張洪波 趙成跟 黃興建

摘要：目的 研究降纖酶制備工藝中β-丙內(nèi)酯對(duì)脂包膜指示病毒的滅活能力，為該產(chǎn)品病毒安全性評(píng)價(jià)提供依據(jù)。方法 用微量滴定法測定β-丙內(nèi)酯工藝處理前后各批次樣品中指示病毒VACV和VSV的滴度，按Reed-Muench法計(jì)算病毒滴度，并計(jì)算β-丙內(nèi)酯處理前后各批次樣品中各指示病毒的滴度下降值。結(jié)果 β-丙內(nèi)酯靜置滅活2h后，蛇毒溶液中VACV滴度均降至檢出限1.7 logs以下，滴度平均下降值≥4.3 logs;8h后，蛇毒溶液中VSV滴度均降至檢出限1.7 logs以下，滴度平均下降值≥5.0 logs。對(duì)照組蛇毒溶液靜置24h后VACV滴度平均下降0.4 logs，VSV滴度平均下降0.3 logs。結(jié)論 降纖酶制備工藝中的β-丙內(nèi)酯工藝是一個(gè)有效的滅活脂包膜病毒的工藝步驟。

關(guān)鍵詞：尖吻蝮蛇蛇毒;β-丙內(nèi)酯;VACV;VSV

Abstract： Objective To study the ability of β-Propiolactone to inactivate lipid-encapsulated indicator viruses in the preparation process of defibrase， and to provide a basis for the virus safety evaluation of the product. Methods Microtiter method was used to determine the titers of indicator viruses VACV and VSV in each batch of samples before and after the β-Propiolactone process. The virus titer was calculated according to the Reed-Muench method， and the titer of each indicator virus in each batch of samples before and after the β-Propiolactone treatment was calculated. Decline value. Results After the BPL was inactivated for 2 hours， the VACV titer in the snake venom solution fell below the detection limit of 1.7 logs， and the average titer decrease was ≥4.3 logs. After 8 hours， the VSV titer in the snake venom solution fell to the detection limit of 1.7. Below logs， the average drop in titer is ≥5.0 logs. The VACV titer of the snake venom solution in the control group decreased by 0.4 logs and the VSV titer decreased by 0.3 logs after being allowed to stand for 24 hours. Conclusion The β-Propiolactone process in the preparation of defibrase is an effective process step for inactivating lipid-enveloped viruses.

Keywords： Agkistrodon ?venom; BPL; VACV; VSV

【中圖分類號(hào)】R97 ? ? ? ? ? ? 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A ? ? ? ? ? ? 【文章編號(hào)】2107-2306（2021）09--03

降纖酶是從尖吻蝮蛇蛇毒中提取分離得到的一種類凝血酶，是以絲氨酸為活性中心的蛋白水解酶，直接作用于纖維蛋白原，釋放血纖肽A（FPA），生成非交聯(lián)的纖維蛋白，具有顯著的去纖、降粘、溶栓等作用，臨床上廣泛應(yīng)用于治療和預(yù)防心腦血管血栓性疾病[1]。

然而蛇毒粗毒成分非常復(fù)雜， 除類凝血酶外還含有神經(jīng)毒素、細(xì)胞毒素、肌肉毒素等多種活性成分，為引起各種毒副作用的主要原因[2];現(xiàn)行降纖酶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求降纖酶產(chǎn)品純度達(dá)到SDS-PAGE電泳純， HPLC測定純度需大于90%[3]，而天然蛇毒中的類凝血酶絕大多數(shù)為酸性蛋白質(zhì)， 經(jīng)典的蛋白質(zhì)提純方法如鹽析、熱變性、酸堿變性、有機(jī)溶劑沉淀、超速離心等， 由于專一性差和分辨率不高，不能有效去除病毒類雜質(zhì)，已很少用于降纖酶的制備。

β-丙內(nèi)酯（BPL）是一種雜環(huán)類烷化劑，可作用于病原體DNA或RNA，改變病毒核酸結(jié)構(gòu)，使病毒失去傳染性，從而達(dá)到滅活目的，而不直接作用于蛋白，對(duì)病毒具有很強(qiáng)的滅活作用，可以單獨(dú)用來滅活病毒或與紫外線照射結(jié)合應(yīng)用，具有易水解、滅活時(shí)間段等優(yōu)點(diǎn)[4-7]。

