焦 赫，李新舉

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，山東 泰安 271018； 2.土肥資源高效利用國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271018)

高潛水位煤礦區(qū)煤炭開(kāi)采常造成嚴(yán)重的地面沉降，多年來(lái)一直采用回填復(fù)墾技術(shù)來(lái)減輕沉降影響[1-2]。煤矸石因?yàn)閮r(jià)格低廉且長(zhǎng)期堆放會(huì)對(duì)地表結(jié)構(gòu)和生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重破壞，而被廣泛用作礦區(qū)沉陷土地充填材料[3-4]。然而煤矸石作為固體廢棄物，養(yǎng)分含量低，且含有較多重金屬元素，其充填后的耕地質(zhì)量較低，易造成嚴(yán)重的土壤、水和空氣污染等問(wèn)題[5]。因此，煤矸石充填復(fù)墾地土壤質(zhì)量的研究是國(guó)內(nèi)外相關(guān)專家關(guān)注的焦點(diǎn)[6-7]。目前，對(duì)采煤塌陷地煤矸石充填復(fù)墾地的土壤質(zhì)量研究主要集中于植物保護(hù)、重金屬污染、土壤酶活性等方面[8-10]，在煤矸石充填復(fù)墾對(duì)土壤微生物生態(tài)影響的研究較缺乏。

土壤微生物參與了土壤生態(tài)系統(tǒng)中的物質(zhì)循環(huán)、信息傳遞以及能量轉(zhuǎn)換，在養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化循環(huán)、維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性和植被演替恢復(fù)中起著決定性作用[11-14]。細(xì)菌作為土壤地下和地上系統(tǒng)交流的重要媒介，參與了土壤生態(tài)系統(tǒng)中大多數(shù)養(yǎng)分的循環(huán)轉(zhuǎn)化，是推動(dòng)植物凋落物和土壤有機(jī)質(zhì)分解的重要驅(qū)動(dòng)力[15]。其中，土壤細(xì)菌群落被認(rèn)為是生物地球化學(xué)循環(huán)、氣候調(diào)節(jié)或植物生產(chǎn)力等土壤功能的關(guān)鍵參與者[16]，對(duì)土壤物理化學(xué)性質(zhì)、植被類型和水文變化等環(huán)境因素變化敏感[17-18]。因此，土壤細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)變化常被用來(lái)反映土壤環(huán)境質(zhì)量的變化。

研究表明，土壤細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)的變化是退化土壤環(huán)境恢復(fù)效果的重要反映，包括濕地生態(tài)恢復(fù)、退化森林治理、鹽堿地修復(fù)[19-21]。此外，土壤細(xì)菌群落在衡量礦區(qū)復(fù)墾土壤質(zhì)量和生態(tài)效益方面具有重要作用。王瑾[22]研究發(fā)現(xiàn)土壤細(xì)菌群落對(duì)不同復(fù)墾時(shí)間、不同破壞程度、不同復(fù)墾區(qū)域的采煤沉陷復(fù)墾土壤響應(yīng)不盡相同。KNELLER等[23]通過(guò)研究采礦區(qū)不同復(fù)墾技術(shù)下土壤細(xì)菌等微生物對(duì)于土壤外源有機(jī)質(zhì)添加后的反映，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌群落在評(píng)估礦山土壤質(zhì)量恢復(fù)效果的過(guò)程中起著關(guān)鍵指示作用。郭曉明等[24]研究礦區(qū)沉陷復(fù)墾地土壤細(xì)菌數(shù)量及酶活性空間分布特征發(fā)現(xiàn)，與非沉陷地相比，沉陷區(qū)對(duì)土壤細(xì)菌群落的生長(zhǎng)存在一定抑制作用，采煤沉陷導(dǎo)致耕地土壤細(xì)菌數(shù)量空間異質(zhì)性顯著增加。李兆龍等[25]在銅尾礦應(yīng)用土壤細(xì)菌解釋了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)重金屬污染的響應(yīng)，證明細(xì)菌等微生物對(duì)礦區(qū)退化土壤進(jìn)行生態(tài)修復(fù)評(píng)估的重要價(jià)值。LI等[26]研究了黃土高原西北部露天煤礦復(fù)墾區(qū)土壤微生物豐度和多樣性，說(shuō)明細(xì)菌等微生物群落演替對(duì)于不同復(fù)墾方案的響應(yīng)敏感程度存在顯著差異。由此可見(jiàn)，土壤細(xì)菌及其群落在礦區(qū)采煤沉陷復(fù)墾領(lǐng)域的傳統(tǒng)研究較為廣泛。然而在高潛水位礦區(qū)，煤矸石充填復(fù)墾作為主要的復(fù)墾方式之一，目前利用現(xiàn)代高通量測(cè)序方法研究煤矸石充填后土壤細(xì)菌群落的變化是有限的。

