馮翠蓮 萬玥 馮小艷 王俊剛 趙婷婷 王文治 沈林波 張樹珍

摘? 要：轉(zhuǎn)基因甘蔗BtG-2是利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法把Cry1Ac-2A-gna融合抗蟲基因?qū)搿屡_糖22號的轉(zhuǎn)基因甘蔗株系，具有良好的抗蟲特性和農(nóng)藝性狀。為了明確轉(zhuǎn)基因甘蔗BtG-2的分子特征及其檢測方法，推進(jìn)其生物安全性評價工作，以BtG-2的T2代為研究材料，利用Southern雜交檢測外源基因在轉(zhuǎn)基因甘蔗基因組內(nèi)的拷貝數(shù);利用染色體步移技術(shù)分離外源基因在甘蔗基因組中插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列，并建立了該轉(zhuǎn)化體高效靈敏的特異性PCR檢測方法。結(jié)果表明：Southern雜交檢測證明外源T-DNA以單拷貝方式插入BtG-2株系;經(jīng)過3次的熱不對稱巢式PCR擴(kuò)增，獲得外源基因T-DNA左邊側(cè)翼序列984 bp和右邊側(cè)翼序列705 bp;以這2個序列和相應(yīng)的T-DNA的左右端序列分別設(shè)計3對檢測引物對，建立了BtG-2株系的轉(zhuǎn)化事件特異性PCR檢測方法，擴(kuò)增效率最高的引物對LS011/LA451和RS160/RA588分別擴(kuò)增到440 bp和428 bp的特異片段。其中T-DNA左側(cè)設(shè)計的LS011/LA451檢測引物對擴(kuò)增的靈敏度高、特異性強(qiáng)，能夠在甘蔗BtG-2基因組DNA相對含量為0.1%的模板中檢測出轉(zhuǎn)基因目的成分，相當(dāng)于9個單倍體基因組拷貝數(shù)。本研究完成了轉(zhuǎn)基因株系BtG-2的分子特征及其轉(zhuǎn)化事件特異性檢測，為該轉(zhuǎn)基因甘蔗及其衍生產(chǎn)品的檢測和身份識別提供技術(shù)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：抗蟲轉(zhuǎn)基因甘蔗;T-DNA側(cè)翼序列;轉(zhuǎn)化事件特異性檢測;染色體步移

中圖分類號：S961.6????? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Analysis of the T-DNA Flanking Sequence and Event-specific Detection for Insect-resistant Transgenic Sugarcane BtG-2

FENG Cuilian1， WAN Yue2， FENG Xiaoyan1， WANG Jungang1， ZHAO Tingting1， WANG Wenzhi1， SHEN Linbo1， ZHANG Shuzhen1，2*

1. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Sugarcane Research Center， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Biotechnology Laboratory for Tropical Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Haikou， Hainan 571101， China; 2. College of Life Science， Nanjing Agriculture University， Nanjing， Jiangsu 210095， China

Abstract： Sugarcane BtG-2 is an insect resistance transgenic sugarcane strain， developed by introducing the Cry1Ac- 2A-gna fusion gene into ‘ROC22 with the Agrobacterium-mediated method. It has strong insect resistance and excellent agronomic traits. In order to clarify the molecular characteristics and detection of transgenic sugarcane BtG-2， and promote biological safety evaluation， the T2 generation of BtG-2 was selected， and the copy number of foreign genes in the transgenic sugarcane genome was detected by Southern hybridization. The flanking sequence of the insertion site of the foreign gene was isolated using the chromosome walking technology， and an efficient specific PCR detection method of the strain was established. The results showed that the foreign T-DNA insertion of BtG-2 strain was a single copy. After three times amplifications of thermal asymmetric interlaced PCR， 984 bp of the left flanking sequence and 705 bp of the right flanking sequence of the foreign gene T-DNA were obtained. According to the flanking sequences， three pairs of detection primers were designed respectively， then the event-specific PCR detection for transgenic sugarcane BtG-2 was established. The primer pairs with the highest amplification efficiency were LS011/LA451 and RS160/RA588， with 440 bp and 428 bp specific amplified fragments respectively. Among them， the pair of primers LS011/LA451 designed on the left side of T-DNA had high sensitivity and specificity for detection， and this method could detect the genetically modified ingredients in samples containing 0.1% genomic DNA of sugarcane BtG-2. This study completed the molecular characteristics and event-specific detection of the transgenic strain BtG-2， which provided a technical basis for the detection and identification of the transgenic sugarcane and its derivatives.

