黃 偉，宋 博，張麗娟，王 博，王 瑋

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物實驗室，烏魯木齊 830091，2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所/農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物防治綜合治理重點實驗室/農(nóng)業(yè)部庫爾勒作物有害生物科學(xué)觀測試驗站，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】青枯病是由茄科勞爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的一種土傳性細菌病害。利用拮抗菌防治青枯病的發(fā)生是一種環(huán)保而有效方法。目前青枯病拮抗菌的來源大都是農(nóng)田土壤，拮抗菌的拮抗效果不穩(wěn)定，且難以應(yīng)對近年來青枯菌產(chǎn)生的較強耐藥性。尋找新的拮抗菌資源，開發(fā)新的活性物質(zhì)對青枯病生物防治有實際意義?！厩叭搜芯窟M展】目前用于防治青枯病的生防細菌主要有無致病力青枯菌、芽孢桿菌、假單胞菌、鏈霉菌等。其中芽孢桿菌(Bacillussp.)具有環(huán)境友好、抗逆性強、定植能力強、繁殖力強、產(chǎn)物豐富、性質(zhì)穩(wěn)定的特點，是目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最多的生防細菌之一。Li等[1]研究了在溫室條件下，使用拮抗菌株芽孢桿菌SQRT3(從番茄根際土壤中分離)浸根處理后，對番茄青枯病的生防效率提升至84.1%。鄭雪芳等[2]報道菌株FJAT-20261和FJAT-19700分別鑒定為耐寒短桿芽孢桿菌和特基拉芽孢桿菌。在盆栽試驗中，二者對番茄青枯病防效達到72.73%和67.77%?！颈狙芯壳腥朦c】芽孢桿菌是關(guān)注度最高、商業(yè)化最成功的生防因子，作為一類廣譜抗菌、能誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性、環(huán)境安全性高、兼具促生作用的生防菌具有非常大的市場應(yīng)用價值。芽孢桿菌Bacillussp. JK19是從耐輻射微生物資源庫篩選得到的，對番茄青枯病病原菌具有較強拮抗作用。研究拮抗細菌JK19的分類學(xué)地位，檢測其抑菌活性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】JK19廣譜抑菌活性，采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)及生理生化特征相結(jié)合的方法，鑒定菌株，運用PCR方法檢測其可能的生防活性成分脂肽類化合物合成基因，為以該菌為基礎(chǔ)的生防制劑的研究和開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試菌株：拮抗細菌Bacillussp. JK19由耐輻射微生物資源庫保存；番茄青枯病菌購自廣東省微生物保藏中心；香梨黑斑病菌由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保所分離保存；核桃腐爛病菌、馬鈴薯早疫病菌、西瓜枯萎病菌、西瓜蔓枯病菌、水稻惡苗病菌、棉花枯萎病菌由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)李健強教授贈予。表1

表1 植物病原菌Table1 Plant pathogens used for tests

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(Nutrient Agar，NA)、TTC(Triphey tetrazolium chloride)固體培養(yǎng)基[3](培養(yǎng)基成分為水解乳蛋白1 g，蛋白胨10 g，葡萄糖5 g，瓊脂17 g，pH 6.5～7.0，定容至1 L；使用前冷卻至55℃，加入過濾除菌的1%的2，3，5-氯化三苯四氮唑，終濃度為0.005%)、CPG液體培養(yǎng)基(培養(yǎng)基成分為水解乳蛋白1 g，蛋白胨10 g，葡萄糖5 g，pH 6.5～7.0，定容至1 L)、R2A瓊脂培養(yǎng)基。

供試試劑：GEN III微孔板、 API試劑條及相關(guān)試劑。

供試儀器：氣浴振蕩培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋。

1.2 方 法

1.2.1 番茄青枯病拮抗細菌的篩選

采用平板對峙法。以番茄青枯病病原菌為指示菌，接種于CPG液體培養(yǎng)基，30℃ 120 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，作為指示菌種子液。將指示菌種子液與TTC固體培養(yǎng)基按1∶10比例混合均勻后倒入培養(yǎng)皿。

從耐輻射資源庫中將細菌接種于NA固體平板，37℃培養(yǎng)24 h進行活化后，挑取單菌落接種NA液體培養(yǎng)基，37℃ 120 r/min振蕩培養(yǎng)24 h作為種子液，取1 mL種子液10 000×g離心1 min，上清液待用。

用打孔器(6 mm)將含指示菌的平板打3個孔，將上清液加入孔內(nèi)，每孔100 μL，對照為等量的無菌水，37℃靜置培養(yǎng)24 h。測量抑菌圈直徑。