筆者利用高通量lllumina Miseq 16S rRNA測(cè)序方法，探討了中國(guó)東部典型高潛水位礦區(qū)采煤塌陷地煤矸石充填復(fù)墾耕地不同土層深度下土壤細(xì)菌群落多樣性和結(jié)構(gòu)組成的變化，并分析了特定優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系。主要目的是確定：① 煤矸石充填復(fù)墾后土壤性質(zhì)變化；② 煤矸石充填復(fù)墾后土壤細(xì)菌群落多樣性和結(jié)構(gòu)組成的差異變化；③ 可能影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的潛在關(guān)鍵土壤特性。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于山東濟(jì)寧市東灘礦區(qū)，地理坐標(biāo)為35.41°N～116.96°E，總面積約為1 616.56 km2(圖1)。地形以平原為主，作物種類豐富，氣候?yàn)樗募痉置鞯臏貛Т箨懠撅L(fēng)性氣候，雨量集中，水熱同步。根據(jù)美國(guó)農(nóng)業(yè)部土壤質(zhì)地劃分和美國(guó)農(nóng)業(yè)部土壤系統(tǒng)分類的數(shù)據(jù)[27]，研究區(qū)域的土壤類型主要為濕潤(rùn)淋溶土。土壤質(zhì)地為砂壤土，礫石含量約7.3%。

圖1 研究區(qū)位置Fig.1 Location of study area

東灘礦區(qū)因常年煤炭開(kāi)采造成了大面積采煤塌陷地，自2001年開(kāi)始進(jìn)行塌陷地的充填復(fù)墾。該區(qū)充填復(fù)墾方式根據(jù)充填物的不同主要有煤矸石充填、粉煤灰充填和客土充填等方式。研究區(qū)主要采用的典型復(fù)墾工藝是煤矸石充填復(fù)墾。具體做法是在煤礦區(qū)的土地塌陷平穩(wěn)后，前期先進(jìn)行表土剝離，然后利用煤矸石進(jìn)行充填，最后再回填表土層的土壤。復(fù)墾規(guī)劃設(shè)計(jì)標(biāo)高為47.0 m，未復(fù)墾土地平均標(biāo)高約為39.8 m，平均充填矸石厚度約為6.2 m，矸石充填后覆土厚度在60～100 cm[28]。充填煤矸石來(lái)源于研究礦區(qū)煤矸石山和部分選煤廠矸石，煤矸石以碳酸鹽類和碳質(zhì)砂巖為主，其風(fēng)化物以礫石為主，顆粒間差異較大。由于早年復(fù)墾過(guò)程中多次受到機(jī)械壓實(shí)，土壤較為緊實(shí)。復(fù)墾后的利用方式主要為耕地、種植小麥、玉米等作物。

1.2 樣品采集

2018年8月，按照室內(nèi)設(shè)計(jì)路線，在試驗(yàn)區(qū)設(shè)置3個(gè)16 m×16 m的樣地(3個(gè)重復(fù))，在每個(gè)樣地內(nèi)，采用直徑5 cm的土壤螺旋鉆，用對(duì)角線取樣法和環(huán)刀法分3層(0～20，20～40，40～60 cm)于5個(gè)點(diǎn)均勻采樣，并以周邊正常耕地作為對(duì)照。每層土樣采集5份并均勻混合，質(zhì)量約2 kg，且每層取1 kg環(huán)刀樣，用于土壤含水量和容重的測(cè)定，所有樣品均裝入無(wú)菌保鮮袋放置鋪滿冰袋的保溫箱中，立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。除去環(huán)刀樣，將其他土樣中明顯的植物殘?jiān)⑹哟u塊去除后，按照四分法，將每層所取5份土樣均勻混合，每個(gè)樣品的一半經(jīng)風(fēng)干研磨并過(guò)2 mm的篩子，儲(chǔ)存在室溫下用于化學(xué)和物理性質(zhì)分析；另一半立即放置-80 ℃下冷凍用于微生物分析。

