黃 榮， 姚 博， 王曉芬， 德吉卓瑪， 吳菁菁， 張振粉

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院， 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心， 甘肅 蘭州 730070)

植物內(nèi)生細(xì)菌是指在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官的細(xì)菌[1]，它可以通過(guò)維管束系統(tǒng)進(jìn)入種子，也可以通過(guò)禾谷類花粉通道、成熟種子的種臍、種皮的裂縫開(kāi)口、種皮背部索狀細(xì)胞和種脊進(jìn)入種子，成為種子內(nèi)生細(xì)菌，即植物種帶細(xì)菌[2-3]。換言之，種帶細(xì)菌是下一代新植株內(nèi)生細(xì)菌的重要來(lái)源。其中植物根系作為植物獲取養(yǎng)分、水分和礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要器官，定殖著大量的細(xì)菌，是植物分解轉(zhuǎn)化污染物和抵御病原菌入侵的重要場(chǎng)所，為宿主提供了豐富的生態(tài)位，所以植物根系內(nèi)生細(xì)菌是植物內(nèi)生細(xì)菌的重要來(lái)源。植物根系內(nèi)生細(xì)菌在植物體內(nèi)與宿主協(xié)同進(jìn)化發(fā)揮各種生物學(xué)作用，如促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)[4-5]、防控植物病蟲害[6-8]和提高植物抗逆性[9]等。目前關(guān)于植物根系內(nèi)生細(xì)菌的研究多集中在其次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物功能測(cè)定及農(nóng)業(yè)、生物防治和醫(yī)藥領(lǐng)域等方面的應(yīng)用[10]。

一般來(lái)說(shuō)，植物內(nèi)生細(xì)菌中絕大部分屬于革蘭氏陰性細(xì)菌(Gram negative bacteria，G-)[11-13]。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)作為革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞外膜的主要成分和次生代謝產(chǎn)物之一，覆蓋40%左右的細(xì)菌細(xì)胞表面，對(duì)植物、動(dòng)物和多種真核生物體有極強(qiáng)的免疫刺激的作用[14]，可以引起植物葉綠體損傷和活性氧(Reactive oxygen species，ROS)迸發(fā)等反應(yīng)[15]，在植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控過(guò)程中起到重要作用。其次，脂多糖也是一種重要的微生物相關(guān)分子模式(Microbe-associated molecular patterns，MAMP)，植物可以通過(guò)模式識(shí)別受體(Pattern recognition receptor，PRR)感知MAMP并激發(fā)的免疫反應(yīng)，被稱為模式觸發(fā)的免疫(Pattern-triggered immunity，PTI)反應(yīng)[16]。冷靜[17]報(bào)道成團(tuán)泛菌脂多糖(Pantoeaagglomeranslipopolysaccharide，LPSp)是一種低毒性、安全性良好和純度活性高的免疫增強(qiáng)劑，在調(diào)控植物周圍環(huán)境微生物種類和組合中起著重要作用[18]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，0.267 0 EU·mL-1成團(tuán)泛菌脂多糖會(huì)促進(jìn)紫花苜蓿的生長(zhǎng)和結(jié)瘤[19]。其中根瘤菌(Rhizobium)作為紫花苜蓿共生固氮體系中一種典型的革蘭氏陰性細(xì)菌[20]，其共生體系中的細(xì)菌脂多糖是如何影響寄主紫花苜蓿根系中的根瘤菌等內(nèi)生細(xì)菌的機(jī)理仍未明確，需開(kāi)展相關(guān)研究。為此，本試驗(yàn)以‘巨能551’紫花苜蓿品種為試驗(yàn)材料，探究不同濃度成團(tuán)泛菌CQ10脂多糖(PantoeaagglomeransCQ10 Lipopolysaccharide，CQ10-LPSp)對(duì)紫花苜蓿幼苗內(nèi)生細(xì)菌多樣性及其根瘤菌的影響，其結(jié)果可為挖掘和開(kāi)發(fā)促進(jìn)根瘤菌生長(zhǎng)的外源添加脂多糖制劑提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株：紫花苜蓿種帶成團(tuán)泛菌(Pantoeaagglomerans)CQ10菌株由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院牧草病理實(shí)驗(yàn)室提供。

供試品種：紫花苜?！弈?51’(Medicagosativa‘Juneng 551’)種子由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)牧草種質(zhì)資源實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 供試培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)瓊脂/液體培養(yǎng)基(Nutrient agar，NA/NB)，配方參考《植病研究方法(第三版)》[21]。