Keywords： Insect-resistant transgenic sugarcane; T-DNA flanking sequence; event-specific detection; chromosome walking

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.09.005

甘蔗（Saccharum spp.）是全球第五大宗農(nóng)作物，是世界上最重要糖料和生物燃料作物。中國糖業(yè)協(xié)會數(shù)據(jù)顯示：2020年全國種植甘蔗119.1萬hm2，產(chǎn)糖量841.9萬t，農(nóng)業(yè)直接年產(chǎn)值約480億人民幣[1]，因此甘蔗產(chǎn)業(yè)對國民經(jīng)濟(jì)具有重要的意義。然而甘蔗受各種螟蟲的為害，嚴(yán)重影響甘蔗的產(chǎn)量和質(zhì)量，僅以湘桂蔗區(qū)為例，2018—2019年，該區(qū)的甘蔗蟲害發(fā)生極為嚴(yán)重，平均螟害株率高達(dá)46.54%，平均產(chǎn)量損失為14.87%，平均蔗糖分損失高達(dá)1.12個百分點(diǎn)，農(nóng)業(yè)損失4.67億元，工業(yè)損失8.56億元，國家財政損失0.51億元[2]。因此培育抗蟲甘蔗新種質(zhì)一直是甘蔗育種的一個重要目標(biāo)，然而甘蔗是高度雜合的無性繁殖作物，其龐大的基因組、復(fù)雜的高多倍體以及同源異源雜交品種等復(fù)雜的遺傳背景[3]，給育種工作帶來很大的盲目性?；蚬こ炭啥ㄏ蚋淖冏魑锏哪承┬誀睿ㄟ^轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高甘蔗抗蟲性將是甘蔗抗蟲育種的重要新途徑。

在轉(zhuǎn)基因作物中，T-DNA在受體植物基因組中的整合位置都是隨機(jī)的，然而每個轉(zhuǎn)基因事件的T-DNA左右端序列與受體基因組序列拼接而成的T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列是唯一的，是該轉(zhuǎn)基因事件身份的特異性標(biāo)識[4]。因此，分離轉(zhuǎn)基因植物的T-DNA側(cè)翼序列，以及依據(jù)該側(cè)翼序列而建立的特異性檢測方法，是準(zhǔn)確識別不同轉(zhuǎn)基因作物，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品產(chǎn)權(quán)保護(hù)、檢測和有效監(jiān)督管理的一個重要依據(jù)。

目前分離外源T-DNA側(cè)翼序列主要以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，包括反向PCR、外源接頭介導(dǎo)PCR、半隨機(jī)引物PCR、全基因組重測序技術(shù)等，其中半隨機(jī)引物PCR中的熱不對稱交錯PCR（TAIL-PCR）、高效熱不對稱PCR（hiTAIL-PCR）或染色體步移法（Genome Walking）是當(dāng)前使用最廣泛的方法。利用此類技術(shù)已經(jīng)成功分離了轉(zhuǎn)基因水稻[4-8]、大豆[9-11]、棉花[12-13]、玉米[14-17]、小麥[18-20]、馬鈴薯[21-22]、油菜[23]和木瓜[24]等T-DNA側(cè)翼序列，并建立其相應(yīng)的轉(zhuǎn)化事件特異性檢測技術(shù);全基因組重測序是近年發(fā)展起來的新技術(shù)，是對已知基因組序列的物種進(jìn)行不同個體的基因組測序，并在此基礎(chǔ)上對個體或群體進(jìn)行差異性分析，主要用于檢測單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（SNP）、插入缺失位點(diǎn)（InDel）、結(jié)構(gòu)變異位點(diǎn)（SV）位點(diǎn)和拷貝數(shù)變異位點(diǎn)（CNV）[25]。近兩年該技術(shù)也成功應(yīng)用到分離轉(zhuǎn)基因作物大豆[26-29]、水稻[30]的T-DNA側(cè)翼序列上，并建立其相應(yīng)的轉(zhuǎn)化事件特異性檢測技術(shù)。轉(zhuǎn)基因作物轉(zhuǎn)化事件特異性檢測技術(shù)是以其轉(zhuǎn)基因T-DNA側(cè)翼序列的部分序列為靶標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物是T-DNA 5端或3端序列與受體基因組的拼接序列，因此具有高度特異性，可準(zhǔn)確識別不同的轉(zhuǎn)基因作物品系。