1.3 土樣理化性質(zhì)

把土樣置于鋁制鐵盒中，在105 ℃下烘干48 h，進(jìn)行土樣含水量(MoiC)測(cè)量。容重(BD)采用環(huán)刀法測(cè)定。采用高溫外加熱重鉻酸鉀氧化-容重法測(cè)定土壤有機(jī)碳(SOC)含量。用pH計(jì)(PHSJ-3F)和TDR(TRIME-IPH)測(cè)定土壤中的pH和電導(dǎo)率(EC)。分別用凱氏法測(cè)定堿解氮(AN)、奧爾森法測(cè)定速效磷(AP)、用鹽酸銨萃取后用原子吸收光譜法測(cè)定速效鉀(AK)。對(duì)上述指標(biāo)均進(jìn)行了3次重復(fù)測(cè)試，并根據(jù)相關(guān)性做進(jìn)一步分析。

1.4 土壤細(xì)菌16S rRNA基因序列分析

1.4.1DNA抽提和PCR擴(kuò)增

根據(jù)制造商說(shuō)明，使用E.Z.N.A.?soil試劑盒(Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.)說(shuō)明書從每種土壤樣品中稱取0.5 g進(jìn)行總DNA抽提。DNA濃度和純度利用NanoDrop 2000進(jìn)行檢測(cè)，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量；用引物515F(5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3′)對(duì)16S rRNA基因V5-V6可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性10 min，35個(gè)循環(huán)(94 ℃，變性40 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸90 s)，最后72 ℃延伸10 min (PCR采用TransGen AP221-02:TransStart Fastpfu DNA Polymerase;PCR儀:ABI GeneAmp?9700型)。擴(kuò)增體系為24 μL，18.35 μL 水，2.5 μL 10×buffer，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，各0.5 μL引物(515F和806R)，0.15 μL Taq聚合酶，1 μL所提取DNA。

1.4.2高通量測(cè)序

用2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)3個(gè)重復(fù)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)并匯集，然后利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences,Union City,CA,USA)進(jìn)行純化，并利用QuantiFluorTM-ST(Promega,USA)進(jìn)行檢測(cè)定量。最后，根據(jù)Illumina MiSeq平臺(tái)(Illumina,San Diego,USA)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 2×300的文庫(kù)。通過(guò)高通量測(cè)序?qū)λ屑兓突旌蠘颖緶y(cè)序讀數(shù)進(jìn)行分析。最終，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。

1.5 數(shù)據(jù)處理和分析

采用SPSS 22.0軟件對(duì)土壤性質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，在P<0.05時(shí)觀察到顯著性。使用R vegan軟件包計(jì)算了α多樣性指數(shù)，包括豐富度(Ace和Chao指數(shù))、微生物群落多樣性(Shannon指數(shù))。用β多樣性分析評(píng)價(jià)物種復(fù)雜度的差異，利用R vegan軟件包做基于Bray-Curtis差異矩陣的主坐標(biāo)分析(PCoA)以比較和可視化土壤樣本之間的相似性。為探討細(xì)菌群落與土壤性質(zhì)之間的關(guān)系，利用CANOCO 5.0對(duì)門水平下前10個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門與土壤理化性質(zhì)進(jìn)行典型相關(guān)分析(CCA)，以Pearson相關(guān)分析法輔助分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