酵母甘露醇瓊脂/液體培養(yǎng)基(Yeast mannitol agar，YMA/YMB)，配方參考劉盧生等人的[22]的方法。

1.3 紫花苜蓿種帶細(xì)菌的分離

采用常規(guī)稀釋法分離培養(yǎng)。稱取‘巨能551’紫花苜蓿種子0.25 g，先用質(zhì)量濃度75%的酒精浸泡2 min，后轉(zhuǎn)入3%的NaClO浸泡5 min，無(wú)菌水沖洗3～4次，轉(zhuǎn)至盛有10 mL無(wú)菌水的研缽研磨。靜置10 min后，將原液依次稀釋為10-4～10-1的梯度稀釋液。每個(gè)梯度稀釋液分別吸取200 μL上清液均勻涂布到NA和YMA培養(yǎng)基上，以無(wú)菌水涂布的NA和YMA培養(yǎng)基為空白對(duì)照，n=3。涂板后轉(zhuǎn)置28℃恒溫箱中培養(yǎng)3 d，通過(guò)形態(tài)觀察挑選單菌落進(jìn)行分離純化，記錄菌落數(shù)及菌落的形態(tài)特征。菌株純培養(yǎng)保存于—80℃冰箱中。

1.4 細(xì)菌的16S rDNA鑒定

細(xì)菌DNA提取使用天根生化科技(北京)有限公司TIANamp Bacteria DNA Kit細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型,目錄號(hào)DP302)，具體方法參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書。

細(xì)菌基因的擴(kuò)增，參照夏秀東的方法[23]，將擴(kuò)增產(chǎn)物送到武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 構(gòu)建根瘤菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

將測(cè)序后的根瘤菌DNA序列提交到NCBI-Blast進(jìn)行在線比對(duì)，后選用同源性最高的菌株的序列作為參比對(duì)象，運(yùn)用MEGA6.0軟件Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)，確立根瘤菌的系統(tǒng)發(fā)育地位。

1.6 CQ10-LPSp對(duì)紫花苜蓿生長(zhǎng)的影響

1.6.1CQ10-LPSp的提取 CQ10菌株復(fù)蘇后在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h并提取其脂多糖備用，提取方法參照文獻(xiàn)[19]。

1.6.2CQ10-LPSp的濃度設(shè)置 試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)濃度，即0，0.133 5，0.200 3，0.267 0，0.333 8，0.400 5 EU·mL-1。濃度按照CQ10-LPSp的活性[19]進(jìn)行配制。

1.6.3接種試驗(yàn) 向生長(zhǎng)瓶中加入200 mL蒸餾水和不同濃度(0，0.133 5，0.200 3，0.267 0，0.333 8，0.400 5 EU·mL-1)的CQ10-LPSp，高溫高壓(121℃，0.11 Mpa)滅菌21 min后待用。后挑選籽粒飽滿、無(wú)病蟲害的內(nèi)含根瘤菌紫花苜蓿品種的干凈種子600粒。將種子等距置于上述滅好菌的發(fā)芽瓶的發(fā)芽床上，每瓶25粒，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)。接入種子后將發(fā)芽瓶放置于溫度23℃、濕度45%、光照(18 Klx)18 h、黑暗6 h的生長(zhǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)，期間需觀察無(wú)菌水組和處理組種子的結(jié)瘤狀況，于第21 d取樣分離研磨紫花苜蓿根系內(nèi)生根瘤菌。

1.7 CQ10-LPSp對(duì)紫花苜蓿根系內(nèi)生根瘤菌數(shù)量的影響

以100 mLYMA固體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的脂多糖(0.133 5，0.200 3，0.267 0，0.333 8，0.400 5 EU·mL-1)CQ10-LPSp，并以空白的YMA固體培養(yǎng)基為對(duì)照。培養(yǎng)基分裝后121℃高溫滅菌后倒平板待用。后挑取根瘤菌單菌落接種到培養(yǎng)基上，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)，27℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，觀察根瘤菌的生長(zhǎng)形態(tài)。

1.8 CQ10-LPSp對(duì)紫花苜蓿根系幼苗內(nèi)生細(xì)菌多樣性的影響

超凈工作臺(tái)中分離6個(gè)不同濃度下紫花苜蓿根系的內(nèi)生細(xì)菌。分別稱取不同濃度下的幼苗根系0.1 g，消毒研磨稀釋涂板，方法與1.3相同。比較純化后的細(xì)菌分離物和‘巨能551’紫花苜蓿種帶細(xì)菌分離物的種類和數(shù)量。