1.2.2 拮抗細菌的鑒定

菌株JK19的菌體形態(tài)特征參照《伯杰氏細菌系統(tǒng)分類手冊》進行。菌株的生理生化特性采用API試劑條及Biolog GEN III微孔板測定。

用無菌棉簽細菌蘸取NA固體平板上培養(yǎng)24 h的菌落參照API 20NE、API 50CH、API ZYM試劑條使用說明制備菌懸液，接種、培養(yǎng)、檢測并記錄結(jié)果。

將細菌純培養(yǎng)物接種于R2A瓊脂平板，33℃培養(yǎng)24 h。無菌棉簽蘸取單菌落，棉簽深入含接種液的接種管，上下晃動均勻釋放菌體，制備均一菌懸液。將菌懸液倒入V型加樣槽，用八道移液器按每孔100 μL的量加入Biolog GEN III微孔板。微孔板在33℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每隔12 h，用BIOLOG檢定系統(tǒng)讀板。

菌株的16S rRNA基因鑒定選擇通用引物27F和1492R進行擴增測序， PCR擴增均采用25 μL擴增體系，擴增程序：94℃ 4 min；94℃ 30s，65℃ 40s，72℃ 90s，30 cycles；72℃ 10 min 。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目標條帶經(jīng)切膠回收后送公司測序。測序結(jié)果通過MEGA7.0軟件采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值設(shè)為1 000。

1.2.3 抑菌活性測定

將凍存的菌株JK19接種于NA平板，37℃培養(yǎng)24 h進行活化后，挑取單菌落接種NA液體培養(yǎng)基，37℃ 120 r/min振蕩培養(yǎng)24 h作為種子液，取1 mL種子液10 000×g離心1 min，上清液待用。

對植物病原真菌的抑菌活性測定：采用平板對峙法，將病原真菌接種于PDA瓊脂平板中間，將拮抗細菌接種于四周。同時接種只含有病原真菌的PDA瓊脂平板作為對照。

菌絲生長抑制率=(對照菌落直徑-對峙板菌落直徑)/對照菌落直徑×100%。

1.2.4 菌株JK19脂肽類合成及促生相關(guān)基因PCR檢測

采用細菌基因組提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取JK19菌株的基因組DNA。采用25 μL PCR體系擴增脂肽類化合物合成及促生作用相關(guān)的基因。表2

表2 基因擴增用到的引物Table 2 Primers for PCR amplification

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄青枯病拮抗菌的篩選

經(jīng)過篩選平板對峙實驗初篩和復(fù)篩后，對番茄青病菌有較好拮抗作用的菌有4株，分別為JK2、JK5、JK19、JK20，JK19的抑菌效果顯著優(yōu)于JK2、JK5和JK20，選擇JK19進行下一步試驗。圖1，表3

表3 耐輻射細菌對番茄青枯病菌的復(fù)篩拮抗效果結(jié)果Table 3 Antagonistic effect of radiation resistant bacteria on tomato bacterial wilt

2.2 菌株JK19的分類鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)特征和生理生化特征

研究表明，JK19菌株在NA平板上30℃培養(yǎng)24 h后，形成直徑3～6 mm菌落，呈不規(guī)則圓形，近白色不透明，干燥，表面褶皺，邊緣鋸齒狀。在R2A平板上，30℃培養(yǎng)24 h后，形成直徑2～5 mm菌落，菌落白色不透明，邊緣不規(guī)則圓形。經(jīng)革蘭氏染色觀察，菌株染色革蘭氏陽性，菌體形態(tài)呈短桿狀，菌體大小0.5 ～0.8(μm)×1.5～2.0(μm)，芽孢位于菌體中心或偏中心，大小約為0.5～0.8(μm)×1.0～1.5(μm)。圖2

研究表明，JK19與解淀粉芽孢桿菌同源性最近，SIM值為0.521。JK19可以利用糊精、D-麥芽糖、D-海藻糖、D-纖維二糖、龍膽二糖、蔗糖、D-松二糖、水蘇糖、棉子糖、α-D-乳糖、蜜二糖、β-甲酰-D-葡糖苷、D-水楊苷、N-乙酰-D-葡糖胺、N-乙酰-β-D-甘露糖胺、α-D-葡糖、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、3-甲酰葡糖、D-果糖、肌苷、D-山梨醇、D-甘露醇、D-阿拉伯醇、肌醇、甘油、D-果糖-6-磷酸、D-天冬氨酸、明膠、氨基乙酰-L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-組胺、L-焦谷氨酸、L-絲氨酸、果膠、D-半乳糖醛酸、L-半乳糖醛酸內(nèi)酯、D-葡糖酸、D-葡糖醛酸、奎寧酸、丙酮酸甲酯、D-乳酸甲酯、L-乳酸、檸檬酸、L-蘋果酸、溴-丁二酸、吐溫40、β-羥基-D,L丁酸、乙酰乙酸、乙酸、甲酸54種碳源。耐受pH 5、8%NaCl，對梭鏈孢酸、D-絲氨酸、醋竹桃霉素、利福霉素SV、二甲胺四環(huán)素、林肯霉素、硫酸四癸鈉、萬古霉素、四唑紫、四唑藍、萘啶酮酸、氨曲南、溴酸鈉敏感。

