張巖松，黃皓婷，韓瑩琰，郝敬虹，秦曉曉，劉超杰，范雙喜

(北京農(nóng)學(xué)院 植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京102206)

高溫脅迫可以使葉綠體結(jié)構(gòu)受到破壞，葉綠素合成受到影響，進(jìn)而引發(fā)葉綠體光系統(tǒng)Ⅱ(PS Ⅱ)受損，導(dǎo)致光合系統(tǒng)活性降低[1]。高溫脅迫時(shí)，植物體內(nèi)活性氧產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)平衡被打破，使植物生理生化代謝發(fā)生紊亂，導(dǎo)致植物組織出現(xiàn)膜脂過(guò)氧化現(xiàn)象[2]。作為膜脂過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，丙二醛的堆積會(huì)對(duì)植物細(xì)胞膜造成進(jìn)一步的損傷[3]。在進(jìn)化過(guò)程中，植物逐漸形成了自我保護(hù)機(jī)制。由過(guò)氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)構(gòu)成的抗氧化酶系統(tǒng)，能夠清除逆境中植物體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧，減輕膜脂過(guò)氧化對(duì)植株造成的傷害，對(duì)維持植物正常代謝具有重要作用[4]。

硒是人類生長(zhǎng)發(fā)育必需的微量元素。硒在全球分布廣泛但又極不均勻，全世界有2/3的地區(qū)缺硒，其中1/3是世界公認(rèn)的嚴(yán)重缺硒地區(qū)，中國(guó)約72%的土壤存在不同程度的缺硒現(xiàn)象[5]。施用適宜濃度的硒溶液能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育，增加生物量，提高作物產(chǎn)量,但是過(guò)量的硒對(duì)植株生長(zhǎng)具有抑制作用。噴施適量硒還可以提高植物的凈光合速率，促進(jìn)光合色素的生成[6]。外源硒還可以直接或間接的通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化酶活性來(lái)調(diào)控細(xì)胞間活性氧的清除[7]?？梢?jiàn)施用適宜濃度的硒可以緩解生物及非生物脅迫對(duì)植物的傷害。

生菜(LactucasativaL.)，屬于半耐寒性蔬菜，喜冷涼環(huán)境，可在15～20 ℃下正常生長(zhǎng)。可生食，脆嫩爽口，略甜，營(yíng)養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。目前，硒對(duì)重金屬脅迫[8]和干旱脅迫[9]等植物非生物脅迫的耐性研究比較深入，而硒對(duì)高溫脅迫下生菜生長(zhǎng)和抗氧化酶的影響，鮮有報(bào)道。

本試驗(yàn)通過(guò)探究不同濃度硒對(duì)高溫脅迫下生菜生長(zhǎng)和抗氧化酶的影響，篩選出緩解生菜高溫脅迫的適合硒濃度，為研究硒緩解生菜高溫脅迫的機(jī)制提供理論依據(jù)，以促進(jìn)水培生菜的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，節(jié)約資源，降低生產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)和成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以北京農(nóng)學(xué)院生菜課題組提供的不耐熱品種‘北散生3號(hào)’生菜作為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

選取顆粒飽滿、無(wú)病害且大小均勻的200粒種子進(jìn)行試驗(yàn)。將種子均勻放置在鋪有定性濾紙并用去離子水浸濕的培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿移入光照培養(yǎng)箱中催芽，設(shè)置光照強(qiáng)度為200 μmol·m-2·s-1，光周期為12 h/12 h，晝夜溫度為20 ℃/15 ℃，相對(duì)濕度為70%～75%，每2 d向其中補(bǔ)充適量去離子水。種子萌發(fā)后，將其播種于穴盤中，繼續(xù)放置在上述培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待幼苗長(zhǎng)至3葉1心時(shí)，挑選生長(zhǎng)狀況一致的植株，將其分別置于5個(gè)水培槽中，每個(gè)水培槽設(shè)置11株幼苗，并轉(zhuǎn)移到溫室進(jìn)行培養(yǎng)，設(shè)置光照強(qiáng)度為200 μmol·m-2·s-1，光周期為12 h/12 h，晝夜溫度為20 ℃/15 ℃，相對(duì)濕度為70%～75%。待幼苗長(zhǎng)到6葉1心時(shí)，將其移入光照強(qiáng)度為200 μmol·m-2·s-1，光周期為12 h/12 h，晝夜溫度為30 ℃/25 ℃，相對(duì)濕度為70%～75%的溫室中進(jìn)行高溫處理。每天17:00使用小型噴霧器噴施去離子水和不同濃度硒(Na2SeO3)溶液。佩戴口罩及手套進(jìn)行噴施，要求在葉面和葉背均勻噴施，以噴施液體附著在葉面，全部潤(rùn)濕但不滴落為準(zhǔn)[10]。試驗(yàn)進(jìn)行至第9天時(shí)取樣，并測(cè)定相關(guān)的生長(zhǎng)指標(biāo)。采收后，將各處理的樣品裝袋、標(biāo)記，及時(shí)保存在-80 ℃冰箱內(nèi)測(cè)定生理指標(biāo)。

