階段，與對(duì)照相比，4 個(gè)不同菌株均有較好的促生作用，從一定程度上體現(xiàn)了菌苗共生關(guān)系建立的廣泛性。本結(jié)論與陳寶玲等[5]、朱鑫敏等[7]、周玉杰等[16]、陳金花等[21]和謝玲等[22]的相關(guān)研究結(jié)論一致。對(duì)帶葉兜蘭1年生馴化苗，可優(yōu)先接種PF06、PF01 和PF02 菌株或其中2～3 個(gè)菌株混合接種；對(duì)2年生馴化苗，可優(yōu)先接種PF06、PF07 和PF02 菌株或其中2～3 個(gè)菌株混合接種，在這一階段，進(jìn)行大規(guī)模的菌根化育苗不僅可以有效地建立菌苗共生關(guān)系，而且更適合批量化操作，有非常好的應(yīng)用前景。移栽后兩年內(nèi)的馴化苗均可接種菌根真菌，但在實(shí)際生產(chǎn)中需在馴化苗的不同生長(zhǎng)階段選擇最合適的接種時(shí)期接種最適宜的菌根真菌，以達(dá)到最好的促生效果；PF06（Phialophorasp.）在兩個(gè)生長(zhǎng)階段均表現(xiàn)出較好的促生效果，可作為帶葉兜蘭苗期的通用益生菌制劑，用于帶葉兜蘭的保育和栽培。