JK19除BIOLOG結(jié)果外還可以利用L-阿拉伯糖、D-核糖、山梨醇甲基-αD-吡喃葡萄糖甙、苦杏仁苷、ARBULIN、七葉靈檸檬酸鐵、水楊苷、淀粉、糖原。能使明膠液化，不產(chǎn)H2S，硝酸鹽還原、檸檬酸鹽、酪素水解、葡萄糖氧化、接觸酶、V-P反應(yīng)呈陽性，吲哚實驗、脲酶反應(yīng)呈陰性。表4

表4 JK19菌株的生理生化特征Table 4 Physiological and biochemical characteristics of strain JK19

綜合菌株JK19的形態(tài)特征和生理生化特征，參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》，確定菌株JK19屬于芽孢桿菌屬。

2.2.2 分子鑒定

菌株JK19的16S rDNA序列1 429 bp，序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為MN841899。在數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，與BacillusvelezensisCR-502 16S rDNA序列相似性最大達99.71% 。選取同源性較高的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株與BacillussiamensisKCTC 13613親緣關(guān)系最近，序列相似性為99.51%，與BacillusamyloliquefaciensDSM7的16S rDNA序列序列相似性為99.30%。圖3

2.3 拮抗菌株JK19的抑菌譜測定

研究表明，菌株JK19對各植物病原菌的抑制率分別為：香梨黑斑病(66.67%)、核桃腐爛病(100%)、馬鈴薯早疫病(73.33%)、西瓜枯萎病(60.71%)、水稻惡苗病(67.86%)、棉花枯萎病(76.92%)、西瓜蔓枯病(100%)，幾乎完全抑制核桃腐爛病、西瓜蔓枯病病原菌的生長。重復(fù)試驗及數(shù)次傳代后仍能得到穩(wěn)定的抑菌結(jié)果，菌株JK19具有穩(wěn)定、高效、廣譜的抑菌效果。圖4

與正常生長的菌絲相比，處理組PDA培養(yǎng)基內(nèi)抑菌圈周圍的菌絲生長緩慢，抑菌圈邊界明顯，顯微鏡下可見基內(nèi)菌絲頂端膨大、彎曲、畸形，原生質(zhì)凝聚，菌絲生長受到明顯抑制。圖5

2.4 菌株JK19 脂肽類化合物相關(guān)基因與促生相關(guān)基因檢測

研究表明，經(jīng)過PCR擴增，檢測到參與脂肽類抗生素合成的基因ituA、ituD、bamC、fenB、fenD、srfAB；參與生長素IAA合成的基因ysnE，具有促生作用的基因yndJ。表5

表5 PCR產(chǎn)物序列比對Table 5 Alignment results of PCR product

3 討 論

3.1 菌株JK19的鑒定

經(jīng)過形態(tài)學(xué)、生理生化特征的分析，確定JK19菌株屬于芽孢桿菌屬，與解淀粉芽孢桿菌較為相似。在分子水平上與暹羅芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌相似性都大于99%。依據(jù)現(xiàn)有信息，尚無法將JK19鑒定到具體的種。同時參照其它脂肽類合成基因的序列比對結(jié)果，與多株已發(fā)表的貝萊斯芽孢桿菌菌株基因組中的相關(guān)基因同源性最高，JK19可能是一株貝萊斯芽孢桿菌，然而想要將菌株JK19精確鑒定到種，需要進一步做包括基因組測序、數(shù)字DNA雜交在內(nèi)的生物信息學(xué)分析。

