陳思婷

(廣西科學(xué)院廣西紅樹林研究中心，廣西紅樹林保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西北海 536000)

0 引言

紅樹林具有重要的生態(tài)及經(jīng)濟(jì)價值，尤其是在固岸護(hù)堤、抵御海嘯臺風(fēng)等自然災(zāi)害、維持生物多樣性、凈化水質(zhì)、固碳及發(fā)展旅游業(yè)等方面具有重要作用。白骨壤(Avicenniamarina)是世界上分布最廣的紅樹植物，在我國主要分布在廣東、廣西、福建、海南和臺灣等省地。白骨壤為我國常見的先鋒紅樹植物樹種，分布廣泛，種子可進(jìn)行有性生殖，根系發(fā)達(dá)，適合生長在貧瘠的裸露沙灘上，因此被稱為紅樹林先鋒樹種。

圍填海對海洋生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生了較大的影響，其對紅樹的影響主要體現(xiàn)在圍墾、養(yǎng)殖污染和淹水脅迫等方面[1]。1980年以來，圍填海造成全國紅樹林面積減少12 923.70 hm2[2]，因此研究圍填海導(dǎo)致紅樹林死亡的具體原因具有重要意義。葉綠素(Chlorophyll，Chl)含量是植物生長過程中一個重要的生理指標(biāo)，由于其對周圍環(huán)境很敏感，且與植物的光合作用密切相關(guān)，被廣泛用作植物生長的常規(guī)測定指標(biāo)。光照和低氧脅迫會影響葉綠素的含量。光照不足影響植物葉綠素的生物合成[3]，所以光照不足是葉綠素含量降低的重要原因之一。低氧脅迫是植物生長過程中遇到的重要非生物脅迫之一[4]。低氧脅迫下，植物處于缺氧狀態(tài)，其生理過程受到干擾，如水分失衡、膜結(jié)構(gòu)被破壞、有害代謝產(chǎn)物積累等。因此，低氧脅迫下植物葉綠素含量降低[5]，植物光合作用效率降低，而由于植物種類及脅迫時間、程度的差異使得葉綠素含量的變化各不相同[6-8]。低氧脅迫使植物營養(yǎng)物質(zhì)利用效率下降、光合作用減弱[9,10]，因此植物在低氧脅迫下呼吸與能量代謝會發(fā)生變化，使得植物在低氧脅迫下能夠存活。圍填海時，白骨壤的低氧脅迫耐受能力與其在被高嶺土覆蓋條件下的能量供應(yīng)狀況有密切的聯(lián)系。如果植物體內(nèi)積累了較多的能量物質(zhì)或在低氧脅迫下養(yǎng)分消耗緩慢，植物就有較強(qiáng)的低氧脅迫耐受能力。而在植物能量產(chǎn)生過程中，細(xì)胞色素C氧化酶(Cytochrome C Oxidase,COX,EC1.9.3.1)和乙醇脫氫酶(Alcohol Dehydrogenase,ADH,EC1.1.1.1)發(fā)揮了重要的作用，是產(chǎn)生ATP的關(guān)鍵酶。由于細(xì)胞色素C氧化酶和乙醇脫氫酶活性易受環(huán)境變化的影響，研究白骨壤中這兩種酶的活性在低氧脅迫下的變化，對從呼吸與能量代謝方面闡明圍填海對白骨壤的影響具有重要作用。圍填海時白骨壤的指狀呼吸根被高嶺土覆蓋，指狀呼吸根缺氧，因此指狀呼吸根是測定細(xì)胞色素C氧化酶和乙醇脫氫酶活性的重要部位。