轉(zhuǎn)基因甘蔗的研究始于20世紀(jì)90年代初，經(jīng)過近30年的努力，取得了很大的成果。截至目前，據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織（ISAAA）的數(shù)據(jù)，獲得安全證書的甘蔗轉(zhuǎn)基因事件僅有6例，分別是巴西2017年獲批的轉(zhuǎn)Cry1Ab基因的抗蟲轉(zhuǎn)基因甘蔗CTB141175/01-A和2018年獲批的轉(zhuǎn)Cry1Ac基因的CTC91087-6和CTC93209-4，印度尼西亞2011年獲批的轉(zhuǎn)大腸桿菌的膽堿脫氫酶（EcBetA）基因耐旱轉(zhuǎn)基因甘蔗的NXI-1T，以及2013年獲批的轉(zhuǎn)苜蓿根瘤菌的膽堿脫氫酶（RmBetA）基因耐旱轉(zhuǎn)基因甘蔗的NXI-4T、NXI-6T[31]。由此可見，轉(zhuǎn)基因甘蔗的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其他作物。目前轉(zhuǎn)基因甘蔗的研究重點(diǎn)仍在遺傳轉(zhuǎn)化等前期工作上，轉(zhuǎn)基因甘蔗的生物安全評價以及檢測、監(jiān)督等后期工作的研究極少有報道，尤其轉(zhuǎn)化事件特異性檢測國內(nèi)外尚未有報道。

本研究組前期通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)把Cry1Ac- 2A-gna抗蟲融合基因轉(zhuǎn)入甘蔗新臺糖22號，經(jīng)過2個無性繁殖世代的抗蟲性和遺傳穩(wěn)定性的評價和深入農(nóng)藝性狀鑒定（待發(fā)表），已獲得抗蟲性好、農(nóng)藝性狀優(yōu)良的BtG-2株系，正準(zhǔn)備進(jìn)行環(huán)境釋放。為了明確轉(zhuǎn)基因甘蔗BtG-2的分子特征及便于其檢測，推進(jìn)其生物安全性評價工作，本研究以其無性繁殖T2代為植物材料，首先利用Southern雜交檢測外源T-DNA在BtG-2中的插入拷貝數(shù);然后利用染色體步移技術(shù)分離其T-DNA側(cè)翼序列，并根據(jù)T-DNA左右端序列和左右側(cè)翼序列設(shè)計檢測引物對，建立轉(zhuǎn)基因甘蔗BtG-2的轉(zhuǎn)化事件特異性檢測方法，同時檢驗(yàn)該方法的特異性與靈敏度，為該轉(zhuǎn)基因甘蔗及其衍生產(chǎn)品的檢測和身份識別提供技術(shù)依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

植物材料為轉(zhuǎn)Cry1c-2A-gna融合抗蟲基因和bar抗除草劑基因的甘蔗BtG-2株系以及BtG-1、BtG-4、BtG-17、BtG-32、BtG-35、BtG-36和BtG-41是通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化甘蔗‘新臺糖22號（‘ROC22）胚性愈傷而獲得，由本實(shí)驗(yàn)室保存，BtG-2株系已申請在海南省的中間試驗(yàn)。植物表達(dá)載體以pCambia3300為骨架。PCR DIG Probe Synthesis Kit、Dig nucleic acid detection kit購于德國羅氏公司;HyboodTM-N+尼龍膜購自美國GE Amersham;試劑LA Taq酶、Genome Walking Kit、pMDTM18-T Vector Cloning Kit、T4 DNA Ligase、部分Marker購于TaKaRa公司;質(zhì)粒提取、膠回收試劑盒及純化試劑盒購于Axygen公司;氨芐青霉素、瓊脂糖購于Sigma公司;2×Taq plus MasterMix購于Biosharp公司。PCR引物合成及基因測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2? 方法

