游啟孫

(福建三明林業(yè)學(xué)校，福建 三明 365001)

1 引言

風(fēng)柜斗草又名楮頭紅、東方肉穗草，屬于野牡丹科肉穗草屬草本植物。多生長(zhǎng)于密林下蔭濕的地方或溪邊，是閩南地區(qū)常用的民間草藥，1989年被廈門市列入瀕危植物[1]。全草可入藥，具清肝明目的作用，治耳鳴及目霧等癥或祛肝火，尤其對(duì)急性肝炎療效最佳，對(duì)慢性肝炎及乙肝病毒攜帶者有效[2], 并用于治療肝硬化頑固性腹水及原發(fā)性肝癌[3],其功能和作用加速了風(fēng)柜斗草的藥理、藥效和繁殖等方面的深入研究。但是由于野生資源過(guò)度采挖，生態(tài)環(huán)境的破壞，野生資源日益枯竭，而當(dāng)前風(fēng)柜斗草人工繁育主要以采集野生苗分株和扦插，成活率低且繁殖速度慢[4]，并不能滿足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求，因此風(fēng)柜斗草的組培快繁研究極具意義，既豐富了繁殖方式，又滿足了種苗供應(yīng)。風(fēng)柜斗草及相近植物相關(guān)研究有些許報(bào)道，但組培研究報(bào)道較少：李金雨等[1]對(duì)風(fēng)柜草栽培技術(shù)及開(kāi)發(fā)利用進(jìn)行相關(guān)研究；陳向東[5]介紹林下人工種植風(fēng)柜斗草的相關(guān)技術(shù)，詳細(xì)分析林下種植所帶來(lái)的市場(chǎng)、經(jīng)濟(jì)、生態(tài)等效益；蔡坤秀等[6]應(yīng)用正交試驗(yàn)方法研究野牡丹科葉底紅組織培養(yǎng)和快速繁殖條件的優(yōu)化。目前風(fēng)柜斗草研究多為栽植技術(shù)和藥理方向，其組培快繁技術(shù)研究鮮有報(bào)道，本研究以風(fēng)柜斗草當(dāng)年生莖段為材料，建立風(fēng)柜斗草組培快繁體系，為工廠化育苗提高技術(shù)支撐。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

采集野外風(fēng)柜斗草并移栽于福建三明林業(yè)學(xué)校溫室大棚，取當(dāng)年生莖段作為外植體材料。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 外植體預(yù)處理與消毒

莖桿浸泡于含吐溫20的溶液中并清洗，流水沖洗0.5 h。75%酒精處理8～15 s，0.1%HgCl2溶液浸泡6、8、10、12、14 min，無(wú)菌水沖洗5次，切為單節(jié)莖段，接種于MS培養(yǎng)基中。每處理30瓶，重復(fù)3次，每瓶1根，每7 d觀察1次，30 d后統(tǒng)計(jì)污染率、褐化率與成活率。

2.2.2 芽誘導(dǎo)培養(yǎng)

消毒處理的單節(jié)莖段在附加6-BA(1.0、2.0與3.0)mg/L和NAA(0.1與0.5) mg/L激素配比的MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)，以空白MS培養(yǎng)基作為對(duì)照，每處理15瓶，重復(fù)3次，每瓶接種3根外植體。30 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率和生長(zhǎng)情況。

2.2.3 增殖培養(yǎng)

將誘導(dǎo)不定芽轉(zhuǎn)入附加6-BA(1.0、1.5、2.0 mg/L)和 NAA(0、0.1、0.3 mg/L)的MS培養(yǎng)基作雙因素完全試驗(yàn)，以MS基本培養(yǎng)基作為對(duì)照，每處理15瓶，重復(fù)3次，每瓶接種3叢(3株/叢)。30 d后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)和生長(zhǎng)狀況。

2.2.4 生根培養(yǎng)

以MS、1/2MS、1/3MS培養(yǎng)基 ，IBA(0.1、0.2、0.3 mg/L)及 NAA (0、0.1、0.2 mg/L)作3因素L9(33)正交試驗(yàn)，每處理20瓶，每瓶接種4株，重復(fù)3次，30d后統(tǒng)計(jì)生根率及根系生長(zhǎng)。

2.2.5 煉苗及移栽

在帶遮陽(yáng)網(wǎng)的溫室大棚中煉苗7 d，取苗洗凈培養(yǎng)基，在0.2%多菌靈溶液中浸根3～5 min，溫室大棚進(jìn)行移栽。移栽基質(zhì)為消毒過(guò)的不同配比營(yíng)養(yǎng)土、珍珠巖和黃泥土。溫度25 ℃左右，噴霧保濕，60 d后統(tǒng)計(jì)成活率及生長(zhǎng)狀況。

以上培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)基含白砂糖30 g/L，卡拉膠7 g/L，pH值6.0,生根培養(yǎng)添加活性炭0.1%。培養(yǎng)溫度(25±1) ℃，光照時(shí)間11 h/d，光照強(qiáng)度2000 lx。

2.3 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用 Excel軟件和DPS v7.05進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 消毒時(shí)間對(duì)外植體的影響