鐵山港欖根村陸域填土工作始于2012年左右，至2017年12月欖根村紅樹林區(qū)海域吹填工程已基本成型，陸域填土工程范圍亦完全到達(dá)紅樹林海岸邊緣。在海域吹填過程中，鄰近海域吹填工程邊緣紅樹林生境遭受嚴(yán)重威脅。紅樹林從這一時期開始受損，但這一時期紅樹林受損面積較小，暫發(fā)現(xiàn)4個受損紅樹林斑塊零星分布。隨著時間推移，紅樹林受損面積增加明顯，受損區(qū)域呈連片狀分布。2018年10月至2019年6月，海域吹填工程區(qū)東南和東北邊緣有所調(diào)整，陸域填土工程繼續(xù)開展。截至2020年4月，監(jiān)測區(qū)內(nèi)紅樹林受損面積已達(dá)17.18 hm2。圍填海工程導(dǎo)致高嶺土覆蓋在白骨壤的葉片和指狀呼吸根上，因此本文以圍填海不同區(qū)域不同生長狀態(tài)的白骨壤葉片和指狀呼吸根為材料，研究圍填海對白骨壤葉片葉綠素含量、NAD+/NADH比值、NADP+/NADPH比值、ATP含量和指狀呼吸根活力、有氧呼吸關(guān)鍵酶細(xì)胞色素C氧化酶和無氧呼吸關(guān)鍵酶乙醇脫氫酶活性的影響，以探討圍填海對白骨壤呼吸與能量代謝的影響，深入研究圍填海導(dǎo)致白骨壤死亡的生理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣地概況及采樣

鐵山港是我國面積最大的天然白骨壤純林的生長地，并零星生長有桐花樹Aegicerascorniculatum、秋茄Kandeliaobovata和紅海欖Rhizophorastylosa。欖根村現(xiàn)存白骨壤林93.83 hm2，群落平均覆蓋度57%、平均密度55株/100 m2、平均高度2.08 m。鐵山港周邊缺少河流和淡水調(diào)節(jié)，灘涂泥沙質(zhì)、貧瘠，紅樹林生態(tài)系統(tǒng)脆弱。研究區(qū)域經(jīng)緯度為21°35′37.14″-21°36′31.63″N，109°36′56.05″-109°35′54.51″E。以白骨壤為研究對象，采集白骨壤葉片及指狀呼吸根植物材料。分別設(shè)置嚴(yán)重受損紅樹林區(qū)邊緣站位6個(ED1-ED6，以下簡稱ED)，項(xiàng)目監(jiān)測范圍內(nèi)紅樹林大斑塊中暫未顯示枯亡現(xiàn)象仍然正常生長的紅樹林調(diào)查站位3個(尚存活樣方AL1-AL3，以下簡稱AL)，正常紅樹林對照站位3個(對照組CK1-CK3，以下簡稱CK)，研究站位如圖1所示。ED組和AL、CK組的顯著差別在于：ED組出現(xiàn)白骨壤植株全株死亡的現(xiàn)象，紅樹植株死亡比例為(60.5±6.3)%，死亡植株均無葉片殘留(葉片殘留百分比可在一定程度上反應(yīng)植株存活情況)，有一定比例的斷頂株數(shù)；AL、CK組僅出現(xiàn)輕微的葉片掉落情況和少量的斷頂株數(shù)。2020年3月6-7日在欖根村不同組區(qū)域取材：CK組，15個獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)；AL組，15個獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)；ED組，30個獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)，共60個樣品。所有樣品均放置于低溫保溫箱中帶回實(shí)驗(yàn)室，-80℃保存待測。測定前將白骨壤葉片及指狀呼吸根用超純水洗凈、擦干并稱重。葉綠素含量、NAD+/NADH比值、NADP+/NADPH比值和ATP含量用白骨壤的第二對葉測定，根系活力、細(xì)胞色素C氧化酶活性和乙醇脫氫酶活性用白骨壤的指狀呼吸根測定。

圖1 研究站位圖

1.1.2 主要試劑和設(shè)備

輔酶ⅠNAD+/NADH含量試劑盒(批號：G0801W)、輔酶Ⅱ NADP+/NADPH含量試劑盒(批號：G0802W)、ATP含量試劑盒(磷鉬酸比色法，批號：G0815W)、植物根系活力試劑盒(批號：G0124W)、線粒體復(fù)合體Ⅳ細(xì)胞色素C氧化酶試劑盒(批號：G0848W96)、乙醇脫氫酶(ADH)試劑盒(批號：G0806W)均購自蘇州格銳思生物科技有限公司。

主要儀器設(shè)備為多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices；VERSA max)。