本試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)處理：CK，葉面噴施去離子水；T1,葉面噴施0.5 mg/L硒溶液；T2,葉面噴施1.0 mg/L硒溶液；T3，葉面噴施1.5 mg/L硒溶液；T4, 葉面噴施2.0 mg/L硒溶液。每個(gè)處理11株，重復(fù)3次。

1.3 測(cè)定方法

使用直尺測(cè)量各處理生菜植株的株高、根長(zhǎng)、真葉數(shù)、最大葉片長(zhǎng)度和最大葉片寬度。

使用吸水紙將植株表面的水分吸干，分為地上部和地下部稱量其鮮質(zhì)量。再將其放置于電熱鼓風(fēng)干燥箱(BGZ-140型，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司)中，先于105 ℃殺青30 min,然后將溫度調(diào)至80 ℃烘至恒質(zhì)量后，分別稱量樣品地上部和地下部干質(zhì)量，采用全株鮮質(zhì)量和干質(zhì)量計(jì)算含水量。

使用分光光度法[11]測(cè)定葉綠素含量，采用硫代巴比妥酸法[12]測(cè)定丙二醛(MDA)含量，采用過(guò)氧化氫紫外分光光度法[13]測(cè)定過(guò)氧化氫酶(CAT)含量，使用愈創(chuàng)木酚法[13]測(cè)定過(guò)氧化物酶(POD)含量，采用氮藍(lán)四唑光還原法[13]測(cè)定過(guò)氧化物歧化酶(SOD)含量。

數(shù)據(jù)處理和顯著性差異分析采用Excel 2016和SPSS Stastics 17(IBM，美國(guó))等軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度硒對(duì)高溫脅迫下生菜幼苗生長(zhǎng)的影響

如表1所示，處理T3植株的株高是對(duì)照的1.57倍。植株的根長(zhǎng)、地上部及地下部鮮質(zhì)量、地上部及地下部干質(zhì)量、真葉數(shù)、最大葉片寬度在處理T2達(dá)到峰值，分別是對(duì)照的1.46倍、2.01倍、4.17倍、1.70倍、3.00倍、1.22倍和1.22倍，但處理T3、T4略有降低。在噴施硒后，植株含水量有所提高，但噴施硒的濃度對(duì)其影響不顯著。在外源硒處理下，植株的最大葉片長(zhǎng)度與對(duì)照差異不顯著。由此可知，外源噴施硒濃度為1.0 mg/L時(shí)，能顯著緩解高溫脅迫對(duì)水培生菜生長(zhǎng)的影響。

2.2 不同濃度硒對(duì)高溫脅迫下生菜幼苗葉綠素含量的影響

如圖1所示，處理T1和T2使葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量顯著提高。處理T2的葉綠素a、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量為對(duì)照的1.20倍、1.20倍和1.21倍，且與其他處理相比葉綠素b含量達(dá)到最高，為對(duì)照的1.19倍。葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量在處理T3和T4顯著低于對(duì)照，處理T3最低，分別為對(duì)照的78.2%、72.5%、76.9%和83.3%。由此可知，噴施1.0 mg/L的硒溶液能夠顯著影響高溫脅迫下生菜幼苗葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量。

2.3 不同濃度硒對(duì)高溫脅迫下生菜丙二醛含量的影響

如圖2所示，植株丙二醛含量隨著噴施硒濃度的增加，呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)。對(duì)照的丙二醛含量最高，處理T2最低，為對(duì)照的65.9%，且處理T1與T2差異不顯著。處理T3、T4丙二醛含量有所上升，但仍低于對(duì)照。以上結(jié)果表明，噴施外源硒能夠顯著降低水培生菜中丙二醛的含量，并且在噴施硒肥濃度為1.0 mg/L時(shí)，生菜葉片中丙二醛含量最低。

