鄒志萱，曾亞丹，韋清慧，包夢(mèng)瑩，黃媛媛，王亞麗，張興藝，王小鶯

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)/江西農(nóng)業(yè)大學(xué)獸藥研究所，江西 南昌 330045）

鳳尾草是鳳尾蕨科鳳尾蕨屬植物，主要以其葉形和生態(tài)環(huán)境來(lái)命名，如金雞尾、雞腳草、井欄邊草等，喜生長(zhǎng)在蔭蔽、濕潤(rùn)、溫暖處，也耐旱。在南方冬季，石縫中生長(zhǎng)的植株經(jīng)歷一二月份的干旱，不致完全枯死。以全草入藥，性涼，味微苦，歸肝、腎、大腸經(jīng)，具有清熱利濕、涼血止血、消腫解毒等功效，用于治療痢疾、腸炎、黃疸型肝炎、吐血、便血、尿血等病癥[1]。

雖然大多數(shù)不同產(chǎn)地的鳳尾草的成分類別可能相同，但是化合物含量不同，所以不同產(chǎn)地鳳尾草的質(zhì)量不同，臨床療效也有差異。為提高鳳尾草的質(zhì)量控制水平，建立和完善相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本項(xiàng)目通過(guò)研究不同來(lái)源的鳳尾草藥材的薄層色譜法和抑菌圈試驗(yàn)，初步建立一種能夠快速鑒定優(yōu)質(zhì)鳳尾草的薄層色譜指紋圖譜，也可為日后合理開(kāi)發(fā)該資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 供試藥材

人工種植鳳尾草為南昌市經(jīng)開(kāi)區(qū)昌盛大藥房購(gòu)買；野生鳳尾草分別于11月、12月采自江西省南昌市梅嶺風(fēng)景區(qū)。

1.2 菌種

腸桿菌菌株為江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 主要試劑

三氯甲烷、石油醚、正己烷、乙酸乙酯、甲酸、乙酸乙酯、甲醇、無(wú)水乙醇、硫酸溶液，所有均為市售一般化學(xué)純?cè)噭?gòu)買于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。改良碘化鉍鉀、香草醛、磷鉬酸、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基瓊脂粉末、薄層硅膠板，由青島海洋化工有限公司生產(chǎn)。

1.4 主要儀器

中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司生產(chǎn)），立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠生產(chǎn)），恒溫培養(yǎng)搖床（上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)），雙人單面凈化工作臺(tái)(SW-CJ-2D，蘇州凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn)），生化培養(yǎng)箱(韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn))；電子天平(ESJ220-4G，沈陽(yáng)龍騰電子有限公司生產(chǎn))，恒溫培養(yǎng)搖床(SKY-1102C，上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn))。

2 方法

2.1 鳳尾草乙醇提取物的制備

取供試材料，去雜清洗干凈，干燥粉碎。稱取鳳尾草粉末10 g，與乙醇溶液1∶5的料液比，浸泡30分鐘后，于50℃溫度加熱回流提取1小時(shí)，放冷、過(guò)濾、濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶散，用20 mL乙酸乙酯振搖提取，水浴蒸干，殘?jiān)訜o(wú)水乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液，置冰箱4℃冷藏保存[2]。

2.2 鳳尾草薄層色譜法建立

2.2.1展開(kāi)劑的篩選

為了得到理想的分離效果，試驗(yàn)中選擇乙酸乙酯-甲酸-水（13∶3∶1），乙酸乙酯-乙醇-水（5∶5∶2），三氯甲烷-乙醇-水（13∶6∶2）等展開(kāi)系統(tǒng)。

取薄層色譜硅膠G干燥后備用，用微量定樣點(diǎn)樣器點(diǎn)樣于薄層板上，將薄層板放入展開(kāi)劑飽和后的層析缸中，密封室蓋，展開(kāi)完畢后，取出薄層板，晾干，后置紫外光燈（365 nm）下檢視。

2.2.2顯色劑的篩選

取出薄層板后晾干，除一片放置于紫外儀365 nm下直接顯色外，其他分別噴以改良碘化鉍鉀溶液、5%香草醛硫酸溶液、10%磷鉬酸乙醇溶液，于干燥箱中110℃干燥5分鐘后取出，觀察斑點(diǎn)顯色情況。

