郭嘉鵬，羅微，章慧，劉梁，趙玲，劉華英，陳新*

（1.武漢輕工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北武漢 430023；2.湖北來鳳騰升香料化工公司，湖北恩施 445000）

來鳳鳳菊（Dendranthema indicumvar.aromaticum）為菊科菊屬植物，民間常用于感冒、咽喉腫痛和目赤腫痛等疾病的治療。其花、莖、葉中化學(xué)成分豐富，多為揮發(fā)油、黃酮、萜等脂溶性成分，抗氧化、抗菌、抗炎等藥理活性顯著。近年來，眾多學(xué)者對來鳳鳳菊的揮發(fā)油、黃酮類等成分進(jìn)行了相關(guān)研究[1]。

現(xiàn)代藥理研究表明，植物多糖毒副作用小、無耐藥性，具有多種生物活性，主要包括促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗炎及抗衰老等[2]，但目前有關(guān)來鳳鳳菊莖葉多糖的研究報道還甚少。

植物多糖色素往往影響其結(jié)構(gòu)和生物活性的研究，也不利于進(jìn)一步的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，有關(guān)植物多糖脫色純化方法的研究已有不少報道[3-6]。植物多糖的脫色純化方法主要有活性炭法[7]、雙氧水法[8]、樹脂吸附法[9-10]、離子交換法[11]等。目前，植物多糖的脫色和純化研究主要集中在藥用真菌方面，而關(guān)于來鳳鳳菊莖葉多糖脫色和純化的研究還鮮見報道。本文利用不同色譜材料對來鳳鳳菊莖葉多糖進(jìn)行脫色和純化研究，以便為來鳳鳳菊莖葉多糖的應(yīng)用基礎(chǔ)研究和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

來鳳鳳菊，產(chǎn)自湖北省恩施州來鳳縣。

1.1.2 儀器及試劑

AUWl20D分析天平，日本島津；PerkinElmer Lambda 950紫外可見分光光度計，PERKINELMER公司；HPD-100、D101、AB-8、HPD-400、ADS-7、DM130樹脂，山東優(yōu)索化工科技有限公司；Buchi R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士Buchi公司；DEAE-52纖維素，上海源葉生物；化學(xué)試劑均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 來鳳鳳菊莖葉多糖制備

將粉碎的來鳳鳳菊莖葉，以料液比1∶40（g∶mL）的比例加入蒸餾水，超聲提取60 min，加入無水乙醇沉淀多糖，最終醇沉濃度為70%，置入冰箱過夜，抽濾后以無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌脫水，30 ℃真空干燥，得到來鳳鳳菊莖葉粗多糖。

1.2.2 來鳳鳳菊莖葉多糖脫色評價指標(biāo)

取來鳳鳳菊莖葉粗多糖，加蒸餾水溶解配制成1 mg/mL的來鳳鳳菊莖葉多糖溶液，分別通過樹脂和纖維素等填料進(jìn)行柱層析，于450 nm處測吸光度計算脫色率，苯酚-硫酸法于490 nm處檢測并計算多糖含量。

脫色率按照式（1）計算：

式（1）中：OD1為脫色前吸光度，OD2為脫色后吸光度。

多糖保留率按照式（2）計算：

式（2）中：M前為脫色前多糖總量，M后為脫色后的多糖總量。

1.2.3 樹脂材料篩選

HPD-100、HPD-400、D101、DM130、AB-8、ADS-7、DEAE-52纖維素7種材料分別稱取1.0 g，置于具塞錐形瓶中，分別加入1.0 mg/mL的來鳳鳳菊莖葉多糖樣品溶液15 mL，恒溫33 ℃，180 r/min振蕩，吸附18 h。離心，取上清液，分別計算脫色率和多糖保留率，確定最佳脫色樹脂材料。

1.2.4 DEAE-52纖維素層析純化效果研究

（1）DEAE-52離子交換柱的處理。①DEAE-52（Cl-）纖維素：蒸餾水浸泡溶脹，加水除去懸浮顆粒；0.5 mol/L的NaOH浸泡1 h，水洗，再以0.5 mol/L的HCl浸泡1 h，水洗，使DEAE-纖維素轉(zhuǎn)換為Cl-型，再用蒸餾水進(jìn)行裝柱。②DEAE-52（OH-）纖維素：按①項操作至0.5 mol/L的NaOH浸泡1 h，使DEAE-纖維素轉(zhuǎn)換為OH-型，水洗，再用蒸餾水進(jìn)行裝柱。③DEAE-52（HCO3-）纖維素：按①項操作，最后以0.5 mol/L的NaHCO3浸泡1 h，使DEAE-纖維素轉(zhuǎn)換為HCO3-型，水洗，再用蒸餾水進(jìn)行裝柱。