在證明生產(chǎn)過程中病毒滅活的研究中，滅活研究的指示病毒應(yīng)選擇制品可能污染的病毒或理化性質(zhì)相似的病毒，至少應(yīng)包括單鏈和雙鏈的RNA及DNA、脂包膜和非脂包膜、強(qiáng)和弱抵抗力、大和小顆粒等病毒;至少應(yīng)包括一種對(duì)物理和/或化學(xué)有明顯抗性的病毒。本研究參照《生物組織提取制品和真核細(xì)胞表達(dá)制品的病毒安全性評(píng)價(jià)技術(shù)評(píng)審一般原則》[8]，選擇脂包膜病毒牛痘病毒（vaccinina Virus，VACA）和水皰性口腔炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus，VSV）作為研究的指示病毒，旨在探索降纖酶制備工藝中BPL對(duì)指示病毒VACA和VSV的滅活能力，為該產(chǎn)品病毒安全性評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

其中其中VACV屬脂包膜雙鏈DNA病毒，大小300nm×250nm，中等理化抗性;VSV屬脂包膜單鏈RNA病毒，大小75×175nm，低理化抗性。

1 材料及方法

1.1 樣品

尖吻蝮蛇蛇毒（批號(hào)：M192017001、M192018001、M192018002）由本公司提供。

1.2 指示病毒及細(xì)胞

VACA病毒（批號(hào)：20180820）、VSV病毒（批號(hào)：20180306）由蘇州良辰生物醫(yī)藥科技有限公司購

自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，并進(jìn)一步擴(kuò)增成工作病毒。

Vero細(xì)胞由蘇州良辰生物醫(yī)藥科技有限公司購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫，并進(jìn)一步傳代為工作細(xì)胞。

1.3 主要試劑

β-丙內(nèi)酯（批號(hào)：20171101）、牛血清白蛋白（批號(hào)：224X055、224X0520）購自北京萊寶科技有限公司，抗五步蛇血清（批號(hào)：試20170903）購自上海賽倫生物科技有限公司，MEM培養(yǎng)基（批號(hào)：AD15805276）購自通用電氣醫(yī)療系統(tǒng)貿(mào)易發(fā)展（上海）公司Hyclone細(xì)胞培養(yǎng)部，胎牛血清（FBS）（批號(hào)：20150804）購自蘭州民海生物工程有限公司。

1.4 方法

實(shí)際工藝中β-丙內(nèi)酯處理的溫度為2～8℃，本研究選擇工藝條件中較難滅活病毒的條件即較低的溫度（3±1℃）進(jìn)行試驗(yàn);取樣時(shí)，尖吻蝮蛇蛇毒溶液用MEM培養(yǎng)基50倍稀釋并用抗五步蛇血清中和以終止取樣后的BPL對(duì)病毒的繼續(xù)滅活以及降低樣品對(duì)指示細(xì)胞的影響。據(jù)此設(shè)計(jì)了一系列實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組設(shè)置0、1h、2h、4h、8h和24h六個(gè)取樣點(diǎn)，用以考察不同時(shí)間段β-丙內(nèi)酯對(duì)指示病毒的滅活能力;對(duì)照組設(shè)置白蛋白對(duì)照、起始滴度對(duì)照組、細(xì)胞毒性對(duì)照、未處理對(duì)照、中和劑對(duì)照、終止效果對(duì)照、病毒對(duì)照和細(xì)胞陰性對(duì)照。

試驗(yàn)組：尖吻蝮蛇蛇毒溶液加入0.1%β-丙內(nèi)酯溶液混勻定容后按9：1（樣品：病毒，V：V）比例加入指示病毒VACV和VSV，使β-丙內(nèi)酯的濃度為0.025%，攪拌混勻后置于3±1℃恒溫水浴靜置滅活，于各取樣時(shí)間點(diǎn)取樣，用MEM培養(yǎng)基50倍稀釋并用20%抗五步蛇血清中和后測定病毒滴度。

白蛋白對(duì)照組：以牛血清白蛋白代替尖吻蝮蛇蛇毒，經(jīng)相同工藝濃度、相同工藝過程處理后，測定各取樣點(diǎn)的病毒滴度。

起始滴度對(duì)照組：取與試驗(yàn)組相同濃度的尖吻蝮蛇蛇毒和牛血清白蛋白，按9：1（樣品：病毒，V：V）比例加入指示病毒VACV和VSV，用MEM培養(yǎng)基50倍稀釋后測定病毒滴度。