1.2.1? 甘蔗BtG-2基因組DNA的提取? 選擇轉(zhuǎn)基因甘蔗BtG-2的無性繁殖T2代植株的幼嫩葉片，采用改良CTAB法大量提取并純化基因組總DNA[32]，同時提取非轉(zhuǎn)基因甘蔗ROC22基因組總DNA作為對照。取2 μL于Thermo Scientific Nano Drop One生物核酸定量檢測儀測定DNA的濃度和純度，另取2 μL于1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。

1.2.2? Southern雜交檢測? 以轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pNUBG為模板，利用高效PCR地高辛標(biāo)記法分別制備BG（包括Cry1Ac-2a-gna中Cry1Ac基因下游355 bp，2a和gna全長）、bar、sta、kan四種不同的探針，擴(kuò)增引物、退火溫度、產(chǎn)物長度等詳見表1。通過分析T-DNA區(qū)的酶切位點(diǎn)，結(jié)合各探針在T-DNA上的位置（圖1），分別選擇2種限制性內(nèi)切酶對30 μg基因組DNA進(jìn)行酶切（表1），然后轉(zhuǎn)移至HyboodTM-N+尼龍膜，再利用相應(yīng)的探針進(jìn)行Southern雜交檢測，具體步驟參照試劑盒說明書。雜交溫度為40 ℃，預(yù)雜交時間為2 h，雜交時間為16 h，室溫黑暗條件下用BCIP/NBT進(jìn)行化學(xué)顯色，待雜交信號帶清晰后終止顯色，拍照并分析[33]。

1.2.3? 轉(zhuǎn)基因甘蔗BtG-2的T-DNA左右側(cè)翼序列的獲取? 按照Genome Walking Kit中的要求，在表達(dá)載體pNUBG的T-DNA左右端序列分別設(shè)計3條退火溫度約為65 ℃的嵌套特異性引物（表2），分別命名為Lsp1、Lsp2、Lsp3和Rsp1、Rsp2、Rsp 位置見圖2。按照操作說明，分別選取試劑盒中提供的隨機(jī)簡并引物AP1、AP2、AP3、AP4其中之一，與嵌套特異性引物組合配對，進(jìn)行3輪巢式PCR擴(kuò)增，分離該株系的T-DNA左右側(cè)翼序列。第1輪PCR反應(yīng)體系中，BtG-2基因組DNA模板為200 ng，特異性引物為Lsp1或Rsp 簡并引物為AP1-AP4其中之一。第2輪PCR反應(yīng)的擴(kuò)增模板為上一輪PCR產(chǎn)物稀釋50倍，特異性引物為Lsp2或Rsp2，簡并引物為第1輪所用的AP引物，第3輪同第2輪，特異引物換成Lsp3或Rsp 每一輪反應(yīng)的退火溫度詳見表2，擴(kuò)增程序參照試劑盒說明書。3輪擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，第3輪特異擴(kuò)增片段利用DNA膠回收試劑盒回收。連接T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，選取陽性菌株送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.2.4? 轉(zhuǎn)基因甘蔗BtG-2事件特異性PCR檢測及其靈敏度? BtG-2事件特異性PCR檢測的建立：根據(jù)T-DNA左右兩側(cè)翼序列的測序結(jié)果，以及已知的T-DNA左右端載體序列分別設(shè)計3對左、右側(cè)特異性檢測引物：LS060/LA451、LS011/LA451、LS060/LA585和RS160/RA477、RS129/RA477、RS160/RA588，對轉(zhuǎn)基因甘蔗BtG-2進(jìn)行擴(kuò)增，分別篩選一組左、右特異性檢測擴(kuò)增效率最好的，并回收純化特異性片段及測序，比對是否與預(yù)期序列完全一致，最終建立事件特異性檢測方法。特異性檢測引物對的一條引物位于甘蔗基因組序列，另一條引物則位于T-DNA左、右端載體序列，引物序列詳見表3。分別利用上述篩選的2對引物和bar基因引物，以包括BtG-2在內(nèi)的轉(zhuǎn)Cry1Ac-2a-gna基因的不同甘蔗株系和非轉(zhuǎn)基因甘蔗DNA為模板，以表達(dá)載體pUNBG質(zhì)粒為對照，進(jìn)行轉(zhuǎn)化事件特異性PCR檢測。DNA模板量為200 ng，反應(yīng)循環(huán)數(shù)35，退火溫度見表3。PCR產(chǎn)物取5 μL于1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增效率和擴(kuò)增特異性。