（2）DEAE-52離子交換柱分離層析。取來鳳鳳菊莖葉粗多糖溶解，配制成粗多糖水溶液，用不同離子型DEAE-52纖維素柱層析分離，用蒸餾水和NaCl溶液（0.05 mol/L、0.20 mol/L、0.50 mol/L）梯度洗脫。分別在280 nm、450 nm和490 nm跟蹤檢測洗脫液中多糖、色素和蛋白含量，繪制曲線，確定最佳分離方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹脂材料選擇

來鳳鳳菊莖葉多糖色素含量較高，會影響多糖在后期使用中的效果。圖1表明，7種樹脂對來鳳鳳菊莖葉多糖色素的吸附率有較大差異。離子交換型的DEAE-52纖維素脫色效果要優(yōu)于其他6種極性、非極性樹脂，其脫色率可達(dá)91.84%；同時多糖保留率相對較高，可達(dá)91.66%。

圖1 不同樹脂靜態(tài)脫色情況圖

綜上所述，優(yōu)選DEAE-52纖維素為來鳳鳳菊莖葉多糖脫色純化的最優(yōu)樹脂，進(jìn)行后面的層析純化效果實驗。

2.2 DEAE-52纖維素層析純化效果比較

2.2.1 DEAE-52（OH-）纖維素純化結(jié)果

從圖2（a）可看出，蒸餾水和NaCl溶液梯度洗脫OH-型DEAE-52纖維素層析柱，得到了4個較明顯的洗脫峰，這4個洗脫峰所占的比例不同，其中中性多糖集中于第1個洗脫峰，峰高最高；第2、3個洗脫峰較小，表示糖含量較少；第4個洗脫峰主要為色素和蛋白。實驗表明，OH-型DEAE-52纖維素層析柱對來鳳鳳菊莖葉多糖組分的分離有一定效果，但峰形較差，分離度較低。

2.2.2 DEAE-52（Cl-）纖維素純化結(jié)果

從圖2（b）可看出，分別用蒸餾水和NaCl溶液梯度洗脫Cl-型的DEAE-52纖維素層析柱，得到了5個較明顯的洗脫峰，各洗脫峰峰形集中，且分離度較好，說明Cl-型DEAE-52層析柱分離效果優(yōu)于OH-型，雖然第1個洗脫峰多糖含量高，但有一個明顯肩峰，對稱性不好，分離度有待進(jìn)一步提升。

2.2.3 DEAE-52（HCO3-）纖維素純化結(jié)果

從圖2（c）可看出，分別用蒸餾水和NaCl溶液梯度洗脫HCO3-型的DEAE-52纖維素層析柱，得到了7個較明顯的洗脫峰，第1個洗脫峰（蒸餾水段）最大，糖含量高；各峰分離度、峰形均優(yōu)于Cl-型和OH-型的DEAE-52纖維素，分辨率較高；色素和蛋白主要在第6、7峰。實驗證明HCO3-型DEAE-52纖維素對來鳳鳳菊莖葉多糖具有更好的純化效果。

3 結(jié)論與討論

圖2 DEAE-52纖維素層析洗脫曲線圖

樹脂吸附去除色素和雜質(zhì)，是一種目前廣泛應(yīng)用的現(xiàn)代分離手段，不同樹脂的脫色機(jī)理不同，因此，對性質(zhì)不同的純化對象需要選擇不同類型的樹脂。本試驗結(jié)果表明，離子交換型的DEAE-52纖維素去除來鳳鳳菊莖葉多糖色素效果最好，而極性和非極性樹脂脫色效果較差，DEAE-52纖維素是一種適合來鳳鳳菊莖葉多糖純化的樹脂。

樹脂的離子類型對分離純化的效果影響十分顯著：OH-型的DEAE-52纖維素的分離效果最差，因為OH-離子交換能力過強(qiáng)，選擇性較弱；Cl-型離子交換能力較弱，呈中性，不能影響酸性多糖的電荷，選擇能力一般；HCO3-型離子交換能力較強(qiáng)，呈堿性，影響酸性多糖的電荷，分離效果最好，分辨率最高，峰形好，洗脫峰數(shù)最多。對來鳳鳳菊莖葉多糖純化效果依次為DEAE-52（HCO3-）＞ DEAE-52（Cl-）＞DEAE-52（OH-）。

綜上所述，DEAE-52纖維素對來鳳鳳菊莖葉多糖具有較好的脫色效果和較低的多糖損失率，脫色率可達(dá)91.84%，多糖保留率可達(dá)91.66%；HCO-3型DEAE-52纖維素層析具有較好的分離純化效果，在工業(yè)化生產(chǎn)高品質(zhì)植物多糖方面有著廣闊的應(yīng)用前景。