2005年研究者發(fā)現(xiàn)報道貝萊斯芽孢桿菌BacillusvelezensisCR-502，16S rDNA與枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌相似度高于98%，但是菌株DNA-DNA雜交率均低于20%(細菌新種鑒定金標DNA-DNA相關(guān)性≤70%。)[9]。此后貝萊斯芽孢桿菌一度被認為是解淀粉芽孢桿菌的同物異名[12]。2016年Dunlap等[13]通過比較基因組學(xué)和數(shù)字DNA雜交方法重新討論貝萊斯芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌植物亞種、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌的分類學(xué)地位，指出貝萊斯芽孢桿菌不是解淀粉芽孢桿菌的同物異名，同時甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌植物亞種是貝萊斯芽孢桿菌的同物異名，統(tǒng)稱貝萊斯芽孢桿菌，此后貝萊斯芽孢桿菌作為獨立的分類單元及其有效的物種名稱存在。2017年FAN等[14]就B.amyloliquefaciens、B.velezensis、B.siamensis提出了一個全新的概念“operational groupB.amyloliquefaciens”，他們首先對芽孢桿菌屬中的23株代表性模式菌株的核心基因組進行系統(tǒng)發(fā)育分析，從中確定了4個與B.amyloliquefaciensDSM 7T高度相似并具有有效命名的菌種，分別是B.siamensis、B.velezensis、B.methylotrophicus、B.amyloliquefacienssubsp.plantarum；其次在NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取這4個菌種和B.amyloliquefaciens系列內(nèi)的66株細菌的全基因組序列進行比較基因組分析，進一步證實了Dunlap等[13]的結(jié)論，建議將“operational group ‘B.amyloliquefaciens’”作為枯草芽孢桿菌群(Bacillussubtilisgroup)分類等級下的一個新分類單元，其中包括B.amyloliquefaciens、B.siamensis、B.velezensis[14]。目前僅通過表型和16S rDNA序列尚不足以鑒定這幾種近源菌群。

3.2 菌株JK19的抑菌活性

無論是解淀粉芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌還是枯草芽孢桿菌，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中都有著廣泛的開發(fā)應(yīng)用，以芽孢桿菌活體及其產(chǎn)物為基礎(chǔ)開發(fā)的生防制劑被用以防治多種農(nóng)作物病蟲害[15-18]。研究的JK19菌株對多種植物病原菌均有較好的抑制作用，對核桃腐爛病、西瓜蔓枯病病原菌幾乎完全抑制，具有穩(wěn)定、高效、廣譜的抑菌效果。

已報道的芽孢桿菌抗菌產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)主要包括抗菌蛋白、脂肽類抗生素、由非核糖體多肽合成酶(NRPS)和聚酮化合物(PKS)合成的抗生素，部分菌株具有ACC脫氨酶活性，能夠分泌IAA，促進植物生長。其中脂肽類抗生素是芽孢桿菌源主要開發(fā)的抗菌物質(zhì)之一，該類化合物主要包括：表面活性素、伊枯草素、豐原素[19]。豐原素對絲狀真菌具有較強拮抗作用，對細菌和酵母無作用[20,21]；伊枯草菌素具有較強的抗真菌和溶血活性，有部分抑制細菌的活性；表面活性素有抗病毒、抗細菌活性，沒有明顯的抑真菌活性，但是表面活性素與豐原素或伊枯草菌素共同使用可以顯著提高抑真菌效果[22,23]。脂肽類物質(zhì)除抗菌活性外，還能促進芽孢桿菌在根部定植，誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性，顯示出極大的生防潛力。

Liu等[24]研究發(fā)現(xiàn)B.velezensisH3的抗真菌物質(zhì)主要是C14-Surfactin和C15-Surfactin。金清等[25]發(fā)現(xiàn)B.velezensisS3-1具有廣譜抑菌效果，產(chǎn)生6種表面活性素、3種伊枯草菌素、4種豐原素，并對其基因組中脂肽抗生素合成基因簇進行了定位。朱弘元等[26]發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌B15抑制葡萄灰霉病菌的主要活性物質(zhì)是伊枯草菌素A和豐原素。研究在JK19菌株中檢測到3類脂肽類抗生素合成相關(guān)的基因，其中ituA、ituD、bamC參與合成伊枯草菌素，fenB、fenD參與合成豐原素，srfAB參與合成表面活性素。結(jié)果表明，該菌可能可能通過脂肽類抗生素發(fā)揮抑菌作用，同時還發(fā)現(xiàn)該菌基因組中有IAA合成和促生作用相關(guān)的基因，菌株在具備抑制植物病原菌作用的同時可能具有促生作用，具有較高的開發(fā)應(yīng)用潛力，但有關(guān)該菌的抑菌作用機理、代謝產(chǎn)物及環(huán)境安全評價等方面的研究還需要進一步完善。

4 結(jié) 論

篩選得到的生防拮抗菌JK19，經(jīng)鑒定為芽孢桿菌屬，該菌對番茄青枯病病原菌等多種植物病原菌均具有明顯的抑制作用。參與脂肽類抗生素合成的基因ituA、ituD、bamC、fenB、fenD、srfAB；參與生長素IAA合成的基因ysnE，具有促生作用的基因yndJ均被檢測到。