所考慮的土壤理化性質(zhì)(AN，AP，AK，SOC，pH，EC，BD，MoiC)在不同處理間差異顯著(表1)。G的pH值分布在8.23～8.68，3層pH均顯著高于CK(P<0.05)，且在深度變化上呈現(xiàn)逐漸降低的變化趨勢(shì)。G的EC在不同土層深度下均大于CK，隨土層深度增加而增大。G和CK的EC在DL(Deep Layer)均高于SL(Surface Layer)和ML(Middle Layer)層。G的AN和AK變化趨勢(shì)一致，ML和DL土層質(zhì)量分?jǐn)?shù)(均值為72.85 mg/kg和75.82 mg/kg)遠(yuǎn)低于表層(120.67 mg/kg 和108.83 mg/kg)，G的AP質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨土層深度增加呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。與CK相比，G的AN質(zhì)量分?jǐn)?shù)(120.67 mg/kg)在SL層略高于CK(120.57 mg/kg)。AK，AP在不同土層深度下質(zhì)量分?jǐn)?shù)均明顯低于CK。G的SOC質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨土層深度增加呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)，在SL層與CK質(zhì)量分?jǐn)?shù)接近，但其他層遠(yuǎn)低于CK。G的BD在各層均高于CK，且ML質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于其他土層。整體上G的含水量低于CK。

表1 復(fù)墾地和對(duì)照地的土壤性質(zhì)

2.2 土壤細(xì)菌群落組成特征

從18個(gè)樣品整合的數(shù)據(jù)集中保留了1 607 790個(gè)高質(zhì)量的序列(細(xì)菌群落平均每個(gè)樣本89 322個(gè))，共檢測(cè)到11 430個(gè)OTUs，有效序列長(zhǎng)度均>200 bp。G和CK的ACE，Chao和Shannon指數(shù)在豐富度和多樣性方面存在顯著差異(表2)。所有樣本的覆蓋率都在96%以上，說(shuō)明測(cè)序讀數(shù)足以進(jìn)行分析。通過(guò)對(duì)Chao，ACE和Shannon指數(shù)在不同土層深度下的計(jì)算，結(jié)果表明，在SL層，G的豐富度和多樣性略高于CK，但在DL層，G的土壤細(xì)菌ACE指數(shù)、Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)的最低值分別為1 062，1 090 和4.38，遠(yuǎn)低于CK。 ANOVA分析表明，與CK相比，Ace，Chao，Shannon指數(shù)在不同土層深度差異顯著(P<0.05)，在DL層，G的Ace，Chao，Shannon指數(shù)分別較SL層降低74.44%～80.92%，73.81%～79.90% 和29.93%～41.00%。因此，說(shuō)明整體上煤矸石充填后的耕地的細(xì)菌群落多樣性和豐富度低于CK，且與土層深度呈顯著負(fù)相關(guān)。PCoA發(fā)現(xiàn)，G和CK在不同土層深度下土壤細(xì)菌群落組成存在顯著差異(圖2)。

表2 不同處理下觀測(cè)到的操作分類單元、覆蓋率、豐富度和多樣性的估計(jì)值

圖2 主坐標(biāo)分析Fig.2 Principal coordinates analysis

在門的水平上，樣品的總體細(xì)菌群落組成相似，但觀察到一些樣品的不同比例，如圖3所示，圖3中，不同小寫字母為處理間差異顯著(P<0.05)。在所有樣品中，變形菌門是最豐富的種類，平均相對(duì)豐度為32.43%。放線菌門是第2豐富的門，平均相對(duì)豐度為17.60%。酸桿菌門的平均相對(duì)豐度為14.46%。其他優(yōu)勢(shì)菌門平均相對(duì)豐度值按降序排列依次為：綠彎菌門(5.90%)、擬桿菌門(4.75%)、芽單胞菌門(4.53%)、厚壁菌門(3.39%)、浮霉菌門(2.77%)、羅卡氏菌門(2.68%)、疣微菌門(1.49%)、球狀細(xì)菌(1.30%)。與CK相比，G的變形菌門和酸桿菌門平均相對(duì)豐度值隨土層深度增加呈下降趨勢(shì)，變形菌門相對(duì)豐度下降了14.13%～24.25%，酸桿菌門相對(duì)豐度下降了91.16%～97.41%，而放線菌門呈明顯上升趨勢(shì)，相對(duì)豐度上升了113.85%～167.17%。優(yōu)勢(shì)菌門相對(duì)豐度在CK各土層中變化沒(méi)有明顯規(guī)律。另外，與自身相比，G的優(yōu)勢(shì)菌門在DL層相對(duì)豐度遠(yuǎn)低于其他土層。

