肖自添，何煥清，彭洋洋，劉 明，徐 江

（廣東省農業(yè)科學院蔬菜研究所/廣東省草菇科技創(chuàng)新中心/廣東省蔬菜新技術研究重點實驗室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】假芝〔Amauroderma rugosum（Blume &T.Nees）Torrend〕是靈芝科假芝屬真菌，因子實體損傷后會分泌血紅色物質，民間也稱之為“血芝”［1］。我國假芝屬真菌資源豐富，目前已鑒定的有22 個種，分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)，廣東、廣西、云南、福建、臺灣、貴州、香港、海南等地均有發(fā)現(xiàn)［2］。假芝被認為是《神農本草經》記載的“六芝”中的“黑芝”，具有悠久的民間藥用歷史［3］?，F(xiàn)代研究表明，假芝屬真菌具有消炎［4］、抗腫瘤［5］、免疫調節(jié)［6］、抗氧化［7］等作用，且部分活性優(yōu)于多種已被熟知的食藥用菌，極具研究開發(fā)利用價值?！厩叭搜芯窟M展】對假芝屬真菌子實體和菌絲體發(fā)酵菌液的成分分析表明，有機相提取物中的麥角甾醇、巴西紅厚殼素、6-脫氧巴西紅厚殼素、乙醇提取物等成分具有抑制腫瘤細胞生長、抑制LPS 誘導NO 產生、促進消炎因子IL-10 表達等作用［8-11］；水提物，如多糖等也具有免疫調節(jié)和抑制腫瘤細胞生長等作用，其作用機理可能是通過促進細胞凋亡而抑制腫瘤生長［12-13］。通過急性和亞慢性毒理實驗，表明皺蓋假芝多糖對動物體無明顯毒性，麥角甾醇組分對成纖細胞系（正常細胞）NIH3T3 在0～150 μmol/L 無明顯細胞毒性，表明皺蓋假芝自然提取物安全性高［14］。靈芝多糖具有“生物反應調節(jié)劑”的作用，是一種優(yōu)良的抗氧化活性物質［15］，不同靈芝品種多糖含量及其抗氧化活性各不相同［16-17］，真菌多糖的活性與多糖的相對分子質量、單糖組成、糖苷鍵類型、一級結構和高級結構等相關［18］。目前對假芝屬真菌多糖研究報道較少，潘鴻輝等［19］分離提取了皺蓋假芝（Amauroderma rude）子實體多糖F212，對其單糖組成分析表明，該糖由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖等7 種單糖組成，多糖F212 具有明顯的免疫調節(jié)活性，可以增強免疫功效。伍燕等［20］對假芝菌絲體多糖純化、結構及抗氧化活性做了相關研究，結果顯示該多糖由半乳糖、鼠李糖和甘露糖組成，其中半乳糖含量最高，抗氧化試驗表明假芝菌絲體粗多糖效果優(yōu)于精制多糖。

【本研究切入點】本課題組從廣州市白云山采集分離得到一株野生假芝（Amauroderma rugosumBYWZ），成功馴化栽培，其子實體水提液抗氧化活性比目前常規(guī)栽培的靈芝、紫芝強［21］?！緮M解決的關鍵問題】在前期研究基礎上開展馴化假芝子實體粗多糖組成、抗氧化活性等研究，以期促進假芝多糖的深入開發(fā)利用，為開發(fā)抗氧化功能產品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

馴化栽培的野生假芝（Amauroderma rugosumBYWZ）子實體，由廣東省農業(yè)科學院蔬菜研究所白云試驗基地2018 年1—6 月栽培獲得（圖1）。子實體經烘箱60 ℃烘干，干燥陰涼處存放備用。

羥基自由基試劑盒、總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；HNY-200D 恒溫搖床（天津歐諾）；SANYO MLS-3750滅菌鍋（日本）；RE-2000A 旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮）；恒溫水浴鍋HH-4（邦西儀器）；SWCJ-1CU 超凈工作臺（蘇州安泰）；全波長酶標儀Multiskan Spectrum（芬蘭Thermo Scientific）；紫外可見分光光度計Beckman Coulter DU 800（美國）；18ND 真空冷凍干燥機（寧波新芝）等。