檢測轉(zhuǎn)化事件特異性PCR的靈敏度：轉(zhuǎn)基因甘蔗BtG-2與受體甘蔗ROC22的基因組DNA分別稀釋至100 ng/μL，根據(jù)不同的比例配制BtG-2的DNA相對含量為100%、50%、10%、1%、0.5%、0.1%、0.05%和0%（V/V）的樣品?；旌蠘悠犯魅? μL作為PCR模板，分別利用上述已篩選出來的擴(kuò)增效率最高的左、右特異性引物對，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。取5 μL PCR產(chǎn)物，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳，檢查各濃度DNA模板下的擴(kuò)增效果，檢測各引物對的事件特異性PCR的特異性和靈敏度。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 抗蟲轉(zhuǎn)基因甘蔗BtG-2外源T-DNA插入拷貝數(shù)檢測

轉(zhuǎn)基因甘蔗BtG-2基因組DNA分別用BamHⅠ、NdeⅠ、EcoRⅤ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切、電泳和轉(zhuǎn)膜后，利用地高辛標(biāo)記的外源基因BG和bar片段的探針分別進(jìn)行Southern雜交檢測。

結(jié)果表明，不同限制性內(nèi)切酶酶切后的甘蔗基因組DNA經(jīng)BG和bar探針雜交后，均只顯示一條雜交帶，并且雜交帶的大小與預(yù)測理論大小一致，而對照非轉(zhuǎn)基因植株中無雜交信號，說明外源基因已整合到甘蔗BtG-2基因組中，并以單拷貝的方式整合（圖3）;用載體骨架序列制備的sta和kan探針進(jìn)行Southern雜交，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因甘蔗基因組中沒有來源于轉(zhuǎn)化載體的其他元件以及骨架序列。

2.2? T-DNA左、右側(cè)翼序列的獲得及分析

3條左側(cè)巢式特異性Lsp引物分別與試劑盒中AP1-AP4四條簡并引物組合，經(jīng)過3輪熱不對稱巢式PCR反應(yīng)后，電泳結(jié)果顯示，特異性引物與簡并引物AP3擴(kuò)增出的片段更長且特異性更好（圖4A）?；厥?rd產(chǎn)物，測序獲得984 bp的序列（圖5A），其中838 bp屬于甘蔗基因組序列，此部分GC百分含量為48.69%;剩余146 bp與T-DNA左邊載體序列重合，并且最左邊缺失了包括LB border在內(nèi)的115 bp（圖5B）。

3條右側(cè)巢式特異性Rsp引物同樣分別與試劑盒中AP1-AP4四條簡并引物組合擴(kuò)增右側(cè)翼序列，結(jié)果顯示，簡并引物AP1擴(kuò)增出的片段特異性更好（圖4B）。測序獲得705 bp的序列（圖6A），其中566 bp為甘蔗基因組序列，GC百分含量為50.71%，余下139 bp屬于T-DNA右邊界載體序列，T-DNA插入BtG-2株系基因組時，右邊比較完整，僅缺失了2 bp（圖6B）。由此可見，T-DNA序列插入時，左右兩側(cè)均有不同程度的缺失，且左邊相對容易缺失。