圖3 細(xì)菌門的相對(duì)豐度Fig.3 Relative abundance of bacterial phyla

2.3 土壤理化性質(zhì)與土壤細(xì)菌群落的相關(guān)性

采用CCA方法分別研究了G和CK土壤細(xì)菌群落(前10個(gè)優(yōu)勢(shì)門的相對(duì)豐度)與土壤理化性質(zhì)(AN，AP，AK，SOC，pH，EC，BD，MoiC)之間的關(guān)系(圖4)。研究發(fā)現(xiàn)，該區(qū)土壤細(xì)菌群落的總體結(jié)構(gòu)與pH，MoiC，SOC，AP，AK顯著相關(guān)。另外，筆者還計(jì)算了G和CK前10個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門與土壤理化性質(zhì)之間的皮爾遜系數(shù)(Pearson)見(jiàn)表3，4。研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)豐度較高的優(yōu)勢(shì)菌群(變形菌門、放線菌門和酸桿菌門)僅與土壤某些理化性質(zhì)顯著相關(guān)。在G中，MoiC與變形菌門、酸桿菌門、綠彎菌門等優(yōu)勢(shì)菌門相對(duì)豐度均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。pH與擬桿菌門的相對(duì)豐度呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與芽單胞菌門呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。在CK中，相對(duì)豐度較高的前3類優(yōu)勢(shì)菌僅有變形菌門相對(duì)豐度與AP呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。此外，放線菌門、酸桿菌門、綠彎菌門、厚壁菌門與大多數(shù)土壤理化性質(zhì)無(wú)顯著相關(guān)。

表3 煤矸石充填復(fù)墾地土壤細(xì)菌群落與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)系數(shù)

圖4 典型相關(guān)分析Fig.4 Canonical correspondence analysis

3 討 論

3.1 土壤理化性質(zhì)變化

G與CK存在顯著差異，不同土層深度下土壤理化性質(zhì)變化趨勢(shì)差異很大。G的AN，AP，AK，SOC在SL層含量高于其他土層，這可能與人工施肥、表土回填有關(guān)[29-30]。但從ML層開(kāi)始，特別是AP，SOC含量隨土層深度增加呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)。這是由于煤矸石養(yǎng)分含量低，充填效果差，導(dǎo)致土壤養(yǎng)分下滲速率變低[31-32]。與CK相比，G的EC在不同土層深度下均大于對(duì)照地，且隨土層深度增加而增大，這也與煤矸石充填有關(guān)，由于高地下潛水位從底部煤矸石充填區(qū)帶來(lái)可溶性物質(zhì)，并逐年隨水分蒸發(fā)向上層遷移，導(dǎo)致與煤矸石接觸層的EC明顯高于表層，與前人研究結(jié)果[28]類似。研究區(qū)復(fù)墾地由于早年受機(jī)械壓實(shí)影響嚴(yán)重，較多次數(shù)的碾壓破壞了土壤結(jié)構(gòu)[33]，使得土壤緊實(shí)，容重增大，深層次土壤群落恢復(fù)速率慢，從而影響土壤養(yǎng)分的充分轉(zhuǎn)化，同時(shí)也導(dǎo)致復(fù)墾地的MoiC低于普通耕地[34-35]。這些發(fā)現(xiàn)表明，充填復(fù)墾質(zhì)量影響土壤養(yǎng)分質(zhì)量的提高，通過(guò)提高煤矸石充填技術(shù)和加強(qiáng)土地耕作深翻，將會(huì)在穩(wěn)定土壤生態(tài)系統(tǒng)和控制土地退化等方面發(fā)揮重要作用。

表4 對(duì)照地土壤細(xì)菌群落與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)系數(shù)