1.9 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析檢驗(yàn)不同CQ10濃度對(duì)紫花苜蓿幼苗根系根瘤菌數(shù)量的影響，用Duncan法進(jìn)行多重比較，顯著性水平a為0.05；采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫花苜蓿種帶細(xì)菌多樣性

根據(jù)顏色、大小和形態(tài)等菌落形態(tài)特征的不同分類可知，從‘巨能551’紫花苜蓿品種中共得到17株細(xì)菌分離物，分別為NA培養(yǎng)基上9株，細(xì)菌的總數(shù)量約為1.38×108cfu·g-1；YMA培養(yǎng)基上8株，細(xì)菌的總數(shù)量約為1.07×107cfu·g-1，表明‘巨能551’種帶內(nèi)生細(xì)菌豐富多樣。根據(jù)其形態(tài)特征的差異，提取其DNA、擴(kuò)增16S rDNA序列，與NCBI的BLAST比對(duì)，鑒定結(jié)果如表1所示，代表菌屬在培養(yǎng)基上的形態(tài)見(jiàn)圖1。17株細(xì)菌分離物分別隸屬于歐文氏菌屬(Erwiniasp.)、腸桿菌屬(Enterobactersp.)、芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、埃希氏菌屬(Escherichiasp.)、亞特蘭大桿菌屬(Atlantibactersp.)和中華根瘤菌屬(Sinorhizobiumsp.)。其中革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌(Gram-positive bacteria，G+)有79株，革蘭氏陰性細(xì)菌179株，革蘭氏陰性細(xì)菌多于陽(yáng)性細(xì)菌，表明種子內(nèi)部分布著大量的脂多糖。

表1 ‘巨能551’紫花苜蓿種帶細(xì)菌的種群、數(shù)量、菌落特征及屬名Table1 Population,quantity,colony characteristics and generic name of bacteria in ‘Ju neng 551’ alfalfa

圖1 代表菌屬在培養(yǎng)基上的形態(tài)Fig.1 The morphology of representative bacteria on the culture medium注：Dfz15(歐文氏菌屬)；Dfz8(芽孢桿菌屬)；Dfz6(埃希氏菌屬)；Dfz3(腸桿菌屬)；Dfz9(假單胞菌屬)；Dfz16(亞特蘭大桿菌屬)Note:Dfz15(Erwinia sp.)；Dfz8(Bacillus sp)；Dfz6(Escherichia sp.)；Dfz3(Enterobacter sp.)；Dfz9(Pseudomonas sp.)；Dfz16(Atlantibacter sp.)

其中編號(hào)為Dfz17菌株的16S rDNA序列，通過(guò)MEGA6.0構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖2。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果表明，菌株Dfz17與Sinorhizobiummeliloti(FM178842.1)、Sinorhizobiummeliloti(FM178844.1)在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上聚在一起，且相似度為100%，初步將其鑒定為中華根瘤菌屬(Sinorhizobiumsp.)。

圖2 Dfz17的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of Dfz17 bacteria

2.2 CQ10-LPSp對(duì)‘巨能551’根系內(nèi)生根瘤菌的數(shù)量影響

不同CQ10-LPSp濃度下，‘巨能551’紫花苜蓿生長(zhǎng)和結(jié)瘤現(xiàn)象不同，其中僅0.267 0 EU·mL-1CQ10-LPSp下紫花苜蓿根有結(jié)瘤。研磨幼苗根系內(nèi)生細(xì)菌，結(jié)果表明隨著CQ10-LPSp濃度的增大，紫花苜蓿根系內(nèi)生根瘤菌的數(shù)量呈先上升后下降的趨勢(shì)，且在0.267 0 EU·mL-1CQ10-LPSp下達(dá)到最大；而在0.333 8 EU·mL-1CQ10-LPSp和0.400 5 EU·mL-1CQ10-LPSp下，未分離到根瘤菌(表2)。

表2 6個(gè)不同CQ10-LPSp濃度下‘巨能551’根系內(nèi)生根瘤菌的數(shù)量Table 2 The number distribution of Sinorhizobium in the root system of ‘Juneng 551’ at 6 different CQ10-LPSp concentrations