2.3? 建立轉(zhuǎn)基因甘蔗BtG-2事件特異性檢測方法

使用左、右端3對特異性檢測引物L(fēng)S060/ LA451、LS011/LA451、LS060/LA585和RS160/ RA477、RS129/RA477、RS160/RA588，對轉(zhuǎn)基因甘蔗BtG-2進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增效率最好的左、右特異性檢測引物對分別是LS011/LA451和RS160/ RA588（圖7A）。以轉(zhuǎn)相同基因的轉(zhuǎn)基因甘蔗株系和非轉(zhuǎn)基因甘蔗為模板，分別利用上述2對擴(kuò)增效率最好引物和bar基因引物進(jìn)行事件特異性檢測。結(jié)果顯示，使用特異性檢測引物對的擴(kuò)增產(chǎn)物中，只在轉(zhuǎn)基因甘蔗BtG-2可擴(kuò)增到大小為440 bp（左側(cè)翼）和428 bp（右側(cè)翼）的特異性條帶，其他轉(zhuǎn)基因株系和非轉(zhuǎn)基因材料擴(kuò)增均為陰性（圖7C、D）;而使用bar基因引物的擴(kuò)增產(chǎn)物中，表達(dá)載體質(zhì)粒和轉(zhuǎn)基因各株系均能擴(kuò)增到約423 bp的特異性片段，只有非轉(zhuǎn)基因甘蔗擴(kuò)增結(jié)果為陰性（圖7B）。BtG-2擴(kuò)增到的440 bp和428 bp的特異性片段回收后，經(jīng)測序比對證實(shí)與預(yù)期序列完全一致。證明引物對LS011/LA451和RS160/RA588可特異的識別轉(zhuǎn)基因甘蔗事件BtG-2。

2.4? 事件特異性PCR檢測的靈敏度

利用引物對LS011/LA451和RS160/RA588檢測事件特異性PCR在不同BtG-2的DNA含量混合樣品中的擴(kuò)增限度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以左側(cè)引物對LS011/LA451擴(kuò)增時，當(dāng)BtG-2的DNA含量降低至0.1%時，仍然可以特異地擴(kuò)增到目的片段（圖8A）;以右側(cè)引物對RS160/RA588擴(kuò)增時，當(dāng)BtG-2的DNA含量降低至1%和0.5%時，除了目的片段，還出現(xiàn)了非特異片段的擴(kuò)增，當(dāng)BtG-2的DNA含量降低至0.1%及更低時，只有非特異片段的擴(kuò)增（圖8B）。以上結(jié)果表明，以右側(cè)引物對RS160/RA588的特異性PCR檢測的特異性和靈敏度較差，而以左側(cè)引物對LS011/LA451的特異性PCR檢測的特異性好、靈敏度高，最低檢出值達(dá)每100 ng DNA模板量的0.1%，按甘蔗基因組為10 Gb計算，相當(dāng)于9個單倍體基因組拷貝數(shù)，該靈敏度可滿足事件特異性檢測的要求。

3? 討論

近年來，轉(zhuǎn)基因作物種植及應(yīng)用持續(xù)保持穩(wěn)定增長，2018年，全球26個國家種植了1.917億hm2轉(zhuǎn)基因作物，比2017年增長1%。2019年，全球共有43項關(guān)于轉(zhuǎn)基因作物的批準(zhǔn)，有9個新的轉(zhuǎn)基因作物品種獲得批準(zhǔn)，包括油菜、棉花、豇豆、大豆和甘蔗。而國內(nèi)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公示了192個擬頒發(fā)的“農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書”植物品種，其中包括189個棉花、2個玉米和1個大豆品種[34]。然而轉(zhuǎn)基因作物的快速發(fā)展，亟需對轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行有效的評估與監(jiān)管。每一個轉(zhuǎn)化事件中，T-DNA在受體植物的插入都是隨機(jī)的，因此，T-DNA側(cè)翼序列的克隆及定位對于轉(zhuǎn)因植株的身份驗(yàn)證具有重要意義，并有助于對外源基因的表達(dá)和外源基因在受體植物中所能產(chǎn)生的影響進(jìn)行研究，從而有利于對轉(zhuǎn)基因植株的安全性做出充分評估[5]。