1.2 多糖樣品制備

取假芝干品100 g，粉碎，按1 ∶20 料液比加入蒸餾水，置100 ℃水浴3 h，室溫冷卻，抽濾，濾液旋轉蒸發(fā)濃縮至適當體積，用胰蛋白酶法和Sevage 法去蛋白，透析，旋轉蒸發(fā)至適當體積，真空冷凍干燥，得假芝子實體粗多糖（圖2）。胰蛋白酶法和Sevage 法去蛋白具體步驟：

將粗多糖溶液pH 值調至8，2%濃度胰蛋白酶酶液和粗多糖溶液分別同時放入37 ℃水浴鍋中預熱10 min，再把兩者充分混合（酶液∶樣液=1 ∶10），震蕩30 min 后放入100 ℃水浴鍋中滅酶10 min，冷卻至室溫，加入1/4 體積Sevage試劑，劇烈震蕩20 min，分液漏斗分離，取上清，3 次重復，得清液。將去蛋白的多糖清液倒入透析袋中（MD5000），用夾子夾緊避免漏液，置于去離子水容器中靜置透析，每4～8 h 更換超純水一次，直至透析液清澈，約48 h。

1.3 多糖含量檢測

采用苯酚-濃硫酸法測定假芝子實體粗多糖含量。

1.4 抗氧化活性測定

1.4.1 子實體多糖溶液配制 稱取假芝子實體粗多糖，用蒸餾水配成0.5、07、0.9、1.0、1.5 mg/mL 不同濃度樣液，進行總抗氧化能力、羥基自由基清除率測定，3 次重復。

1.4.2 總抗氧化能力（T-AOC）測定 ABTS 在適當?shù)难趸瘎┳饔孟卵趸删G色的ABTS自由基，在抗氧化物存在時，ABTS自由基的產生會被抑制，在405 nm 或734 nm 測定ABTS 自由基的吸光度即可計算出樣品的總抗氧化能力。Trolox 是一種Ve 類似物，具有抗氧化能力，用作其他抗氧化物總抗氧化能力的參考。具體操作依照試劑盒具體要求進行。

ABTS自由基清除率計算公式如下：

清除率（%）=（A0-A）/A0×100

式中，A0為ABTS自由基溶液的吸光度，A 為加藥液后的吸光度。

1.4.3 羥基自由基（OH·-）清除率測定 具體操作依照試劑盒具體要求進行。按照試劑盒步驟配制好試劑，應用液先在37 ℃水浴中預熱3 min，然后分別在空白管、標準管、對照管、測定管添加試劑，底物應用液、樣本、試劑三應用液、混勻，37 ℃反應1 min，立即加入顯色劑終止反應，混勻，室溫放置20 min 后550 nm 測定吸光值。

羥基自由基清除率計算公式如下：

清除率（%）=（對照OD 值-測定OD 值）/對照OD 值×100

1.5 假芝子實體粗多糖對巨噬細胞RAW264.7 增殖的影響測定

試驗委托廣州市欣源生物科技有限公司完成，RAW264.7 小鼠單核巨噬細胞白血病細胞購自廣州速業(yè)生物科技有限公司，采用MTS 法檢測細胞增殖。試驗設5 個不同濃度處理，分別為0、25、50、100、200 μg/mL 假芝子實體粗多糖，3次重復。

1.6 多糖單糖組分及蛋白質含量測定

試驗委托北京中科光析化工技術研究所（食品實驗室）完成，假芝子實體粗多糖分子量（GPC凝膠滲透色譜）、蛋白質（凱氏定氮）、氨基酸含量（HPLC）、單糖組成（HPLC）等。

2 結果與分析

2.1 假芝子實體粗多糖總抗氧化能力

ABTS 自由基清除率用于評價抗氧化能力大小，清除率越大表明該物質抗氧化能力越強。假芝子實體粗多糖總抗氧化活性（ABTS 法）如圖3 所示。隨著假芝子實體提取的粗多糖質量濃度增大，ABTS 自由基清除率升高，清除率與質量濃度呈量效關系；當濃度為0.7 mg/mL 時，清除率超過50%，當濃度為1.5 mg/mL 時清除率達83.95%，與1.0 mg/mLTrolox 標準物清除率（83.79%）相當（圖4）。假芝子實體粗多糖ABTS 自由基清除率EC50值為0.74 mg/mL，Trolox標準物EC50為0.62 mg/mL，表明假芝子實體粗多糖總抗氧化活性較好。