細(xì)胞毒性對(duì)照組：尖吻蝮蛇蛇毒溶液用MEM培養(yǎng)基50倍稀釋加入20%抗五步蛇血清中和、0.1%β-丙內(nèi)酯溶液用MEM培養(yǎng)基稀釋使成0.025%的溶液、尖吻蝮蛇蛇毒溶液經(jīng)β-丙內(nèi)酯處理后用MEM培養(yǎng)基50倍稀釋，分別加入指示細(xì)胞Vero細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察Vero細(xì)胞生長狀況。

未處理對(duì)照組：尖吻蝮蛇蛇毒溶液和牛血清白蛋白溶液加入指示病毒VACV和VSV，于3±1℃水浴靜置24h，測定病毒滴度。

中和劑對(duì)照組：抗五步蛇血清用MEM培養(yǎng)基50倍稀釋后加入指示病毒VACV和VSV測定病毒滴度。

終止效果對(duì)照組：三批次β-丙內(nèi)酯滅活蛇蛇毒溶液中VACV和VSV第24h取樣的樣品其50倍稀釋度的細(xì)胞孔（測定為陰性的細(xì)胞孔）分別進(jìn)行盲傳三代，在倒置顯微鏡下觀察Vero細(xì)胞生長狀況。

病毒對(duì)照組：取指示病毒VACV和VSV，按1：9（病毒：培養(yǎng)基，V：V）比例加入MEM培養(yǎng)基，再用MEM培養(yǎng)基50倍稀釋后測定病毒滴度。

細(xì)胞陰性對(duì)照組：MEM培養(yǎng)基加入指示細(xì)胞Vero細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察Vero細(xì)胞生長狀況。

用微量滴定法測定實(shí)試驗(yàn)組和對(duì)照組樣品的病毒滴度，并將不同時(shí)間點(diǎn)所取的尖吻蝮蛇蛇毒樣品用細(xì)胞維持液（含2%FBS的MEM培養(yǎng)基）做10倍梯度稀釋至10-7，立即加入已接種Vero細(xì)胞的96孔板中，置于5%CO2培養(yǎng)箱，37℃孵育（VACA用Vero細(xì)胞培養(yǎng)168h，每隔72h換液一次;VSV用Vero細(xì)胞培養(yǎng)72h），在倒置顯微鏡下觀察指示細(xì)胞的病變情況。按Reed-Muench法計(jì)算病毒滴度（以半數(shù)細(xì)胞感染劑量TCID50表示，TCID50對(duì)數(shù)值=高于50%組病變的病毒稀釋度的對(duì)數(shù)值+距離比例），并計(jì)算β-丙內(nèi)酯處理前后各批次樣品中各指示病毒的滴度下降值。

為了確認(rèn)尖吻蝮蛇蛇毒樣品中指示病毒是否完全被滅活，在滴定β-丙內(nèi)酯滅活蛇毒溶液中VACV和VSV第24h取樣的樣品時(shí)，分別將培養(yǎng)168/72h后未出現(xiàn)Vero細(xì)胞病變的50倍稀釋度的測定細(xì)胞孔，反復(fù)凍融3次（放置于-35℃冰箱，待完全凝固后取出，置于37℃培養(yǎng)箱中融化，如此反復(fù)凍融3次），離心取上清液，分別滴加至接種Vero細(xì)胞的96孔板中，37℃吸附1h后換含有2%FBS的MEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（VACA用Vero細(xì)胞培養(yǎng)168h，每隔72h換液一次;VSV用Vero細(xì)胞培養(yǎng)72h）。在倒置顯微鏡下觀察Vero細(xì)胞生長狀況，如未觀察到細(xì)胞病變，重復(fù)上述操作2次，如仍觀察不到細(xì)胞病變，即為盲傳三代無病變，表明樣品中指示病毒VACV和VSV均被完全滅活。

2 結(jié)果

2.1 ?β-丙內(nèi)酯滅活試驗(yàn)

經(jīng)0.025%BPL滅活2h三批次蛇毒溶液中VACV滴度均降至檢測限1.7 logs以下，滴度平均下降值≥4.3 logs;滅活8h三批次蛇毒溶液中VSV滴度均降至檢測限1.7 logs以下，滴度平均下降值≥5.0 logs。

2.2 對(duì)照試驗(yàn)

2.2.1白蛋白對(duì)照試驗(yàn)，經(jīng)0.025%β-丙內(nèi)酯滅活2h三批次牛血清白蛋白中VACV滴度均降至檢測限1.7 logs以下，滴度平均下降值≥4.1 logs;滅活8h三批次牛血清白蛋白中VSV滴度均降至檢測限1.7 logs以下，滴度平均下降值≥5.3 logs。