2.3 抗菌活性測(cè)定

2.3.1菌液的制備

取-80℃冷凍保存的大腸桿菌凍存管，將其吸入LB液

體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，放置于37℃搖床6小時(shí)進(jìn)行快速?gòu)?fù)蘇，紫外分光光度計(jì)測(cè)定細(xì)菌數(shù)量，備用。

2.3.2體外抑菌實(shí)驗(yàn)

吸取已復(fù)壯好的菌液100 μL于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基[4]上，用三角涂布棒涂開(kāi)，瓊脂打孔法打孔，吸取30 μL培養(yǎng)基封底，防止藥液從底部漏出，往平板中分別加入三種不同來(lái)源的鳳尾草藥液，并加入溶劑乙醇作為對(duì)照，置于37℃恒溫培養(yǎng)12小時(shí)，觀察測(cè)量抑菌圈。

3 結(jié)果與分析

3.1 鳳尾草薄層色譜法建立

經(jīng)過(guò)對(duì)不同展開(kāi)系統(tǒng)薄層色譜分離效果的比較，結(jié)果表明采用展開(kāi)劑為正己烷∶乙酸乙酯∶甲酸=5∶1∶1，以磷鉬酸乙醇溶液為顯色劑時(shí)，斑點(diǎn)清晰，分離效果最好，而通過(guò)365 nm紫外儀觀察最為簡(jiǎn)便直觀（圖1）。

圖1 鳳尾草的TLC

3.2 不同來(lái)源鳳尾草乙醇提取物對(duì)大腸桿菌的體外抑菌效果

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，11月、12月的野生鳳尾草平均抑菌圈直徑分別為29 mm、21 mm，但人工種植鳳尾草乙醇提取物產(chǎn)生的抑菌圈較小，為16 mm。而對(duì)照溶劑沒(méi)有抑菌圈（表2）。

表2 不同來(lái)源鳳尾草提取液對(duì)大腸桿菌的抑菌效果

根據(jù)所得到的圖1、表1、表2結(jié)合分析可知，處在同一位置的斑點(diǎn)，表明對(duì)應(yīng)條帶的遷移速率在相同實(shí)驗(yàn)條件下可以判斷其為同一個(gè)物質(zhì)。與人工種植鳳尾草斑點(diǎn)相比較，采摘的野生鳳尾草提取物的斑點(diǎn)有顯著不同，野生鳳尾草在斑點(diǎn)1、斑點(diǎn)2、斑點(diǎn)3明顯高于人工采摘鳳尾草，而野生鳳尾草其他部位的斑點(diǎn)比人工種植鳳尾草相應(yīng)部位的斑點(diǎn)弱，由此可推測(cè)鳳尾草抗菌活性部位為斑點(diǎn)1、斑點(diǎn)2、斑點(diǎn)3，Rf值分別為0.338、0.394、0.451。

表1 鳳尾草主要抗菌物質(zhì)的Rf值

4 討論

從實(shí)驗(yàn)中所得：5%香草醛硫酸溶液在高溫情況下能夠使展開(kāi)成分顯淺綠色，10%磷鉬酸乙醇溶液能夠使展開(kāi)成分顯藍(lán)色，改良碘化鉍鉀能夠使展開(kāi)成分顯橘紅色，對(duì)比各類鳳尾草展開(kāi)后的條帶情況以及不同鳳尾草醇提液的抑菌效果后，推測(cè)鳳尾草中起主要抗菌作用的成分是圖1中的斑點(diǎn)1、斑點(diǎn)2、斑點(diǎn)3，根據(jù)所選的顯色劑及文獻(xiàn)分析推薦為萜類成分[4]。

鳳尾草資源豐富，用途廣泛，使用歷史悠久。但由于鳳尾草成分復(fù)雜，因而其分離、鑒定難度極大。因此，開(kāi)始鳳尾草藥材的研究時(shí)，應(yīng)對(duì)中藥的提取條件、方法、有效組分分離等作充分考慮，設(shè)置對(duì)照組和重復(fù)組，以保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和真實(shí)性。對(duì)于日漸增大的市場(chǎng)需求量，現(xiàn)如今鳳尾草的開(kāi)發(fā)與利用將是大勢(shì)所趨，所以建立快速篩查優(yōu)質(zhì)鳳尾草的方法具有重要意義。