2.2 假芝子實體粗多糖羥基自由基清除能力

羥基自由基活性強、毒性大，可以與活細胞中任何分子發(fā)生反應造成損害，且反應速度極快，假芝子實體提取的粗多糖羥基自由基清除能力如圖5 所示。隨著粗多糖質量濃度增大，羥基自由基清除率逐漸增高，清除效果與質量濃度呈正相關；當濃度為0.5 mg/mL 時，清除率為58.39%，優(yōu)于0.03%H2O2標準物清除率（46.8%），當濃度為1.5 mg/mL 時清除率達90.26%，表明假芝子實體粗多糖羥基自由基清除能力較好。

2.3 假芝子實體粗多糖對巨噬細胞RAW264.7 增殖的影響

假芝子實體粗多糖對巨噬細胞RAW264.7 增殖的影響見圖6。在25～200 μg/mL 范圍內，假芝子實體粗多糖能夠顯著促進RAW264.7 巨噬細胞的增殖，增殖能力隨多糖濃度增大呈先升高后降低趨勢，多糖濃度為50 μg/mL 時促進細胞增殖能力最強（圖6），與其他濃度沒有顯著差異，但均高于沒有添加多糖的，表明假芝多糖具有潛在的免疫調節(jié)能力。

2.4 假芝子實體粗多糖的單糖組分及含量

通過苯酚-硫酸法測得假芝子實體粗多糖含量為65.45%。由于粗多糖的單糖組成影響多糖的抗氧化活性，經HPLC 測定，假芝子實體粗多糖是由多種單糖組成的雜多糖（圖7），由半乳糖、葡萄糖、甘露糖等10 種單糖組成，沒有檢測到果糖，其中半乳糖含量最高、達1.995%，其次是葡萄糖（1.612%）、甘露糖（1.259%），3 種單糖含量占總糖含量的67.87%，半乳糖醛酸（0.037%）、葡萄糖醛酸（0.074%）和木糖（0.13%）含量較低，巖藻糖（0.686%）、核糖（0.525%）、阿拉伯糖（0.474%）和鼠李糖（0.378%）含量居中。含量較高的半乳糖、甘露糖及葡萄糖可能是假芝子實體多糖具有較好抗氧化功效的原因之一。

2.5 假芝子實體粗多糖的蛋白質含量及氨基酸組成分析

由表1 可知，假芝子實體粗多糖蛋白質含量為16.99%，含有17 種氨基酸，總氨基酸含量為7.48%，其中必需氨基酸含量占總氨基酸的28%，天冬氨酸和谷氨酸含量最高，分別為1.17%、1.11%，二者占氨基酸總量30.48%；其次為絲氨酸、丙氨酸、脯氨酸，含量分別為0.79%、0.73%和0.73%，三者占30.11%；半胱氨酸和蛋氨酸含量最低，分別僅為0.02%和0.05%。天冬氨酸和谷氨酸被稱為鮮味氨基酸，絲氨酸、丙氨酸、脯氨酸等被稱為甜味氨基酸，兩種氨基酸占比超過60%，使得假芝子實體粗多糖味道香濃，用作產品開發(fā)有一定優(yōu)勢。

表1 假芝子實體粗多糖的蛋白質含量及氨基酸種類Table 1 Protein content and amino acid composition of crude polysaccharide from fruit body of Amauroderma rugosum

2.6 假芝子實體粗多糖的分子量

一般認為分子量大小與多糖活性有關，大分子量多糖及其側鏈的連接方式對多糖的生物活性有重要影響，可確保高級結構的空間構象。分子量分布指數(shù)用來表示分子量分布程度的指數(shù)，數(shù)值比1 越大其分子量分布越寬，多分散性程度越大。多糖分子量分布系數(shù)α（Mw/Mn）越接近1，說明該多糖分子量分布較均一。假芝粗多糖數(shù)均分子量Wn 為28.239 ku，重均分子量Mw為57.502 ku，平均分子量Mp 為56.038 ku，更高的平均分子量Mz 為95.331ku，Mz+1 為130.852 ku，分子量分布Pd 為2.03629，分子量分布系數(shù)α（Mw/Mn）為2.036，表明假芝粗多糖分子鏈長短分布不均，也可能純度不夠，需要進一步純化分析。