2.4 不同濃度硒對(duì)高溫脅迫下生菜抗氧化酶活性

由圖3可知,噴施硒肥處理后，葉片中SOD、POD、CAT的活性都有所升高，并隨著噴施硒濃度的增加，都呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。SOD和CAT的活性在處理T3達(dá)到最高，分別是對(duì)照的1.31倍和1.29倍，并且處理T2也使兩者的活性有所增加。POD的活性在處理T2達(dá)到最高，為對(duì)照的1.54倍。SOD、POD、CAT的活性在處理T4相對(duì)于其他處理都有所下降，分別為其最高值的87.46%、77.81%和89.01%。以上結(jié)果表明，在噴施1.0 mg/L硒溶液時(shí)對(duì)高溫脅迫下葉片抗氧化酶活性的緩解作用顯著。

3 討 論

高溫脅迫會(huì)傷害植物體營(yíng)養(yǎng)器官和生殖器官的組織及細(xì)胞結(jié)構(gòu)[14]。低濃度的硒可以加強(qiáng)植物根細(xì)胞分生組織的減數(shù)分裂，使根長(zhǎng)增加[15]。前人研究表明，外源施用1.0 mg/kg亞硒酸鹽能夠顯著提高鎘污染土壤中小白菜的生物量[16]。低濃度的外源硒對(duì)白術(shù)的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，而高濃度的硒具有抑制作用[17]。本研究中隨著噴施硒濃度的提高，樣品的株高、根長(zhǎng)、地上部及地下部鮮質(zhì)量、地上部及地下部干質(zhì)量、真葉數(shù)和最大葉片寬度都呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)與此相一致，且以施用硒濃度為1.0 mg/L時(shí)，效果最為顯著。

光合作用是對(duì)溫度變化最敏感的生理過(guò)程[18]，高溫脅迫抑制葉綠素的合成，導(dǎo)致葉綠素含量降低[1]。在高等植物中，光合色素主要包括葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素。有研究表明，當(dāng)根部施硒濃度低于100 mg/L時(shí)，隨著施硒濃度的增加，太陽(yáng)花葉片中葉綠素含量逐漸升高[19]。但是高濃度的硒會(huì)導(dǎo)致葉綠素降解[5]。本研究中葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量隨著外源硒噴施濃度的增加，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)與此一致。

丙二醛(MDA)是常用的膜脂過(guò)氧化指標(biāo)。前人研究表明，施用1.0 mg/L亞硒酸鈉溶液能夠顯著降低鹽脅迫下小白菜幼苗的丙二醛含量[20]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)施用1.0 mg/L的硒溶液能夠清除高溫脅迫下水培生菜中過(guò)量的活性氧使丙二醛的含量降低，與前人的研究一致。

活性氧的清除，細(xì)胞正常代謝的維持和植物抗逆性的提高離不開SOD、POD及CAT構(gòu)成的抗氧化酶系統(tǒng)[4]。添加不同濃度亞硒酸鈉顯著提高了谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX)和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)的活性，顯著降低了MDA和H2O2含量，表明亞硒酸鈉可以提高玉米幼苗的抗氧化能力,從而增強(qiáng)玉米幼苗對(duì)鎘脅迫的耐受性[21]。在濃度為0.1mg/L時(shí)，外源硒通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化能力,維持細(xì)胞膜穩(wěn)定，來(lái)有效緩解鎘脅迫對(duì)黑麥草的毒害現(xiàn)象[22]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)在噴施1.0 mg/L的硒溶液時(shí)，高溫脅迫下葉片抗氧化酶(SOD、POD、CAT)的活性顯著提高。

綜上所述，外源噴施硒肥能夠有效緩解高溫脅迫對(duì)水培生菜生長(zhǎng)的影響，促進(jìn)葉片產(chǎn)生葉綠素，保證葉片光系統(tǒng)的正常運(yùn)行，加快去除植株體內(nèi)的活性氧，降低葉片膜脂過(guò)氧化程度，減少高溫脅迫對(duì)植株的氧化損傷。當(dāng)施用硒濃度為1.0 mg/L時(shí)，效果最為顯著。