3.2 土壤細(xì)菌群落組成變化

根據(jù)表1的結(jié)果，煤矸石充填復(fù)墾對(duì)OTUs、細(xì)菌群落豐富度(ACE和Chao1)和多樣性(Shannon)指數(shù)有顯著影響(P<0.05)。在本研究中，煤矸石充填復(fù)墾后的總OTUs和細(xì)菌多樣性指數(shù)(包括ACE，Chao和Shannon)在SL層均增加，但在DL層出現(xiàn)顯著降低。SL層中由于較高的灌水量和施肥量，促進(jìn)了土壤細(xì)菌的生長(zhǎng)。此外作物種植也會(huì)為土壤細(xì)菌提供更多生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)成分，與前人研究[29-30,36]一致。但由于煤矸石充填質(zhì)量差，營(yíng)養(yǎng)成分缺失，在DL層復(fù)墾地的土壤多樣性和豐富度驟減。另外，整體上G的土壤細(xì)菌群落多樣性是低于CK的，究其原因可能是：一方面，由于煤矸石充填造成土壤肥力下降，影響了有機(jī)質(zhì)和礦物質(zhì)的分解，抑制了細(xì)菌生長(zhǎng)和繁殖[31-32]；另一方面，由于研究區(qū)屬于高潛水位采煤塌陷地，復(fù)墾時(shí)間也較長(zhǎng)，研究區(qū)存在一定鹽漬化威脅，且土壤普遍呈堿性，在一定程度上抑制了細(xì)菌活性，導(dǎo)致復(fù)墾地土壤細(xì)菌群落多樣性較低[37]。

變形菌門、放線菌門和酸桿菌門是研究區(qū)內(nèi)最具優(yōu)勢(shì)的門，這與前人研究一致[38-39]，說(shuō)明這些門并不是某一區(qū)域特有，不同區(qū)域相對(duì)豐度不同。在G中觀察到放線菌隨土層深度增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。LI等[40]在研究礦區(qū)重金屬污染環(huán)境時(shí)得出放線菌適合在低營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中生長(zhǎng)。而酸桿菌的相對(duì)豐度隨土層深度下降而降低，在G的DL層觀察到的相對(duì)豐度平均值僅有0.7%。這與煤矸石充填質(zhì)量差，且研究區(qū)土壤偏堿性，土壤結(jié)構(gòu)被破壞，進(jìn)而影響了酸桿菌的生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)[41]。另外，由于煤矸石填充所造成的土層擾動(dòng)，也令酸桿菌在各個(gè)土層的分布遠(yuǎn)不及普通耕地平穩(wěn)[30]。在G和CK的各層均觀察到較高的變形菌門相對(duì)豐度。據(jù)研究，變形菌在草地[37]、森林[38]和牧場(chǎng)土壤[42]的細(xì)菌群落中占主導(dǎo)地位，近年來(lái)，變形菌在礦區(qū)中也被判斷為優(yōu)勢(shì)菌[38-39]。此外，由于煤矸石充填影響土壤結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和營(yíng)養(yǎng)輸送，復(fù)墾土壤中細(xì)菌間的競(jìng)爭(zhēng)壓力增大，所以G的優(yōu)勢(shì)菌門在DL層相對(duì)豐度遠(yuǎn)低于其他土層。