1.2 方法

1.2.1 葉綠素含量測定

參照顧駿飛等[11]的方法測定葉綠素含量。

1.2.2 呼吸與能量代謝生理指標(biāo)測定

NAD+/NADH比值用輔酶ⅠNAD+/NADH含量試劑盒測定，NADP+/NADPH比值用輔酶Ⅱ NADP+/NADPH含量試劑盒測定，ATP含量用ATP含量試劑盒(磷鉬酸比色法)測定，指狀呼吸根活力用植物根系活力試劑盒測定，細(xì)胞色素C氧化酶活性用線粒體復(fù)合體Ⅳ細(xì)胞色素C氧化酶試劑盒測定,乙醇脫氫酶活性用乙醇脫氫酶(ADH)試劑盒測定。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計及繪圖使用Excel軟件(Microsoft office 365,Redmond,WA,USA)。圖表中的數(shù)值用平均值±SD的形式表示，顯著性分析使用t檢驗(yàn)，*P<0.05，表示差異顯著，**P<0.01，表示差異極顯著。

**P<0.01，表示差異極顯著

**P<0.01，表示差異極顯著

2 結(jié)果與分析

2.1 圍填海對白骨壤葉片葉綠素含量的影響

從圖2可以看出，與CK組相比，AL組及ED組的白骨壤葉片葉綠素總含量均顯著減少。與CK組相比，ED組的白骨壤葉片葉綠素總含量極顯著減少，下降53%；與AL組相比，ED組的白骨壤葉片葉綠素總含量顯著減少，下降31%。說明海岸工程圍填海導(dǎo)致的高嶺土溢流淤積對白骨壤葉片產(chǎn)生遮光影響，使得葉綠素合成減少，進(jìn)而影響白骨壤的光合作用。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；FW，鮮重

2.2 圍填海對白骨壤葉片NAD+/NADH比值及NADP+/NADPH比值的影響

從圖3可以看出，與CK組相比，AL組及ED組的白骨壤葉片NAD+/NADH比值及NADP+/NADPH比值均顯著降低。與正常生長的白骨壤相比，ED組白骨壤葉片NAD+/NADH比值下降61%，NADP+/NADPH比值下降62%；與AL組相比，ED組的白骨壤葉片NAD+/NADH比值及NADP+/NADPH比值分別下降45%及48%。因此，海岸工程圍填海導(dǎo)致的高嶺土溢流淤積堵塞了白骨壤葉片和指狀呼吸根的氣孔，使得白骨壤可以獲取的氧氣量減少，從而減少NAD+及NADP+的合成，進(jìn)而使NAD+/NADH比值及NADP+/NADPH比值下降。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.3 圍填海對白骨壤葉片ATP含量的影響

如圖4所示，與CK組相比，AL組的白骨壤葉片ATP含量顯著減少。與正常生長的白骨壤相比，ED組的白骨壤葉片ATP含量下降95%，說明海岸工程圍填海導(dǎo)致的高嶺土溢流淤積堵塞白骨壤葉片和指狀呼吸根的氣孔，使得白骨壤可以獲取的氧氣量減少，從而減少ATP的合成，進(jìn)而導(dǎo)致ATP含量下降。

2.4 圍填海對白骨壤指狀呼吸根活力的影響

與CK組相比，AL組及ED組的白骨壤指狀呼吸根的活力顯著下降；與正常生長的白骨壤相比，ED組的白骨壤指狀呼吸根活力下降62%；與AL組相比，ED組的白骨壤指狀呼吸根的活力顯著下降(圖5)。說明海岸工程圍填海導(dǎo)致的高嶺土溢流淤積堵塞白骨壤指狀呼吸根的氣孔，使得白骨壤可以獲取的氧氣量減少，產(chǎn)生低氧脅迫，進(jìn)而抑制白骨壤根系活力。

2.5 圍填海對白骨壤指狀呼吸根細(xì)胞色素C氧化酶和乙醇脫氫酶活性的影響

從圖6可以看出，與CK組相比，ED組的指狀呼吸根細(xì)胞色素C氧化酶和乙醇脫氫酶活性明顯升高，指狀呼吸根細(xì)胞色素C氧化酶活性升高108%，乙醇脫氫酶活性升高20%，說明與CK組相比，ED組的有氧呼吸活性和無氧呼吸活性均升高。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