檢測外源基因旁側(cè)序列及在受體基因組中的整合位點(diǎn)的方法有很多種，當(dāng)前應(yīng)用最廣泛最成功的的是熱不對稱交錯PCR或染色體步移法，以及近幾年發(fā)展起來的全基因組重測序新技術(shù)。后者是對已知基因組序列的物種進(jìn)行不同個體的基因組測序，并在此基礎(chǔ)上對個體或群體進(jìn)行差異性分析，由此可見，應(yīng)用該技術(shù)的前提條件是已知受體植物的基因組序列信息。截至目前，國內(nèi)外并未對甘蔗ROC22開展基因組測序工作，因此本研究仍然選擇操作比較繁瑣的染色體步移法。染色體步移法的原理和熱不對稱交錯PCR是一致的。本研究中，根據(jù)已知T-DNA左右序列設(shè)計3條同向Tm值約為65 ℃的特異性引物，與Genome Walking Kit中的4條簡并引物分別進(jìn)行熱不對稱PCR反應(yīng)，通過3次巢式PCR反應(yīng)后，電泳檢測發(fā)現(xiàn)，4條簡并引物跟相同的特異性引物組合的擴(kuò)增效率差異很大，只有簡并引物AP1和右側(cè)特異性引物組合、AP3和左側(cè)特異性引物組合經(jīng)過退火溫度、模板濃度等調(diào)整可擴(kuò)增到特異片段，其他組合經(jīng)過多次調(diào)整仍無法得到特異片段，由此推測AP1和AP3簡并引物比較適用于甘蔗。

通過上述染色體步移法獲得了BtG-2的T-DNA側(cè)翼序列，上傳至NCBI的核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，結(jié)果顯示沒有任何的同源序列，原因是甘蔗栽培種全基因組測序尚未完成，NCBI的核酸數(shù)據(jù)庫只有少量的轉(zhuǎn)錄組測序序列和一些EST序列，因而無法對抗蟲轉(zhuǎn)基因甘蔗T-DNA插入位點(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)的定位。另一方面甘蔗割手密種AP85-441基因組測序于2018年完成并發(fā)表在《Nature Genetics》上[35]，本研究團(tuán)隊成員把序列下載到本地，進(jìn)行本地化建庫獲得庫文件，T-DNA側(cè)翼序列Blastn比對，發(fā)現(xiàn)T-DNA插入位點(diǎn)可能位于該基因組的Chr1B非編碼區(qū)92 525 762位點(diǎn)、Chr3B非編碼區(qū)8 557 277位點(diǎn)、Chr3D非編碼區(qū)7 168 624位點(diǎn)、Chr5C非編碼區(qū)38 753 724位點(diǎn)。從上述結(jié)果看，外源基因插入位點(diǎn)可能是甘蔗基因組的重復(fù)序列區(qū)，此重復(fù)序列存在于甘蔗割手密基因組多條染色體上;從Southern雜交的結(jié)果看，外源基因在甘蔗基因組中只有一個整合位點(diǎn)，而就目前缺少甘蔗基因組序列數(shù)據(jù)庫的情況下，根據(jù)甘蔗某段核酸序列而進(jìn)行準(zhǔn)確的染色體定位是極其困難的，最好的解決方法是加快甘蔗基因組的測序工作。據(jù)了解，國內(nèi)已經(jīng)有甘蔗研究團(tuán)隊準(zhǔn)備甘蔗ROC22的基因組測序工作，該項工作的完成，勢必將甘蔗基因組功能研究等基礎(chǔ)研究推上一個新的臺階。

通過擴(kuò)增T-DNA插入片段和受體基因組的連接區(qū)域而建立起來的事件特異性檢測法，是鑒定含有相同T-DNA插入片段的不同轉(zhuǎn)化事件的有效方法，是目前用于轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分檢測的最常用方法。本研究建立的轉(zhuǎn)基因甘蔗BtG-2的事件特異性PCR檢測方法特異性好、靈敏度高，轉(zhuǎn)基因成分含量0.1%及以上時，利用常規(guī)定性PCR方法即可檢測，此檢測靈敏度遠(yuǎn)高于歐盟對轉(zhuǎn)基因植物衍生的食品及飼料標(biāo)識的最低限量（0.9%）[36]。

4? 結(jié)論

本研究利用Southern雜交確定了轉(zhuǎn)基因甘蔗BtG-2的外源基因的插入拷貝為單拷貝;利用染色體步移方法，擴(kuò)增得到轉(zhuǎn)基因甘蔗BtG-2外源基因插入位點(diǎn)的左右側(cè)翼序列;以此序列為基礎(chǔ)，建立了轉(zhuǎn)基因甘蔗BtG-2的事件特異性檢測方法。該方法特異性好、靈敏度高，為轉(zhuǎn)基因甘蔗BtG-2的利用及產(chǎn)品檢測提供關(guān)鍵技術(shù)基礎(chǔ)。

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