3.3 土壤理化性質(zhì)與土壤細(xì)菌群落關(guān)系變化

CCA(圖4)和Pearson相關(guān)系數(shù)(表3，4)顯示了土壤細(xì)菌群落與土壤理化性質(zhì)之間的關(guān)系。在本研究中，pH是影響復(fù)墾地與對(duì)照地土壤細(xì)菌群落的主要因素。因?yàn)楦邼撍惶赜械乃翖l件導(dǎo)致土壤存在鹽漬化風(fēng)險(xiǎn)，尤其是研究區(qū)的復(fù)墾地中充填的煤矸石中又含有大量的碳酸鹽礦物，碳酸鹽礦物溶解后溶液導(dǎo)致土壤呈弱堿性，pH過(guò)高，將破壞土壤結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致土壤通氣狀況變差，間接影響土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化及其有效性[43]。通過(guò)圖4可以看出，在煤矸石充填復(fù)墾地中，MoiC和SOC是影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要理化性質(zhì)。已有研究證明煤矸石結(jié)構(gòu)性差，大孔隙多，毛細(xì)孔隙少，土壤保水能力差[44]。而煤矸石充填復(fù)墾土壤會(huì)影響含水量的下滲速率，抑制細(xì)菌等微生物活躍度，進(jìn)而影響細(xì)菌群落相對(duì)豐度穩(wěn)定性[32]。研究發(fā)現(xiàn)，煤矸石充填復(fù)墾地的SOC是細(xì)菌群落能量和營(yíng)養(yǎng)物的穩(wěn)定來(lái)源，細(xì)菌分解代謝速率與SOC含量相關(guān)。尹寧寧等[45]在研究礦區(qū)SOC與土壤微生物功能多樣性之間關(guān)系時(shí)也有同樣的結(jié)論。另外，AP和AK是影響對(duì)照地土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要理化性質(zhì)。長(zhǎng)期施肥效應(yīng)對(duì)細(xì)菌群落的影響不容忽視，AP的施用能增加土壤細(xì)菌多樣性以及各細(xì)菌物種在群落中分布的均勻性[46]。而鉀肥的生物可用性一直被認(rèn)為是調(diào)節(jié)農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)量的關(guān)鍵因素，PENG等[47]的研究中發(fā)現(xiàn)AK是影響油菜籽根際微生物群落的重要因子。也有研究認(rèn)為AK含量與農(nóng)田黑土細(xì)菌各細(xì)菌群落生物量呈高度正相關(guān)[48]。

根據(jù)Pearson相關(guān)分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)變形菌門與AP存在顯著相關(guān)性(P<0.05)，說(shuō)明變形菌門具有嗜營(yíng)養(yǎng)的特點(diǎn)[10]。芽單胞菌門具有抗極端環(huán)境條件和清除土壤中重金屬的能力，能適應(yīng)堿性土壤環(huán)境，與復(fù)墾地pH呈正相關(guān)[30]。而擬桿菌門因?yàn)椴荒苓m應(yīng)堿性環(huán)境與pH呈負(fù)相關(guān)[49]。另外，MoiC與復(fù)墾地中變形菌門、酸桿菌門、綠彎菌門等優(yōu)勢(shì)菌門的相對(duì)豐度均呈顯著正相關(guān)，這與煤矸石填充土壤保水能力差，影響細(xì)菌群落生長(zhǎng)繁殖有關(guān)[44]。此外，優(yōu)勢(shì)菌門僅與部分理化性質(zhì)顯著相關(guān)(P<0.05)，放線菌門、酸桿菌門、綠彎菌門、厚壁菌門對(duì)大多數(shù)土壤理化性質(zhì)的變化無(wú)明顯響應(yīng)。

4 結(jié) 論

(1)由于受煤矸石自身特性及高潛水位特有的水土條件影響，煤矸石充填復(fù)墾地的土壤細(xì)菌群落多樣性與豐富度低于普通耕地，且隨土層深度增加呈顯著下降趨勢(shì)，40～60 cm土層細(xì)菌群落多樣性與豐富度明顯低于其他土層。

(2)煤矸石充填復(fù)墾地土壤細(xì)菌群落組成與普通耕地有很高的相似性，在不同土層深度下，土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化主要體現(xiàn)在優(yōu)勢(shì)菌群落比例的變化。在所有的處理中，優(yōu)勢(shì)菌門是變形菌門、放線菌門和酸桿菌門。與對(duì)照地相比，復(fù)墾地表層的優(yōu)勢(shì)菌相對(duì)豐度較高，但經(jīng)過(guò)煤矸石充填復(fù)墾工程擾動(dòng)后，土壤生態(tài)環(huán)境受到嚴(yán)重影響，尤其在40～60 cm層，細(xì)菌等微生物難以在煤矸石層正常生長(zhǎng)，細(xì)菌群落組成差異變大。

(3)煤矸石充填復(fù)墾顯著改變了研究區(qū)土壤理化性質(zhì)，不同土層深度下土壤理化性質(zhì)變化趨勢(shì)差異明顯。相關(guān)性分析表明，pH，MoiC，SOC，AP和AK是影響土壤細(xì)菌群落組成的主要土壤理化性質(zhì)。但部分優(yōu)勢(shì)菌門對(duì)理化性質(zhì)的響應(yīng)并不明顯，可能與土壤微生物群落的高度復(fù)雜性及該區(qū)域條件的特殊性等多方面因素相關(guān)。