3 討論

多糖的抗氧化及免疫活性與其單糖組成、分子量、空間結構等關系密切。伍燕等［20］對假芝菌絲體精制多糖進行分析，結果顯示該多糖由半乳糖、鼠李糖和甘露糖組成，其中半乳糖含量最高，抗氧化試驗表明假芝菌絲體粗多糖效果優(yōu)于精制多糖。潘鴻輝等［19］對皺蓋假芝子實體多糖F212 單糖組成分析表明，該糖主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、核糖等7 種單糖組成，多糖F212 具有明顯的免疫調節(jié)活性。而本試驗子實體粗多糖組分不僅含有菌絲體測得的3 種單糖，還檢測出其他7 種，單糖組分中半乳糖、葡萄糖、甘露糖含量較高，未檢測出果糖，對ABTS 自由基、羥基自由基清除率高，一定范圍內能夠顯著促進RAW264.7 巨噬細胞的增殖。本試驗中，假芝子實體多糖比菌絲體多糖單糖組分更豐富，抗氧化效果明顯；與皺蓋假芝子實體多糖相比，多檢測出半乳糖醛酸、巖藻糖、葡萄糖醛酸等3 種單糖組分。戚夢等［22］對大革耳子實體多糖組分分析顯示，葡萄糖、甘露糖和木糖含量較高，對羥基自由基等清除能力較強。繡球菌子實體多糖則由葡萄糖、甘露糖、半乳糖木糖、果糖構成，分子量在215～393 ku，具有一定的還原能力和清除DPPH 自由基的能力，能夠促進巨噬細胞RAW264.7 的增殖［23］。假芝子實體多糖相比菌絲體多糖組分更豐富，半乳糖、葡萄糖、甘露糖等含量較高，為重要單糖組分，可能與抗氧化及免疫活性有關。

糖蛋白（肽）復合物的功能與其結構特征密切相關。其中，相對分子質量、多糖和蛋白含量、單糖和氨基酸組成、糖基化形式等對其體內外抗腫瘤、免疫調節(jié)和細胞凝集等活性影響顯著［24］。靈芝多糖也常常含有蛋白或多肽片段，形成糖蛋白或者蛋白聚糖結構，其分子質量、多糖和蛋白質含量、單糖和氨基酸組成、糖基化形式等對其生物活性有顯著影響［24］。本試驗假芝子實體多糖含蛋白質16.99%，由17 種氨基酸組成，多糖數(shù)均分子量Mn 為28.239 ku，重均分子量Mw 為57.502 ku，與報道的大多數(shù)靈芝多糖分子質量Mw 數(shù)量級相當，在104u 左右，水溶性較好，自由基清除效果較好。黃越等［25］也發(fā)現(xiàn)猴頭菇粗多糖組分中含有的蛋白質是含有糖鏈和蛋白質殘留的糖蛋白，具有較好的清除自由基能力。靈芝多糖也常含有蛋白或多肽片段，形成糖蛋白或者蛋白聚糖結構，其分子量、多糖和蛋白質含量、單糖和氨基酸組成、糖基化形式等對其生物活性有顯著影響［24-27］。一般認為分子量大小與多糖活性有關，大分子量多糖及其側鏈的連接方式對多糖的生物活性有重要影響，可確保高級結構的空間構象。多糖分子量分布系數(shù)Mw/Mn 越接近1，說明該多糖分子量分布較均一，純度較高［28-29］。

4 結論

本研究首次對人工馴化栽培的假芝子實體多糖進行分析，假芝子實體粗多糖ARP 為暗棕色粉末，對ABTS 自由基、羥基自由基清除率高，抗氧化效果好，在一定范圍內能夠促進RAW264.7 巨噬細胞的增殖。假芝子實體多糖是以半乳糖、葡萄糖、甘露糖等為主的蛋白質雜多糖，多糖數(shù)均分子量Mn 為28.239 ku，重均分子量Mw 為57.502 ku，分子量分布系數(shù)（Mw/Mn）為2.036。粗多糖蛋白質含量為16.99%，含有17 種氨基酸，其中必需氨基酸占總氨基酸的28%，天冬氨酸和谷氨酸含量最高，使得假芝子實體粗多糖香味濃郁。