不同0.1%HgCl2消毒時(shí)間對(duì)風(fēng)柜斗草莖段的影響結(jié)果見(jiàn)表1。每處理30瓶，重復(fù)3次，共90個(gè)外植體，試驗(yàn)結(jié)果顯示：消毒時(shí)間6～14 min，外植體污染率從58.89%下降到2.22%，污染率逐漸降低；褐化率由13.33%增加到74.44%，褐化率不斷升高；消毒時(shí)間短，褐化率低但是污染率高，外植體消毒時(shí)間長(zhǎng)，污染率低但是褐化率高，外植體成活率均較低(27.78%和23.33%)；外植體成活率隨消毒時(shí)間先提升后下降，在10min時(shí)成活率最高為65.56%。因此風(fēng)柜斗草莖段俑0.1%HgCl2消毒最佳時(shí)間為10 min。

表1 消毒時(shí)間對(duì)外植體的影響

3.2 不定芽誘導(dǎo)

6-BA和NAA配比的雙因素完全試驗(yàn)對(duì)風(fēng)柜斗草莖段誘導(dǎo)及生長(zhǎng)情況影響見(jiàn)表2。對(duì)照組誘導(dǎo)率為52.75%，顯著低于添加激素的組合，且全部為單芽，表明激素的添加對(duì)腋芽的誘導(dǎo)有顯著影響；6-BA濃度1～3 mg/L范圍內(nèi)，腋芽誘導(dǎo)率隨濃度升高而提升，且多芽率也逐漸提高，當(dāng)6-BA濃度為3 mg/L時(shí)均為多芽，但存在32%玻璃化苗，說(shuō)明6-BA濃度過(guò)高；添加NAA對(duì)腋芽誘導(dǎo)有促進(jìn)作用，濃度為0.1 mg/L相較于0.5 mg/L，誘導(dǎo)率和多芽率都更高，且濃度為0.5 mg/L時(shí)會(huì)出現(xiàn)無(wú)效愈傷，不利于誘導(dǎo)。試驗(yàn)結(jié)果顯示處理3:MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA為最佳誘導(dǎo)配方，誘導(dǎo)率為86.46%，且87%為多芽(圖1a)。

表2 6-BA和NAA對(duì)外植體誘導(dǎo)的影響

3.3 不同激素配比對(duì)對(duì)風(fēng)柜斗草增殖的影響

將誘導(dǎo)的不定芽接種到增殖培養(yǎng)基中做雙因素(6-BA，NAA)3水平完全試驗(yàn)，9種組合處理的duncan多重比較結(jié)果表明(表3)：在對(duì)照未加激素的培養(yǎng)基，芽苗正常生長(zhǎng)，但增殖系數(shù)為1.37；6-BA各濃度間增殖系數(shù)差異性顯著，濃度1.5 mg/L對(duì)叢生芽增殖影響最大，濃度2.0 mg/L和濃度1.0 mg/L次之，濃度為2.0 mg/L時(shí)出現(xiàn)畸形芽；NAA各濃度間差異性同樣顯著，濃度越高對(duì)增殖影響越小且芽苗質(zhì)量較差，濃度為0.3 mg/L有愈傷出現(xiàn)；處理4的增殖系數(shù)最大為6.32，極顯著高于其他處理，且芽苗生長(zhǎng)好、葉色正常(圖1b)。因此最佳增殖培養(yǎng)基為4號(hào)處理：MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA。

表3 不同激素配比對(duì)風(fēng)柜斗草增殖的影響

3.4 生根誘導(dǎo)培養(yǎng)

取2 cm以上、生長(zhǎng)正常的不定芽，采用3因素3水平L9正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行生根培養(yǎng)(第四列為空列)。9種組合的根數(shù)量與根長(zhǎng)度方差分析表明，6-BA和NAA對(duì)風(fēng)柜斗草生根數(shù)量和根長(zhǎng)度影響極顯著，基本培養(yǎng)基對(duì)生根影響不顯著。duncan多重比較結(jié)果顯示(表4)：各處理的生根率都在100%，風(fēng)柜斗草生根較容易；基本培養(yǎng)基(MS、1/2 MS、1/3 MS)對(duì)根數(shù)量及根長(zhǎng)度影響不顯著，說(shuō)明基本培養(yǎng)基對(duì)風(fēng)柜斗草根的生長(zhǎng)影響不大；濃度0.2 mg/L的IBA對(duì)根數(shù)量和根長(zhǎng)度影響最大，與其他濃度差異性顯著，在根數(shù)量上，濃度0.3 mg/L影響次之、濃度0.1 mg/L影響最低，濃度0.3 mg/L和濃度0.1 mg/L對(duì)根長(zhǎng)度影響不顯著；NAA各濃度對(duì)根數(shù)量和影響差異性顯著，影響程度0.1 mg/L>0.2 mg/L>0.0 mg/L，NAA各濃度在根長(zhǎng)度影響上，濃度0.1 mg/L與其他濃度差異顯著，另外兩個(gè)濃度差異不顯著；IBA少量和NAA不添加時(shí)根生長(zhǎng)纖細(xì)，NAA和IBA濃度高時(shí)易產(chǎn)生愈傷。處理2對(duì)根數(shù)量和長(zhǎng)度影響顯著的高于其他處理，且根生長(zhǎng)較好(粗且無(wú)愈傷，圖1c)。因此最佳生根培養(yǎng)基為2號(hào)處理：MS+0.2 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA。