通過(guò)觀察添加不同濃度的CQ10-LPSp培養(yǎng)基上根瘤菌的生長(zhǎng)形態(tài)，發(fā)現(xiàn)添加不同濃度CQ10-LPSp對(duì)根瘤菌的生長(zhǎng)影響不同。僅添加0.267 0 EU·mL-1CQ10-LPSp的培養(yǎng)基上根瘤菌的單菌落較對(duì)照分布較多，其余濃度下均未觀察到根瘤菌的生長(zhǎng)。該結(jié)果表明0.267 0 EU·mL-1CQ10-LPSp可以促進(jìn)根瘤菌的生長(zhǎng)，且其可以提高幼苗內(nèi)生根瘤菌的數(shù)量與植物內(nèi)生細(xì)菌多樣性有關(guān)。

2.3 CQ10-LPSp對(duì)紫花苜蓿根系幼苗內(nèi)生細(xì)菌多樣性的影響

另外，分離0.267 0 EU·mL-1CQ10-LPSp處理下紫花苜蓿的根系內(nèi)生細(xì)菌，還得到了其他8株菌株，種群、數(shù)量及菌落征(表3)和菌落形態(tài)(圖3)。根系內(nèi)生細(xì)菌種類比種帶細(xì)菌少。其中，編號(hào)Rn1和Dfz13，Rn3和Dfz17，Rn4和Dfz4，Rn2和Dfz10，Rn6和Dfz5細(xì)菌種類是一樣的，且Rn1，Rn3和Rn4數(shù)量大于Dfz13，Dfz17和Dfz4，Rn2數(shù)量小于Dfz10，Rn6數(shù)量等于Dfz6；而Rn5，Rn7和Rn8菌株未在種帶細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)16S rDNA鑒定和NCBI比對(duì)，鑒定Rn5為副球菌屬(Paracoccussp.)，Rn7和Rn9為芽孢桿菌屬(Bacillussp.)，Rn6為志賀氏菌屬(Shigellasp.)。

圖3 9株細(xì)菌分離物在YMA和NA培養(yǎng)上的生長(zhǎng)形態(tài)Fig.3 Growth morphology of 9 strains of bacteria isolate on YMA and NA culture

表3 0.267 0 EU·mL-1 CQ10-LPSp下紫花苜蓿根系內(nèi)含細(xì)菌的種群、數(shù)量及菌落征Table 3 Population,quantity and colony characteristics of bacteria in the roots of 0.267 0 EU·mL-1 CQ10-LPSp alfalfa

3 討論

3.1 CQ10-LPSp對(duì)紫花苜蓿內(nèi)生細(xì)菌多樣性的影響

經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的協(xié)同進(jìn)化，內(nèi)生細(xì)菌與宿主植物之間形成了穩(wěn)定的共生體。一方面，內(nèi)生細(xì)菌能夠?yàn)橹参锾峁┥锘钚源x物(如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、礦物質(zhì)、酶和植物激素等)，并促進(jìn)這些資源的再分配，從而有助于宿主植物抵抗外界的逆境脅迫[24-25]；另一方面，宿主植物在自身生長(zhǎng)繁殖正常的情況下為內(nèi)生細(xì)菌提供了一個(gè)穩(wěn)定的生長(zhǎng)和繁殖場(chǎng)所，從而與其形成共生互利的生命體[26]。本研究采用NA和YMA培養(yǎng)基，對(duì)‘巨能551’紫花苜蓿品種內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行多樣性分析，得到17株內(nèi)生細(xì)菌，分別隸屬于歐文氏菌屬、芽孢菌屬、腸桿菌屬、假單胞菌屬、埃希氏菌屬、亞特蘭大腸桿菌屬和中華根瘤菌屬。在全程無(wú)菌條件下再用0.267 0 EU·mL-1CQ10-LPSp處理紫花苜蓿的根系，分離得到了新的兩屬細(xì)菌(副球菌屬和志賀菌屬)，但未能重復(fù)分離得到紫花苜蓿種帶的歐文氏菌屬、亞特蘭大腸桿菌屬和埃希氏菌屬，而芽孢桿菌屬等其余細(xì)菌仍然存在于在脂多糖處理后的紫花苜蓿根系中。王志偉等[1]報(bào)道種子內(nèi)微生物群不僅是種子中群落組裝的終點(diǎn)，也是新幼苗中群落組裝的起點(diǎn)。植物種子隨著儲(chǔ)藏年限的延長(zhǎng)，細(xì)菌的種群數(shù)量會(huì)相應(yīng)縮減[27]，這就說(shuō)明在存儲(chǔ)中植物種帶細(xì)菌會(huì)死亡，而革蘭氏陰性細(xì)菌死亡后將裂解出脂多糖，本試驗(yàn)證明脂多糖處理紫花苜蓿后，紫花苜蓿根系的細(xì)菌種群和種子的細(xì)菌種群表現(xiàn)出多樣性差異。這可能是脂多糖處理紫花苜蓿后根瘤菌種群數(shù)量由種帶細(xì)菌中的1.05×106cfu·g-1增加至根系中的6.98×107cfu·g-1，相應(yīng)占據(jù)了紫花苜蓿根系中更多的生態(tài)位，從而影響了部分其它細(xì)菌在紫花苜蓿根部的生長(zhǎng)。植物種子和根系中的細(xì)菌多樣性差異也可能是由于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法存在局限性，不能充分展示紫花苜蓿內(nèi)生細(xì)菌的多樣性[28]，應(yīng)進(jìn)一步利用微生物組學(xué)方法進(jìn)行研究。但至于脂多糖是如何調(diào)控植物種子中細(xì)菌菌群的多樣性進(jìn)而影響儲(chǔ)藏年限和萌發(fā)，均需進(jìn)一步的試驗(yàn)探究。