3 討論

3.1 圍填海對白骨壤葉片葉綠素含量的影響

光照不足會影響植物葉綠素的生物合成[3]，黑暗中大部分植物無法合成葉綠素[12]，而葉片長期遮光會導(dǎo)致葉綠素含量顯著下降[13]。長期遮光降低植物光合碳同化能力及光合作用關(guān)鍵酶活性，導(dǎo)致葉綠素合成減少，葉片褪綠。葉綠素酸酯a加氧酶(CAO)將葉綠素酸酯a (Chlide a)轉(zhuǎn)化為葉綠素酸酯b (Chlide b)。擬南芥CAO在黑暗下表達(dá)量很低，但在光照條件下表達(dá)量顯著上調(diào)[14]。水稻OsCAO1在黑暗和光照條件下的表達(dá)模式與擬南芥CAO相似。葉綠素合酶(CHLG)將Chlide a和Chlide b轉(zhuǎn)化為葉綠素a和葉綠素b。擬南芥CHLG在見光后表達(dá)量逐漸上調(diào)。長期遮光不利于植物轉(zhuǎn)綠，光通過調(diào)控葉綠素生物合成途徑中的關(guān)鍵基因影響葉綠素生物合成。氧氣充足時植物葉綠素含量維持在一個較高的水平，低氧脅迫時葉綠素含量下降[15]。圍填海導(dǎo)致白骨壤葉片氣孔被高嶺土堵塞，光照被高嶺土阻斷，葉綠素生物合成減少，葉綠素含量下降。

3.2 圍填海對白骨壤呼吸與能量代謝的影響

低氧脅迫往往造成糖酵解及三羧酸循環(huán)的代謝過程變緩甚至停滯，導(dǎo)致還原型輔酶Ⅰ(NADH)向氧化型輔酶Ⅰ(NAD+)的再生過程受到抑制進(jìn)而阻止ATP的產(chǎn)生[16]。植物細(xì)胞在低氧脅迫條件下，正常有氧呼吸產(chǎn)生ATP的途徑受阻，轉(zhuǎn)而通過乙醇發(fā)酵和乳酸發(fā)酵途徑產(chǎn)生少量的ATP。圍填海導(dǎo)致嚴(yán)重受損區(qū)的白骨壤葉片ATP含量下降95%(圖4)，其原因是ATP合成減少。

在逆境條件下，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)會被破壞，最終將導(dǎo)致細(xì)胞相關(guān)生理功能的降低乃至喪失[17]。對黃瓜的研究結(jié)果表明，低氧脅迫下根尖細(xì)胞受到傷害，線粒體內(nèi)嵴減少[18]。本研究結(jié)果表明，受損白骨壤指狀呼吸根活性下降(圖5)，可能是隨著細(xì)胞器結(jié)構(gòu)的逐漸降解，化學(xué)反應(yīng)效率不可避免地下降，使得同化力減弱，并最終導(dǎo)致根活力下降，究其原因正是由于線粒體抗氧化系統(tǒng)的異常所導(dǎo)致。

當(dāng)白骨壤指狀呼吸根剛被高嶺土覆蓋時，白骨壤指狀呼吸根還可以利用胞間氧進(jìn)行氧化磷酸化。隨著胞間氧的消耗，氧分壓下降，植物表現(xiàn)出通過上調(diào)細(xì)胞色素C氧化酶的活性來有效地利用不斷減少的氧氣進(jìn)行有氧呼吸。氧作為電子傳遞鏈的最終電子受體，低氧脅迫直接影響以氧為底物的細(xì)胞色素C氧化酶。白骨壤指狀呼吸根被高嶺土覆蓋，使得植物氧化磷酸化過程受到很大的影響，通過氧化磷酸化產(chǎn)生的ATP有限，必須通過無氧呼吸生成ATP，為維持能量供應(yīng)，就需要提高指狀呼吸根乙醇脫氫酶活性。

4 結(jié)論

高嶺土溢流淤積，使其附著于白骨壤葉片和指狀呼吸根上，白骨壤葉片被遮光，葉片和指狀呼吸根的氣孔被堵塞。葉片被遮光導(dǎo)致葉綠素含量下降，葉片和指狀呼吸根的氣孔被堵塞導(dǎo)致白骨壤遭受低氧脅迫，因此葉片NAD+/NADH比值及NADP+/NADPH比值下降，葉片ATP含量下降，指狀呼吸根活性下降，細(xì)胞色素C氧化酶和乙醇脫氫酶活性上升。