表4 基本培養(yǎng)基、6-BA和NAA對(duì)風(fēng)柜斗草試管苗生根的影響

3.5 試管苗煉苗與移栽

生根培養(yǎng)30 d后，將試管苗在溫室大棚進(jìn)行煉苗7 d，前4 d緊閉瓶蓋，后3 d逐漸松蓋，洗凈培養(yǎng)基，0.1%多菌靈浸泡3～5 min，移栽到準(zhǔn)備好的基質(zhì)中，進(jìn)行移栽試驗(yàn)和duncan多重比較。從表5中看出，基質(zhì)對(duì)移栽成活率有顯著差異，4號(hào)基質(zhì)組合移栽成活率最高，極顯著高于其他基質(zhì)組合，黃泥土越高的基質(zhì)移栽成活率最低且葉色偏黃，營(yíng)養(yǎng)土中添加少量黃泥土有助于提高移栽成活率，因此風(fēng)柜斗草最佳移栽基質(zhì)為營(yíng)養(yǎng)土∶黃泥土∶珍珠巖(3∶1∶1)，移栽成活率為90.89%，植株長(zhǎng)勢(shì)好、葉色正常(圖1f)。

表5 不同基質(zhì)對(duì)風(fēng)柜斗草試管苗移栽的影響

圖1 風(fēng)柜斗草莖段組培各階段

4 討論

植物組培技術(shù)能有效的解決藥用植物資源短缺的問(wèn)題[7]。風(fēng)柜斗草作為福建閩南地區(qū)常用藥用植物，利用組培手段進(jìn)行繁殖可以極大的緩和市場(chǎng)的需求。本研究以MS為基本培養(yǎng)基適合各階段試驗(yàn)，MS、1/2 MS、1/3 MS用于生根試驗(yàn)差異性不顯著，與前人研究表明野牡丹科植物適用于MS培養(yǎng)基一致[6]。

6-BA在不定芽誘導(dǎo)和增殖中起重要作用不同培養(yǎng)階段濃度不同，本研究誘導(dǎo)階段最適合濃度為2 mg/L,高于這個(gè)濃度時(shí)產(chǎn)生玻璃化，與高濃度細(xì)胞分裂素會(huì)增加黃花倒水蓮玻璃化苗一致[8]，同時(shí)附加少量NAA能有效提高誘導(dǎo)率。在增殖階段6-BA最適濃度為1.5 mg/L，濃度越高增殖系數(shù)反而降低，且易產(chǎn)生畸形芽，與樟樹(shù)莖段叢生芽增殖試驗(yàn)結(jié)論一致[9].分裂素與生長(zhǎng)素配比協(xié)調(diào)能提高叢生芽增殖系數(shù)，并提高芽苗質(zhì)量[10]，本研究中1.5 mg/L 6-BA與0.1 mg/L NAA配比處理的叢生芽增殖系數(shù)極顯著的高于未添加NAA處理，且芽苗生長(zhǎng)良好；NAA濃度提高時(shí)，增殖系數(shù)和不定芽質(zhì)量均下降。

風(fēng)柜斗草與同科其他植物一樣易生根，但在添加生長(zhǎng)素處理中，根的數(shù)量、長(zhǎng)度和質(zhì)量有明顯的提高，本研究各處理生根率都在100%,添加0.2 mg/L IBA與0.1 mg/L NAA激素培養(yǎng)基中根的數(shù)量、長(zhǎng)度和根質(zhì)量都顯著高于其他處理，但濃度過(guò)高將影響根的生長(zhǎng)、產(chǎn)生愈傷和降低根的質(zhì)量，這與大麗花組培苗快繁生根試驗(yàn)結(jié)論一致[11]。不同移栽基質(zhì)對(duì)風(fēng)柜斗草移栽成活率和植株生長(zhǎng)有顯著影響。研究表明營(yíng)養(yǎng)土中添加適當(dāng)比例的黃泥土有助于植株生長(zhǎng)，本研究得出最適宜基質(zhì)為營(yíng)養(yǎng)土∶黃泥土∶珍珠巖(3∶1∶1)，移栽成活率最高，植株長(zhǎng)勢(shì)好。但過(guò)高比例影響植株生長(zhǎng)，這與黃泥土的透氣性差、易板結(jié)等性質(zhì)有關(guān)，與黃花倒水蓮移栽試驗(yàn)結(jié)論一致[8]。

因此以莖段為外植體，通過(guò)誘導(dǎo)獲得無(wú)菌苗、不定芽增殖、生根和煉苗移栽等階段建立風(fēng)柜斗草組培快繁體系，為實(shí)現(xiàn)工廠化育苗提供技術(shù)保障。