3.2 CQ10-LPSp對(duì)紫花苜蓿根系內(nèi)生根瘤菌數(shù)量的影響

大多數(shù)植物都有高功效的PAMP感知系統(tǒng)，能迅速啟動(dòng)PTI信號(hào)傳導(dǎo)，誘發(fā)免疫反應(yīng)。細(xì)菌PAMP主要有鞭毛蛋白、熱不穩(wěn)定延伸因子、脂多糖、冷激蛋白和harpin蛋白。PAMP激活的免疫反應(yīng)包括早期氫離子、鈣離子內(nèi)流和鉀離子外流，迅速激活下游的MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)ROS爆發(fā)、被侵染部位細(xì)胞壁上的胼胝體的沉積，以及免疫反應(yīng)基因表達(dá)等一系列防衛(wèi)反應(yīng)[15]。這一系列免疫反應(yīng)在調(diào)控植物周圍環(huán)境的微生物種類和組合中起著重要作用[18]，且細(xì)菌的PAMP和植物PRR的多樣化組合也是調(diào)控與不同細(xì)菌互作的一個(gè)關(guān)鍵因素[29]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度CQ10-LPSp處理‘巨能551’后紫花苜蓿的結(jié)瘤現(xiàn)象不同，對(duì)其根系內(nèi)生根瘤菌數(shù)量影響也不同。隨著CQ10-LPSp濃度的增大，內(nèi)生根瘤菌的數(shù)量先上升后下降，且在0.267 0 EU·mL-1CQ10-LPSp下達(dá)到最大，且紫花苜蓿根有結(jié)瘤。以往研究表明，革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁的成分肽聚糖能夠特異性識(shí)別含有Lysin基因序列的細(xì)胞表面受體(受體樣激酶LYKs和受體蛋白LYPs)，從而觸發(fā)宿主的先天免疫反應(yīng)[30]。脂多糖具有和肽聚糖在植物免疫調(diào)節(jié)上類似的功能[14]，是與植物受體識(shí)別后而激發(fā)的結(jié)瘤等免疫響應(yīng)有關(guān)。然而，截至目前除了擬南芥外的其它植物識(shí)別細(xì)菌脂多糖的受體尚未被鑒定[31]。一方面，紫花苜蓿根系中的根瘤菌種群數(shù)量增加是保證根系結(jié)瘤的物質(zhì)基礎(chǔ)；另一方面，根瘤菌種群數(shù)量的提升也相應(yīng)影響了植物根系周圍環(huán)境的細(xì)菌種類及數(shù)量；兩者相互制約且相互調(diào)控。CQ10-LPSp對(duì)中華根瘤菌屬在紫花苜蓿結(jié)瘤過(guò)程中的作用及其機(jī)理需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了CQ10-LPSp對(duì)紫花苜蓿細(xì)菌多樣性及其根瘤菌的影響，結(jié)果表明隨著CQ10-LPSp濃度的增大，紫花苜蓿內(nèi)生根瘤菌的數(shù)量呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，在0.267 0 EU·mL-1CQ10-LPSp下根瘤菌數(shù)量最高，為6.98×107cfu·g-1，該濃度下內(nèi)生腸桿菌屬的細(xì)菌株數(shù)增多，假單胞菌屬株數(shù)減少，整體根系內(nèi)生細(xì)菌種類較種帶可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性減少。綜上所述，CQ10-LPSp會(huì)影響幼苗內(nèi)生細(xì)菌的多樣性及數(shù)量，且能增加內(nèi)生根瘤菌的數(shù)量。