2.2.2起始滴度對(duì)照試驗(yàn)，尖吻蝮蛇蛇毒和牛血清白蛋白起始滴度與試驗(yàn)組不存在差異。

2.2.3細(xì)胞毒性對(duì)照試驗(yàn)，Vero細(xì)胞生長良好。

2.2.4未處理對(duì)照試驗(yàn)，三批次蛇蛇毒溶液中VACV滴度平均僅下降0.4 logs，三批次牛血清白蛋白溶液中VACV滴度平均僅下降0.3 logs;三批次蛇蛇毒溶液中VSV滴度平均僅下降0.3 logs，三批次牛血清白蛋白溶液中VSV滴度平均僅下降0.2 logs。

2.2.5中和劑對(duì)照試驗(yàn)，三批次抗五步蛇血清中VACV和VSV滴度平均僅下降0.4 logs。

2.2.6終止效果對(duì)照試驗(yàn)，指示細(xì)胞Vero細(xì)胞均正常生長，即盲傳三代無病變。

2.2.7細(xì)胞陰性對(duì)照試驗(yàn)，Vero細(xì)胞正常生長。

3 討論

細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示20%的抗五步蛇血清能中和尖吻蝮蛇蛇毒，β-丙內(nèi)酯處理后的樣品其50倍稀釋度對(duì)Vero細(xì)胞生長均無影響，因此指示病毒VACV和VSV的滴度最低檢測限均為1.7 logs。

試驗(yàn)組三批次終止效果驗(yàn)證對(duì)照和病毒起始滴度差均<0.5 logs，表明所取樣品經(jīng)終止反應(yīng)（用培養(yǎng)基50倍稀釋并用抗五蛇血清中和）后對(duì)指示病毒不再具有滅活作用，對(duì)指示細(xì)胞也不再具有毒性作用，因此本研究中采用培養(yǎng)基50倍稀釋并用抗五步蛇血清中和以終止β-丙內(nèi)酯滅活并消除蛇毒毒性的方法是有效的。

中和劑對(duì)照中，相同濃度的抗五步蛇血清中加入指示病毒VACV和VSV后，與病毒本身滴度相比，其滴度下降值均<0.5 logs，表明該中和劑本身對(duì)指示病毒VACV和VSV均沒有滅活作用，用該五步蛇血清中和蛇毒對(duì)病毒滅活效果不會(huì)產(chǎn)生影響。

未處理對(duì)照中，蛇毒溶液和牛血清白蛋白溶液中加入指示病毒后隨實(shí)驗(yàn)組于3±1℃水浴靜置24h，三批次樣品中VACV和VSV滴度下降值均<0.5 logs，表明相同工藝時(shí)間內(nèi)樣品本身對(duì)指示病毒VACV和VSV均沒有滅活作用。

三批次β-丙內(nèi)酯滅活蛇毒溶液中VACV和VSV第24h取樣的樣品其50倍稀釋度的細(xì)胞孔（測定為陰性的細(xì)胞孔）分別進(jìn)行盲傳三代，指示細(xì)胞Vero細(xì)胞均正常生長，即盲傳三代無病變，表明指示病毒VACV和VSV被完全滅活。

《生物組織提取制品和真核細(xì)胞表達(dá)制品的病毒安全性評(píng)價(jià)技術(shù)評(píng)審一般原則》中規(guī)定“對(duì)于生物組織提取制品應(yīng)包含兩種從機(jī)制上能夠互補(bǔ)的有效工藝步驟，至少一個(gè)處理步驟應(yīng)具有針對(duì)非脂包膜病毒的去除和/或滅活效應(yīng);”“一般將病毒感染性滴度減少≥4 logs的處理步驟認(rèn)可為有效的病毒去除/滅活工藝步驟?！保堆褐破啡コ?滅活病毒技術(shù)方法及驗(yàn)證指導(dǎo)原則》[9]中規(guī)定“如果制品的生產(chǎn)工藝中包含兩步或兩步以上病毒去除/滅活方法，應(yīng)該分別進(jìn)行病毒滅活效果驗(yàn)證?！薄安《窘档土浚╨og10）≥4 logs，表示該步驟去除/滅活病毒有效。如因檢測方法造成病毒降低量<4 logs時(shí)，應(yīng)盲傳三代，如無病毒檢出，可認(rèn)定是有效的滅活病毒方法”。

因此本次研究表明降纖酶制備工藝中的β-丙內(nèi)酯工藝是一個(gè)有效的滅活脂包膜病毒的工藝步驟。

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